Optimizacion del analisis de PAHs con el nuevo

GCMSMS 7000C de Agilent

Usando la nueva fuente autolimpieza

1

José Juan Rivero Marabé

Especialista de producto GC y GCMS

Agilent Technologies, Spain

18 Octubre de 2013

Situación actual en el análisis alimentario y medioambiental

El reto analítico:

Documento SANCO

Nuevas directrices de la comision Europea

Establecer un sistema armonizado y “cost-effective” de

aseguramiento de la calidad en la UE

Asegurar la calidad y comparabilidad de los resultados

analíticos

Asegurar una aceptable exactitud de los resultados

analíticos

Asegurar la ausencia de falsos positivos/negativos en los

reports

Servir de apoyo para la acreditación ISO 17025

Documento SANCO12495/2011

El documento es integral y complementario a los

requisitos de 17025 Inicialmente está dirigido a los laboratorios de control oficial pero se ha popularizado a todos

laboratorios de analisis de residuos

Estrategias en el análisis de trazas de residuos en

alimentación

Superar las limitaciones actuales de muchas metodologías (FDA/EPA/EU) con los últimos

desarrollos en GC/MS/MS:

Mayor productividad, sensibilidad y calidad de resultados INCLUSO ENTRE MATRICES

Extender la aplicación de los análisis multiresiduos a compuestos más polares mediante

LC/MS/MS:

Mayor robustez, sensibilidad y productividad con LC/MS/MS

Desarrollo de estrategias eficaces para determinacion de residuos no target o desconocidos

mediante análisis por GC/Q-TOF y LC/Q-TOF

Cuantificación, identificación y confirmación simultáneas

Aumentar el número de residuos analizados más allá de los conocidos.

Aumentar la productividad con un software MS intuitivo y potente

Revisión rápida de resultados e informes: más datos con menos recursos

Cumplimiento de las normativas Comunitaritas e Internacionales

Portfolio de Agilent en GC/MS

PRECIO

RE

ND

IMIE

NT

O

240 IT

7000C TQ

5977A SQ 7890BGC

5977E SQ 7820 GC

GC Q-TOF

5975T SQ

Full Scan/SIM

MS/MS

MS/MS masa exacta

Nuevo Agilent 7000C

GC/MS/MS Triple Cuadrupolo

Innovación en GC/MS.

Agilent 7000C Triple

Cuadrupolo

Mejoras respecto

version B

Claves del diseño del GC-MS/MS Lineal

Inerte, fuente de

alta temperatura

(Igual que 5977)

Detector de Triple eje (igual

que 5977)

Dos cuadrupolos de cuarzo,

monolitico, hipoerbólico

recubierto de oro

(igual que 5977)

Nuevo desarrollo, Celda de

colisión hexapolar patentada

Bomba Turbo Edwards

El nuevo perfil térmico de la fuente junto con la lente extractor

aumenta la transmision de iones hacia el cuadrupolo

aumentando la intensidad de los iones precursores

Rendimiento de la nueva Fuente Inerte Extractor

Actualmente hay varios miles de fuentes de este tipo en el mercado

El diseño de la fuente – sin

recubrimientos - la mantiene limpia

por más tiempo, aumentando el

tiempo entre mantenimientos

7000C: Precision, Precision, Precision

Dwell Time (msec) 10 5 3 2 1

# Transitions 18 33 50 66 99

Cycle Time 198 198 200 198 198

MRM/sec 91 167 250 333 500

n=1 37453 39629 38589 37722 36246

2 37854 38444 35487 34584 34524

3 36464 39402 37690 35916 35007

4 38547 37270 35756 36243 33895

5 38372 38376 37277 37373 36955

6 36349 37881 38076 38625 33315

7 39439 32900 36179 38984 34861

8 37654 37787 37455 38018 37986

9 37588 38620 40348 34537 34307

10 37140 36425 37795 36869 34700

Average Area 37686 37673 37465 36887 35180

SD Area 940 1925 1439 1557 1447

% RSD 2.5% 5.1% 3.8% 4.2% 4.1%

para 10ppb propyzamide

Mayor precisión,

igual o mejor

confirmación

cualitativa

7000C: Precision, Precision, Precision

Dwell Time (msec) 10 5 3 2 1

# Transitions 18 33 50 66 99

Cycle Time 198 198 200 198 198

MRM/sec 91 167 250 333 500

n=1 37453 39629 38589 37722 36246

2 37854 38444 35487 34584 34524

3 36464 39402 37690 35916 35007

4 38547 37270 35756 36243 33895

5 38372 38376 37277 37373 36955

6 36349 37881 38076 38625 33315

7 39439 32900 36179 38984 34861

8 37654 37787 37455 38018 37986

9 37588 38620 40348 34537 34307

10 37140 36425 37795 36869 34700

Average Area 37686 37673 37465 36887 35180

SD Area 940 1925 1439 1557 1447

% RSD 2.5% 5.1% 3.8% 4.2% 4.1%

for 10ppb propyzamide

Mayor precisión,

igual o mejor

confirmación

cualitativa

Agilent 7000C estabilidad de ratios de iones

Variabilidad entre diferentes matrices

MS/MS your way, the best way

Seamless MRM

method

optimization

Ease of use

Efficiency

• Nueva optimizacion de los MRM permitiendo la

maximizacion de los dwell time para aumentar la

sensibilidad

• El ajuste en la lista de compuesto Compound based

adjustment of the optimization is possible, unique to

Agilent

• Comunicación directa entre el método de

adquisicióny el programa de optimizacion MRM

Antiguo asistente de lista de compuestos

Maximizacion Dwell Time Usando Tiempo de ciclo

Agilent 7000C Triple Quadrupole GC/MS

Especificaciones

Parámetros Especificaciones Agilent 7000C

EI MRM Sensibilidad (*)

EI Scan Sensibilidad (*)

100 fg OFN > 7000:1 RMS S/N, 272 → 241.

1 pg OFN scan desde 50 a 300 amu para ion 272 > 500:1 S/N

Resolución de masas Unidad de masas ajustable por tune, 0.7 a 4Daltons

MRM Velocidad de scan (transitions/sec)

Minimo dwell time en MRM

500

1 ms

Rango dinámico 106

Celda de colisión Hexapolo lineal con aceleración lineal

(*) Demostrado en cliente

IDL < 4 fg (**)

10fg inyectados

(**) Demostrado en cliente con inyector automático

IUPAC Gold Book

http://goldbook.iupac.org/L03540.html

USP United States

Pharmacopeia 30

UE Method Validation And

Quality Control Procedures For Pesticide

Residues Analysis In Food And Feed. Document No.

Sanco/10684/2009

EPA Analytical Detection Limit

Guidance, 1996 Laboratory Guide for Determining Method

Detection Limits

Limite de detección Instrumental (IDL)

Exactitud Precisión

IDL especifación basada en la reprodubilidad de la medida

8 ínyecciones consecutivas, 1 μl, 10fg/μl OFN

MS/MS transition of m/z 272→222

Area precision: 2 .0 % RSD

IDLconc = (t * RSD * concentration)/100 (t para el 99% de confianza, n-1 grados de libertad=2.988)

IDLconc = 1,5 fg

Caso reciente de 1ª instalación del 7000C en España

IDL < 4 fg

Agilent introduce el modulo programable para ahorro de He Ayuda ha corregir sus problemas relacionados con el gasto de He

Combinado con las caracteristicas Sleep-Wake del 7890B

Automaticamente cambia el carrier gas para suministrar N2 durante el

tiempo de espera del GC

Dos componentes críticos

• Modulo EPC de cambio de gas portador

• Caracteristica Sleep/Wake 7890B

Más …

• Gas N2 de grado cromatográfico

Modulo EPC para cambio de gas portador Asegura la continuidad de su negocio

To Inlet EPCs Purge

He in

N2 in

Flow channel inside

the bridge block

Std. Aux EPC

• 5a generación EPC

• Control totalmente integrado

en el Software Agilent

• Canal purgado para prevenir

contraminación cruzada de

gases

• Control preciso de la presión

para entre las balas y el GC

• En modo desatendido,

cambia entre gases

portadores entre 15-30 min

para la mayoría de los

detectores

¿Como funciona? Modo ahorro de Helio (Nitrogeno Carrier, o Modo Sleep)

Bridge Block

To GC Inlet

EPC

AUX EPC 1

Nitrogen

70 psig

AUX EPC 3

Purge Vent

10 psig

AUX EPC 2

Helium

0 psig

Helium OFF, Nitrogen ON at 70 psig

¿Como funciona? Modo ahorro de Helio (Nitrogeno Carrier, o Modo Sleep)

Bridge Block

To GC Inlet

EPC

AUX EPC 1

Nitrogen

70 psig

AUX EPC 3

Purge Vent

10 psig

AUX EPC 2

Helium

0 psig

24.2 mL/min N2

(< 0.2 mL/min)

He 25.2 mL/min N2

1.0 mL/min (out)

Helium OFF, Nitrogen ON at 70 psig

¿Como funciona? Modo ahorro de Helio (Helio Carrier, o Modo Wake)

Bridge Block

To GC Inlet

EPC

AUX EPC 1

Nitrogen

70 psig

AUX EPC 3

Purge Vent

10 psig

AUX EPC 2

Helium

0 psig

Helio ON a 80 psig, Nitrogeno OFF

GC/FID Wake Method: 15-30 Min

GC/MS Wake Method: 15-30 Min

Alguno otro detector puede necesitar más tiempo

To GC Inlet

EPC

AUX EPC 1

Nitrogen

0 psig

AUX EPC 3

Purge

1.0 psig

AUX EPC 2

Helium

80 psig

24.2 mL/min He

(< 0.2 mL/min) N2 25.2 mL/min He

1 mL/min (out)

Bridge Block

Helio ON a 80 psig, Nitrogeno OFF

¿Como funciona? Modo ahorro de Helio (Helio Carrier, o Modo Wake)

Como funciona: Configurando Modos Sleep/Wake Sencillo de programar

Funcionamiento: Sin cambios en cromatograma despues

del modo sleep N2 Carrier. GC/FID Analysis

Dia 1 – Run Original con He

Dia 2 – Primera inyeccion con He despues de toda la noche con N2 en metodo Sleep

Dia 3 – Primera inyeccion con He despues de toda la noche con N2 en metodo Sleep

14 16 18 20 22 24 Min.

Funcionamiento: Sin cambios en cromatograma despues

del modo sleep N2 Carrier. GC/FID Analysis

Dia 1 – Run Original con He

Dia 2 – Primera inyeccion con He despues de toda la noche con N2 en metodo Sleep

Dia 3 – Primera inyeccion con He despues de toda la noche con N2 en metodo Sleep

14 16 18 20 22 24 Min.

Funcionamiento: Pasa el MS Tune 15min despues

de cambiar de N2 a He. GC/MSD

5000

50000

500000

5000000

0 5 10 15 20

Co

un

ts

Time (min)

Nitrogen Background

5 mL/min He

2 mL/min He

Counts of Nitrogen Ion

Time (min) 5 mL/min He

Relative to

Saturation 2 mL/min He

Relative to

Saturation

3 1735168 20.69% 8388096 100.00%

4 1033280 12.32% 4959232 59.12%

5 590080 7.03% 1618944 19.30%

6 354112 4.22% 722944 8.62%

7 228480 2.72% 333696 3.98%

10 56984 0.68% 102576 1.22%

15 9052 0.11% 17080 0.20%

• Permite facil mantenimiento y transferencia de metodos Fácil comparación de datos entre ECD, MSD, MS/MS …

Retention Time Locking

• Inyección de grandes volumenes ( LVI ) para mejora de detección de trazas, el inyector añade flexibidad de modos de inyección, split/splitless en frio, capacidad de solvent vent.

Multimode inlet (MMI)

• Tiempos mas cortos de analisis, tiempos de retención y espectros más consistentes, mayor tiempode vida de la columna, menos frecuente limpieza de la fuente.

Capillary Flow Technology (CFT) y

backflush

• Base de datos MRM completa y optimizada para cientos de compuestos y listo para ser utilizados

MS/MS MRM Database

• Usando la nueva EPC y nuevo diseño de linea de transferencia y fuente Fuente autolimpieza

Técnicas básicas para los analizadores GCMSMS

Análisis de PAHs Usando la nueva fuente de

autolimpieza en el

GCMSMS Agilent 7000C

Hidrocarburos Policiclicos Aromaticos, PAHs Trazadores de contaminacion en alimentacion y el medioambiente

Contaminantes Organicos en alimentos y muestras medioambientales

– Mariscos, pescados, Aire, Aguas y Suelos

Las fuentes puden provenir

– Petróleogenico– Derivado del petroleo asociado a combustibles fósiles

– Pirogenico– Derivado de fuentes de combustion

– Biogenico – Formado en procesos biológicos naturales

Toxicos para la vida acuaticay bajo sospecha para humanos

Tipicamente analizados por HPLC/Fluo, GC/FID, GC/MS y GC/MS/MS

Supervisado por investigadores medioambientey alimentario

– EPA, CEN, EFSA, NOAA, WHO, AOAC, FDA, USDA

Page 33

Analisis de HPAs usando GC/MS y GC/MS/MS

1. GC/MSD en modo SIM

2. GC/MS/MS en modo MRM

3. Tipica rango de calibración desde 1-1000 pg

4. Tipico valor acetable de linearidad, R2 > 0.99

5. Tipico reproducibilidad del ISTD

a) +/- 20% en calibración

b) +/- 30% to 50% en muestras

Page 34

Analsisi de HPAs: Peculiaridades y Retos

1. Peculiaridades

a) Amplio rango de peso molecular y punto de ebullición

b) Muy pegajosos, superficies no desactivadas

c) Sujetos a desublimacion (deposición)

2. Retos analiticos

a) Dificultad en la vaporizacion and keep from depositing

b) Trabajar a altas temperaturas es crucial

c) Minimizar la superficie de contacto

d) Picos con cola es de dificil integracion y necesita ser manual

e) Respuesta de los ISTD inconsistente a lo largo del rango de calib

f) ESTD linearidad

Page 35

Optimizacion Analizador HPAs

1. Temperatura de inyector de 310-330 oC

2. Liner, 4mm, con lana de vidrio, Agilent p/n 5190-2293

3. Inyeccion en Pulso de 50 psi, Tiempo de Purga de 0.5 -

1.0 min

4. Columna especifica de HPAs, Agilent p/n 122-9632

5. Backflush Post-column

6. Flujo Constante entre 1 y 2 mL/min

7. Temp de la fuente 320-350 oC, Temp Quad >= 180 oC

8. Lente extractora o drawout de 9mm

9. Fuente de autolimpieza

Page 36

Añadiendo Hidrogeno a la fuente

Hidrogeno por la transfer line

Usando la transfer line en el MSD. El Hidrogeno fluye de forma concentrica a la

columna en la zona del volumen iónico.

Repeller

Lente Drawout (o extractor)

Page 37

Limpieza Automatica de la fuente modo Offline

7890B

GC

Limpieza Offline: 0.4 mL/min, Fuente 350C, Filamento On

Autosampler

Column 5977A MSD

o

7000C

MS/MS

S/S inyector

Helio

Modulo de control de limpieza

He Gas portador

0.4 mL/min H2

Fuente

Page 38

Limpieza modo Offline

Al MSD

AUX EPC 1

Hidrogeno

90 psi

AUX EPC 3

Venteo de

purga

1.0 psi

AUX EPC 2

Helio

0 psi

Helio OFF, H2 ON a 90 psi, 0.4 mL/min H2 hacia el MS

0.4 mL/min H2 Restrictor

(< 0.2 mL/min)

He 5.4 mL/min H2

5.0 mL/min

Page 39

Limpieza con H2 baja el ruido en el masas

Page 40

Recuperacion de la sensibilidad (OFN)

4 . 1 0 4 . 1 2 4 . 1 4 4 . 1 6 4 . 1 8 4 . 2 0 4 . 2 2 4 . 2 4 4 . 2 6 4 . 2 8 4 . 3 0 4 . 3 2 4 . 3 4 4 . 3 6 4 . 3 8

1 4 0 0 0 0

1 4 2 0 0 0

1 4 4 0 0 0

1 4 6 0 0 0

1 4 8 0 0 0

1 5 0 0 0 0

1 5 2 0 0 0

1 5 4 0 0 0

1 5 6 0 0 0

1 5 8 0 0 0

1 6 0 0 0 0

1 6 2 0 0 0

1 6 4 0 0 0

1 6 6 0 0 0

1 6 8 0 0 0

1 7 0 0 0 0

1 7 2 0 0 0

1 7 4 0 0 0

1 7 6 0 0 0

1 7 8 0 0 0

T i m e - - >

A b u n d a n c e

I o n 2 4 1 . 0 0 ( 2 4 0 . 7 0 t o 2 4 1 . 7 0 ) : O F N - p r e c o n d - 0 - r e p 0 0 . D \ d a t a . m s

4 . 1 0 4 . 1 2 4 . 1 4 4 . 1 6 4 . 1 8 4 . 2 0 4 . 2 2 4 . 2 4 4 . 2 6 4 . 2 8 4 . 3 0 4 . 3 2 4 . 3 4 4 . 3 6 4 . 3 8

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

3 0 0 0

3 5 0 0

4 0 0 0

4 5 0 0

5 0 0 0

5 5 0 0

6 0 0 0

6 5 0 0

7 0 0 0

7 5 0 0

T im e - - >

A b u n d a n c e

T I C : O F N - p o s t c o n d - 1 - p r e t u n e - r e p 0 2 . D \ d a t a . m s

S:N > 50 pk-pk

> 200 rms

S:N ≈ 1 pk-pk

> 2 rms Fuente muy

sucia antes de

la limpieza

Despues de la

limpieza con

H2

Page 41

HPAs 1000 pg con ISTDs

4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

220000

Time-->

Abundance

T I C : 1 0 0 0 _ 3 4 _ 2 . D \ d a t a . m s

Dibenzo(a,l)pyrene

Page 42

Limpieza Automatica de la fuente modo continuo

Limpieza Continua: 0.075 - 0.2 mL/min durante la adquisición

0.075 – 0.2 mL/min H2

7890B

GC

Autosampler

Column 5977A MSD

o

7000C

MS/MS

S/S inyector

Helio

Modulo de control de limpieza

He Gas portador

Fuente

Limpieza modo Online

To MSD

CI Port

AUX EPC 1

Hidrogeno

22 psi

AUX EPC 3

Venteo de

purga

1.0 psi

AUX EPC 2

Helio

0 psi

He OFF, H2 ON a 22 psi, 0.075 mL/min H2 hacia el MS

0.075 mL/min H2 Restrictor

(< 0.2 mL/min)

He 5.075 mL/min H2

~5.0 mL/min (out)

Page 44

HPAs ISTDs

Perylene-d12

Page 45

4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

55000

60000

65000

70000

75000

80000

Time-->

Abundance

TIC: 1_34_3.D\DATA.MS

9 mm DO, HPAs ISTDs, Cal Rango 0.5-500 pg MS

0,750

0,800

0,850

0,900

0,950

1,000

1,050

1,100

1,150

no

rmalized

resp

on

se

pg inj

30 Mix PAH ISTDs, 9 mm DO With 75 uL/min H2 on SQ

Naphthalene D8

Acenaphthene-d10

Phenanthrene D10

Chrysene-D12

Perylene-d12

H2 continua H2 no añadido

Page 46

500 fg 1-Metil-Pireno:

3 inj. Cada uno separado por 6 Inyecciones

75 uL/min H2 añadido

No H2 añadido

Page 47

500 fg Dibenzo(a,l)pireno:

3 inj. Cada uno separado por 6 Inyecciones

75 uL/min H2 added

No H2 added

Page 48

% RSD del RF, calibrado desde 2.5 a 500 pg. GC-MSD en modo limpieza continuada de la fuente vs no adicion de Hidrogeno

49

Page 49

HPAs en 7000C MS/MS

1000 ppb PAH std, TIC, modo MRM

total area = 29 M counts

6 x10

0

0.5

1

1.5

2

+EI TIC MRM CID@** (** -> **) 20120918_1000-34_v_1-3.D

5 5 6 6 7 7 8 8

Page 50

PAHs en 2 sistemas diferentes 7000C MS/MS, MRM

Page 51

Sistema 1, configuracion estandar

Sistema 2, Analizador de HPAs

Detalle de forma de pico

Page 52

Dibenzo(a,l)pireno, último pico

Analizador HPAs

ISTD respuesta de areasnormalizada al nivel más alto de

calibracion, antes de la optimización

Page 53

Comparacion de los datos ISTD del sistema 7000C en modo de limpieza

continua. La respuesta de los ISTD permanece constante en todo el

rango lineal. Rango Calib 1-1000 pg

Dato

incial

CCM

Dia 1

CCM

Dia 3

CCM

Dia 12

Page 54

Dibenzo(a,l)pireno 1-1000 pg, R2 = 0.9785

Page 55

Tratando de ajustar

a una recta

Dibenzo(a,l)pireno, 1-1000 pg, R2=0.99998

Analizador HPAs en modo limpieza Continua

HPAs en 7000C, valores de R2 de 1-1000 pg, MRM.

Modo de limpieza continua

Valores de R2 para el 5977A en modo SIM con limpeza continua

de fuente revelan identicos datos al 7000C, en el mismo rango

de calibracion 1-1000 pg

Page 57

Continuous Continuous

Initial Data Clean Initial Data Clean

R2 R2 R2 R2

Naphthalene 0.9982 0.9999 2,3-Dimethyl anthracene 0.9648 0.9999

1-Methyl naphthalene 0.9981 1.0000 Fluoranthene 0.9978 0.9999

2-Methyl naphthalene 0.9977 1.0000 9,10 Dimethyl anthracene 0.9726 1.0000

1,2-Dimethyl naphthalene 0.9974 1.0000 Pyrene 0.9846 1.0000

1,6-Dimethyl naphthalene 0.9976 1.0000 1-Methyl pyrene 0.9927 0.9997

Acenaphthylene 0.9975 0.9999 Benz (a) anthracene 0.9976 0.9998

Acenaphthene 0.9983 1.0000 Chrysene 0.9976 0.9999

Fluorene 0.9976 1.0000 6-Methyl chrysene 0.9690 0.9998

Phenanthrene 0.9972 0.9999 Benzo (k) fluoranthene 0.9954 1.0000

Anthracene 0.9959 0.9999 Benzo (a) pyrene 0.9576 1.0000

2-Methyl phenanthrene 0.9846 0.9999 Dibenz (a,h) anthracene 0.9581 0.9999

2-Methyl anthracene 0.9846 0.9999 Indeno (1,2,3-c,d) pyrene 0.9642 0.9999

1-Methyl phenanthrene 0.9969 1.0000 Benzo (ghi) perylene 0.9965 1.0000

3,6-Dimethyl phenanthrene 0.9851 1.0000 Dibenzo (a,l) pyrene 0.9788 1.0000

Resumen: Analizador de HPAs

1. Mejoras del metodo y del sistema:

a) Liner

b) Apropriadas Temperaturas

c) Backflush

d) Lente 9mm drawout o extractor

e) Fuente de autolimpieza

2. Resultados de las propiedades del Analizador:

a) Mejora de la forma de los picos, menor tailing

b) Respuestas Consistentes en los ISTD

c) Mejora en la linearidad de 0.999 - 1.000

d) Mantenida sensibilidad

e) Fuente limpia de forma indefinida

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MUCHAS GRACIAS

por su atención

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