OBTENCION E IDENTIFICACION DE CROMOSOMAS PAQUITENICOS EN GRILLO COMUN (Acheta sp)

I. OBJETIVOS

Anlisis de la estructura del cromosoma paquitenicos. Determinar el patrn de cromomeros.

II. MATERIALES Y METODOSLos grillos comunes fueron recolectados en la Universidad Nacional Agraria La Molina (UNALM). La identificacin de los individuos machos se realiz tomando en cuenta que las hembras tienen normalmente un color ms oscuro; adems presentan un apndice en el extremo del abdomen. Ambos sexos presentan adems dos cercos (apndices segmentados que aparentan colas en la regin dorsal terminal del abdomen.Para la preparacin de los cromosomas se us como muestra tejido gonadal; ya que en este tejido se encuentran las clulas en divisin meioticas. El procedimiento realizado se resume en la siguiente tabla: TABLA ITIEMPO (minutos)PROCESOSOLUCIONDESCRIPCION

EXTRACCIONDiseccin del grillo. Extraccin de las gnadas (testculos).

10DISGREGACIONSolucin SalinaObtencin de los tubos seminferos procurando disgregar lo ms posible.

30FIJACIONCarnoySe recomienda enjuagar en agua destilada pasado el tiempo de fijacin.

10TargaAblandamiento de la muestra.

PREPARACION DE LAS LAMINASSe coloca uno o tres tbulos seminfero y se corta en tres pedazos c/u.

15TINCIONOrceina actica 2%Pasado los 15 min se procede con la tcnica de squash.

III. RESULTADOSN CromosomaN CROMOMEROSN PROMEDIO CROMOMEROSTAMAO RELATIVODESCRIPCION

CAMPO

12345

1-PEQUEOIntensamente teido. Se aprecia similar a un cuerpo de ADN extracromosomico como el que se describe para cromosomas paquitenicos en oocitos.

2272922282626.5GRANDECromosoma autosomico mas grande. Presencia de 2 cromomeros mayores en el lado derecho (de acuerdo a la Fig)

3222318222321.25MEDIO Presenta 2 cromomeros grandes en el lado derecho, un cromomero de similar tamao en la posicion media cercana al centromero y un cromomero en la terminacion izquierda (Ver Fig)

4202217121917.75MEDIO Se observan dos cromomeros de mayor tamao uno ubicado en la pocision central y otro en la region terminal izquierda. La mayor concentracion de cromomeros se ubica en el lado izquierdo (Ver Fig.)

5202312101416.25MEDIOLa mayor concentracion de cromomeros se presenta en el lado derecho. El cromomero mas fuertemente teido se ubica en la region central del cromosoma (Ver Fig.)

6181514121014.75MEDIOUn cromomero teido con mayor intensidad ubicado en la region terminal izquierda. Junto a este cromosoma en el campo 1 puede observarse una macula teida fuertemente. (Ver Fig.)

71714812912.75PEQUEOMayor concentracion de los cromomeros en la region derecha.

816151212813.75PEQUEOLa ubicacin de los cromomeros es uniforme a lo largo del cromosoma.

913141414713.75PEQUEOLa mayor concentracion de cromosomas se da en la region central.

1012121012711.5PEQUEODisposicin uniforme de los cromomeros.

1111126869.25PEQUEOLos cromomeros pueden ser apreciados con mayor facilidad ya que se encuentran fuertemente teidos.

TOTAL176179133142129157.5

En los campos fotografiados se presentan los 10 cromosomas autosmicos y el cromosoma sexual en paquiteno, en dos estadios diferentes: paquiteno temprano (Ver Fig. 2) y paquiteno tardo (Ver Fig. 3). Tambien se presentan los cariogramas respectivos, donde los cromosomas fueron ordenados de acuerdo al tamao relativo entre ellos, excepto el cromosoma sexual X el cual fue numerado en los cariogramas con el numero 1 (Ver Fig. 4 y Fig. 5). Esta ubicacin (numeracin) del cromosoma sexual puede permitir comparaciones con el complemento de muestras de oocitos; en los cuales el cromosoma sexual es el de mayor tamao y por lo tanto su ubicacin en la posicin 1 de los cariogramas (A. LIMA-DE-FARIA et al 1972). Por otro lado la numeracin de los cromosomas autosmicos tanto en los cariogramas presentados como en la tabla de conteo de cromomeros (Ver Tabla II) se establecio de acuerdo al tamao de mayor a menor en orden correlativo de 2 a 11.

IV. ANALISIS DE RESULTADOSLa constatacin del nmero cromosmico observado en los campos estudiados es de 2n=21, tal como se describe en la bibliografa utilizada (NILSSON 1968). La determinacin sexual en Acheta es XX/XO como lo determinaron estudios realizados por NILSSON et al en 1968; esta aseveracin tambin pudo ser confirmada; ya que, el cromosoma sexual en espermatocitos tiene la apariencia de un cuerpo de ADN (similar a al observado en los cromosomas 6 y 11 de oocitos). Dicho cromosoma sexual est presente en el complemento en ciertos campos observados, en contraste tambin se observaron complementos (ncleos) en los cuales no estaba presente el cromosoma sexual; proponindose que dichos espermatocitos no portaban el cromosoma sexual X.La observacin del cromosoma sexual X, el cual pudiera confundirse con un cuerpo de DNA como el descrito para el complemento paquitenico en muestras de oocitos de Acheta (LIMA-DE-FARIA et al 1972); sin embargo, es pertinente considerar que el cuerpo de ADN est ausente en el complemento paquitenico en espermatocitos. Adems el cromosoma sexual X en oocitos de Acheta alcanza un menor grado de compactacin, siendo el cromosoma de mayor longitud en el complemento paquitenico de oocitos (LIMA-DE-FARIA et al 1972).Es posible una clasificacin de los cromosomas autosmicos basndonos en el tamao y patrn cromomerico. Los cromosomas autosmicos del complemento se clasifican, de acuerdo al tamao, en: un cromosoma de mayor longitud (cromosoma 2); 4 cromosomas de tamao medio (cromosoma 3-6) y 5 cromosomas pequeos (cromosomas 7-11). La descripcin de cada cromosoma, el nmero de cromomeros por cromosoma (en cada campo estudiado); as como el numero promedio de cromomeros se resume en la Tabla II.

V. DISCUSINLos cromomeros estructuralmente son regiones de DNA espiralizado (GALL 1958) adems contienen copias de ADN amplificado. La estructura de un cromomero individualmente consiste de una regin central (core) de ADN rodeado por una regin externa rica en RNA, lo cual indica un papel funcional de estas molculas de RNA en cromosomas paquitenicos. Los cromosomas del complemento se pueden caracterizar, adems de por el tamao, por su patrn cromomerico; los cromomeros estn presentes en diferente cantidad en los cromosomas. Adems de variar en tamao entre los distintos cromomeros en un cromosoma, tambin un mismo cromomero puede variar dependiendo el estadio de desarrollo en el que se encuentre el espermatocito. Esta afirmacin puede ser apreciada en los campos presentados (Ver Fig 2 y Fig 3) pertenecientes a paquiteno temprano y paquiteno tardo. Las copias de ADN presentes en los cromomeros son liberados conforme se avanza a lo largo de la profase. Es de este modo que se aprecia una disminucin en el tamao de ciertos cromomeros si contrastamos los campos donde el espermatocito se encuentra en paquiteno temprano y los que se encuentran en paquiteno tardo. Es lgico suponer adems que la perdida (liberacin) de copias de ADN tambin afecte (disminuya) la cantidad de ADN, hecho que fue demostrado por experimentos que demostraron que el nmero de pares de nucletidos disminuye conforme se avanza a lo largo de paquiteno. Es pertinente sealar tambin que no todos los cromomeros varan su tamao a lo largo de la profase, es decir, algunos cromomeros no liberan copias de ADN. Este es uno de los resultados que se esperaban observar, puesto que esta observacin tiene asidero sobre la evidencia de que los cromomeros liberan el ADN amplificado, el cual puede pertenecer a cistrones de RNA ribosomal 18S y 28S o a otros genes, en diferentes estadios (Birnstiel 1971).Tambin debemos de mencionar sobre las asinapsis observada en algunos cromosomas, que vendra a ser la falta de apareamiento meiotico entre cromosomas homlogos y resulta obvio que imposibilita que se produzca el sobrecruzamiento. La asinapsis observada es de tipo parcial, es decir que afecta a solo algunos pares homlogos. A veces la expresin fenotpica de tales mutaciones asinapticas muestra penetracin incompleta; es decir que pueden manifestarse de forma distinta en los meiocitos de un mismo individuo, es por eso tambin que en los resultados no se apreciaron en todos los cromosomas y no siempre se repetan en las placas.( Lacadena 1996)Se presenciaron los nudos paquitenicos en algunos cromosomas, (los nudos paquitenicos (knobs) conformada por heterocromatina constitutiva), de aqu que se le compare con las bandas c heterocromatica, los knobs vendran a ser el resultado de una renaturalizacion muy rpida de ADN satlite tras la desnaturalizacin; los knobs presentes varan en nmero segn las poblaciones. Es justamente por esta caracterstica estructural que nos sirve para dilucidar las relaciones entre diferentes poblaciones. Muchos estudios sobre la distribucin y frecuencia de nudos paquitenicos (knobs) en muchos organismos, han mostrado que estn estrechamente relacionados con variables ambientales (Jones, 1995; Bennett and Leitch, 1995).Todas estas caractersticas anteriormente mencionadas, evidencias que diferentes estructuras no solo cumplen una funcin determinada en la segregacin o en la forma del cromosoma, sino que tambin tienen implicancias fenotpicas.

VI. BIBLIOGRAFIA

BIRNSTIEL, M. L., CHIPCHASE, M. and SPEIRS, J. 1971. The ribosomal RNA cistrons. - Progr. Nucl. Arid Res. Mol. Biol. 11: 351-389. GALL, J. G. 1968. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian o8genesis. Jones, R. N. 1991. B-chromosome drive. The American Naturalist137(3):430-442. Jones, R.N., 1995. Tansley Review No. 85. B chromosome in plants. New Phytology 131 :411-434. LIMA-DE-FARIA, A., BIRNSTIEL, M. and JAWORSKA. H. 1969. Amplification of ribosomal cistrons in the hetero-chromatin of Acheta- Genetics. Juan Ramn LACADENA - 1996 - Science- La cadena- pag: 289. Robert L., Nussbaum; Roderick R. McInnes; Huntington F. Willard (2008). Captulo 2: El genoma humano y las bases cromosmicas de la herencia. Thompson & Thompson. Gentica en Medicina (7 edicin). Barcelona: Elsevier Masson. pp. 16, 18. Porter, H.L. and A.L. Raybum. 1990. B-chromosome and C-band heterochromatin variation in Arizona maize populations adapted to different altitudes. Genome 33: 659-662.