Obtencin de rganos linfoides
Objetivo Realizar la diseccin de un ratn para identificar
diversos rganos linfoides y hematopoyticos, tales como el bazo,
timo y huesos largos (mdula sea), as como extirparlos y hacer una
suspensin de las clulas en buffer fisiolgico y contar las clulas
mononucleares al microscopio
Fundamento Para optimizar la activacin de las respuesta inmunes
especficas son necesarias las interacciones entre las clulas
linfoides, fagocitos mononucleares y otras clulas accesorias. Es
indispensable que estn localizadas y anatmicamente concentradas en
rganos o tejidos definidos, los cuales son los sitios en donde los
antgenos son transportados. Tal compartamentalizacin no es fija y
la mayora de los linfocitos recirculan y constantemente se
intercambian entre la circulacin y los tejidos.
Procedimiento Sacrificio del animal Sostener al ratn por la cola
y de manera preferente colocarlo sobre una superficie rugosa (una
malla metlica de caja de ratn seria lo ideal) para que las patitas
no patinen en la mesa de trabajo. Para sacrificar al ratn mediante
dislocacin cervical, se asegura la cabeza del ratn agarrandolo con
los dedos pulgar e ndice de la mano izquierda una buena porcin de
doblez de piel exactamente detrs de las orejas y sintiendo el crneo
apretado contra una superficie plana.
Cont. Inmediatamente, se jala de manera decidida y fuerte, la
cola del ratn para provocar la dislocacin cervical, es decir la
separacin de la cabeza del resto del cuerpo. Debe orse y sentirse
la separacin de los huesos del cuello y sentirse la cabeza floja.
Este procedimiento es el ms aceptado ticamente para sacrificar un
ratn, ya que es el que provoca menos dolor y sufrimiento del
animal. La dislocacin desconecta el sistema nervioso central del
resto del cuerpo y el animal ya no puede experimentar dolor.
BAZO rgano de color rojo oscuro y alargado Con ayuda de las
pinzas y las tijeras se extirpa y se coloca sobre una caja de Petri
que contenga de 5-10 mi de PBS. A fin de hacer una suspensin de
clulas, se disgrega el tejido presionndolo contra una malla metlica
con ayuda de la parte trasera del mbolo de una jeringa de plstico o
cualquier otro objeto similar. Una vez que las clulas de bazo estn
disgregadas y quede un tejido fibroso de color claro (tejido
conectivo que deber desecharse), se recolecta. el sobrenadante con
ayuda de una pipeta y se transfiere el sobrenadante a un tubo
limpio. Se enjuaga bien la caja de Petri con PBS y se recolecta
este volumen en el mismo tubo. Marque el tubo con "b" de "bazo" y
el nmero de equipo.
TIMO Descubrir la porcin superior del trax del ratn con las
tijeras y las pinzas y hacer un corte de las costillas para hacer
visible el corazn. Localizar el timo justamente arriba del corazn,
como un rgano blanquecino bilobular. Extirpar el timo evitando
obtener sangre (evite daar el corazn) y colocarlo sobre una caja de
Petri limpia que contenga 5-10 mi de PBS y obtener una suspensin
celular en la misma forma que lo hizo con el bazo. Marcar el timo
con ''t'' y nmero de equipo. Conservar el tubo en un vaso con hielo
y proceder a la obtencin de mdula sea.
Medula sea A fn de obtener algn hueso largo, tal como el fmur,
hacer un corte de la piel a nivel del muslo y descubrir el hueso
con ayuda de las pinzas y las tijeras. Desprender el msculo
adherido al fmur, "raspando" el hueso con las tijeras, para dejarlo
totalmente al descubierto y cortar con las tijeras a nivel de la
rtula y la unin con el hueso sacro. Tomar el fmur con las pinzas y
con la ayuda de las tijeras, cortar los extremos del fmur e
inyectar con una jeringa de insulina por uno de los extremos, un
volumen de 1 mi con el fn de expulsar mecnicamente. el tejido
intemo del fmur (mdula sea), directamente en un tubo. Repetir el
procedimiento con otro ml de buffer.Se recomienda que la suspensin
celular se haga pasar por la jeringa varias veces (3) a fn de
dispersar los posibles agregados celulares. Transferir con pipeta
Pasteur la suspensin de clulas de mdula sea a un tercer tubo limpio
y marcarlo con "mo" y su nmero de equipo.
a) c)
b)
Figura 2. rganos linfoides; a) Fmur de rata b) Timo c) Bazo
CUENTA CELULAR Lavar las clulas, para lo cual aadir suficiente
PBS hasta cerca de la boca del tubo (sin desbordar) en los 3 tubos
(b, t Y mo) y centrifugar a 1,500 rpm x 10 min Descartar el
sobrenadante mediante decantacin y desecharlo. Inmediatamente
resuspender el paquete celular del fondo del tubo, mediante golpes
al fondo del tubo hasta dispersar el paquete celular y aadir
exactamente 10 ml de PBS. Hacer una dilucin 1:10 con solucin de
azul tripn (0.1 ml de la suspensin celular correspondiente ms 0.8
ml de PBS y 0.1 ml de azul tripn) y cuente las clulas nucleadas
viables con objetivo de 40x. Si el campo del microscopio est muy
denso en clulas, puede probar una dilucin 1 :20 (0.1 mi de clulas +
1.8 mi de PBS y 0.1 de azul de tripn). Obtener la concentracin
celular en cada tubo (Nmero de clulas por mi) y el nmero total de
clulas obtenido de cada rgano
Tincin Preparar un frotis con cada una de las suspensiones en
portaobjetos limpios, colocando una gota pequea de la suspensin en
un extremo del portaobjetos y dispersar la gota con ayuda de una
pipeta pasteur para formar un pelcula delgada del lquido. Esperar a
que sequen. Cubrir el frotis seco con el colorante de Wright por 5
a 7 min, y cubrir con PBS pH 6.4 durante 3 min Lavar con un chorro
fino de agua de la llave en forma muy suave. Secar la laminilla,
colocar un cubreobjetos y una pequea gota de aceite y observar al
microscopio con el objetivo de inmersin (100x). Dibujar las
morfologa de las clulas teidas de cada tejido.
