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Mary Luz Yaya, Olga Luca Rodrguez, William Usaqun, Alejandro ChaparroInduccin de organognesis indirecta en Abarco (Cariniana pyriformis Miers.)

Agronoma Colombiana, vol. 23, nm. 1, enero-junio, 2005, pp. 50-54,Universidad Nacional de Colombia

Colombia

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Agronoma Colombiana, 2005. 23 (1): 50-54

PROPAGACIN Y CULTIVOS DE TEJIDOS

Induccin de organognesis indirecta en Abarco (Cariniana pyriformis Miers.)Inducing indirect organogenesis in Abarco (Cariniana pyriformis Miers.)

Mary Luz Yaya1, Olga Luca Rodrguez2, William Usaqun3 y Alejandro Chaparro4

Resumen: Se indujeron procesos primarios de morfognesis de novo va organognesis indirecta en segmentos de hipoctilo de abarco, provenientes de plntulas in vitro de dos semanas de edad. El material fuente se obtuvo por germinacin de embriones en Woody Plant Mdium (WPM) diluido a la mitad y sin reguladores de crecimiento. La formacin de callo or-ganognico se estimul mediante la adicin de cido indolactico (AIA) conjuntamente con 6-bencilami-nopurina (BAP). Despus de cuatro semanas el mayor porcentaje de formacin de callo (75%) se observ con la combinacin AIA 1,21 M y BAP 7,6 M.

Palabras clave adicionales: Lecythidaceae, ca-llo organognico, brotes adventicios.

Abstract: Morphogenesis was induced in Cariniana pyriformis hypocotyl explants via indirect organogen-esis. Explants were taken from two-week-old in vitro plants. The source material was obtained from ger-minating embryos in Woody Plant Medium (50%) without hormones. Callus formation was stimulated by IAA (indolacetic acid) and BAP (6-benzyl amino purine). The highest percentage (75%) of callus de-velopment (after four weeks) resulted from a combi-nation of 1.21 M IAA and 7.6 M BAP.

Additional key words: Lecythidaceae, organoge-nic callus, adventitious bud.

Introduccin

EL ABARCO (CARINIANA PYRIFORMIS MIERS.) es una espe-cie forestal que pertenece a la familia Lecythidaceae, la cual incluye aproximadamente 20 gneros y cerca de 440 especies de hierbas y rboles pantropicales (Morton et al., 1997). Los reportes bibliogrficos indican que C. pyriformis se encuentra restringida a Panam y Colom-bia, aunque existen especies muy similares en otros pa-ses. En nuestro pas, su distribucin se extiende a las tres cordilleras principalmente en la regin del Magdalena Medio, Choc, Urab, las serranas de San Lucas, Abi-be, San Jernimo, Ayapel, Los Motilones y el Baud. Su

distribucin natural corresponde a bosques hmedos y muy hmedos tropicales y a altitudes entre 500 y 800 m.s.n.m. (CONIF, 1996).

Debido a su alta calidad y durabilidad, la madera de abarco es muy apreciada, tanto en el mercado nacio-nal como internacional, constituyndose en una especie de alto potencial comercial para el pas, razn por la cual hace parte de las especies vegetales promisorias in-cluidas en el convenio Andrs Bello (Bernal y Correa, 1994). Sus principales usos comprenden el rea de cons-truccin y fabricacin de muebles; tambin es apta para construcciones navales, instrumentos de laboratorio y,

Fecha de recepcin: 14 de septiembre de 2004Aceptado para publicacin: 27 de mayo de 2005

1 Biloga, Laboratorio de Biologa Molecular, Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogot. e-mail: mlyayal@unal.edu.co

2 Investigadora, Unidad de Biotecnologa, Instituto SINCHI, Bogot. e-mail: olgarod@softhome.com3 Instructor Asociado, Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogot. e-mail: wusaquenm@unal.edu.co4 Profesor Asistente, Laboratorio de Biologa Molecular, Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogot. e-mail:

achaparrog@unal.edu.co

Yaya et al.: Induccin de organognesis indirecta... 512005

en algunas regiones, es importante para la fabricacin de canoas (PROEXPO, 1972; CONIF, 1996).

Adems de su importancia como recurso maderable, C. pyriformis es una especie altamente promisoria en el rea de reforestacin de bosques nativos, obtenindose buenos resultados en estudios con formaciones ecolgi-cas de bosque hmedo tropical (Castro et al., 1993).

Diversas entidades nacionales, entre ellas el Instituto SINCHI, se han enfocado en estudiar y mejorar dis-tintos procesos de propagacin del Abarco. Respecto de los sistemas de propagacin in vitro, hasta la fecha slo se haba reportado el trabajo realizado por Castro et al. (1993) en micropropagacin de microestacas pro-venientes de material ex vitro.

Con el fin de inducir procesos morfogenticos de novo como embriogensis somtica y organognesis, se evalu la respuesta de varios tipos de explantes juveniles proce-dentes de plntulas establecidas en condiciones in vitro, a distintas combinaciones de fitoreguladores. En el pre-sente artculo se reportan los resultados obtenidos en los procesos de induccin de organogensis indirecta.

Materiales y mtodos

Obtencin de material fuente y germinacin in vitro

Se extrajeron semillas a partir de frutos maduros las cuales, despus de lavado con agua corriente, se sometieron a un proceso de desinfeccin mediante inmersin en polivinil-pirrolidona (Isodine) al 10% por 1 h y posteriormente en hipoclorito de sodio al 5,25 % por una hora. Despus de tres enjuagues con agua destilada estril, y en condiciones aspticas, se aislaron los embriones que se sembraron, al igual que semillas completas, en medio Woody Plant dilui-do a la mitad, suplementado con sacarosa al 30% y agar al 6% (Castro et al., 1993). El medio previamente se ajust a pH 5,8 con HCl 1N y NaOH 1N y se esteriliz en auto-clave por 15 min a 20 lbs de presin.

Induccin de callo organognico

A partir de plntulas de dos semanas de edad obteni-das por germinacin in vitro de embriones, se aislaron segmentos de hipoctilos, cotiledones y hojas jvenes, los cuales se inocularon en el medio anteriormente des-crito, suplementado con las distintas combinaciones de fitoreguladores a evaluar (Tabla 1).

Tabla 1. Efecto del cido indolactico (AIA) y la 6-bencila-minopurina (BAP) en la formacin de callo organognico so-bre segmentos de hipcotilo de Abarco (Cariniana pyriformis)a.

Tratamiento AIA [M] BAP [M] % hipoctilosb que

formaron callo

Control - - 01 1,21 02 3,42 03 6,84 04 - 7,6 05 - 13,1 06 - 26,2 07 1,21 7,6 75*8 3,42 13,1 459 6,84 26,2 60

a. Datos tomados despus de cuatro semanas de cultivo.b. Porcentaje promedio calculado para dos ensayos, cada uno con 10 rplicas por tratamiento.

Tomando como referencia el trabajo de Vengade-san et al. (2000) en la especie leosa Acacia sinuata, se evaluaron tres combinaciones auxina-citoquinina de cido indolactico (AIA) y 6-bencilaminopurina (BAP) (1,21 y 7,6 M; 3,42 y 13,1 M; 6,84 M y 26,2 M, respectivamente), al igual que el efecto de cada una de las concentraciones individuales de los fitoreguladores sobre los explantes, estableciendo as un total de 9 tra-tamientos (Tabla 1). Por cada tratamiento se evaluaron 10 rplicas (segmentos de hipocotilo, cotiledn y hoja, respectivamente), y el ensayo completo se realiz dos veces. En cada tratamiento se evalu el porcentaje de formacin de callo organognico (callo a partir del cual se formaron brotes caulinares y/o radicales) despus de cuatro semanas. Las diferencias estadsticas entre los tratamientos se detectaron utilizando la prueba de los signos (Siecel, 1995) considerando un nivel de signifi-cancia = 0,05.

Los explantes inoculados fueron ubicados en una c-mara de crecimiento con un fotoperodo 12/12 y tem-peratura de 26 2 C.

Anlisis histolgicos

Los callos obtenidos fueron fijados en carnoy (3 etanol : 1 cido actico glacial) por 48 horas, deshidratados a travs de inmersin en una serie gradual de concentraciones de alcohol etlico, y por ltimo, baados en parafina. Se cor-taron secciones de 7-10 m en un micrtomo rotatorio, que se sometieron a tincin mediante la tcnica fast green-safranina (Roth, 1964). Posteriormente las lminas fueron

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observadas al microscopio para evidenciar las estructuras morfognicas.

Resultados y discusin

Germinacin in vitro

En los ensayos realizados, solamente se obtuvo respuesta germinativa en los embriones con porcentajes de germi-nacin entre 80 y 90% (datos no mostrados). Previamente, Castro et al. (1993) intentaron establecer procesos de ger-minacin de embriones in vitro; sin embargo, la alta conta-minacin y efectos txicos de los antibiticos empleados para controlar el crecimiento de los agentes patgenos no les permitieron desarrollar el proceso. En nuestro caso, la contaminacin fue muy baja (0-5%, datos no mostrados) y no represent un problema para la germinacin y estable-cimiento del stock in vitro de plantas.

La velocidad del proceso de germinacin in vitro fue ma-yor con respecto al proceso de germinacin en suelo, que como lo reportan Diez y Moreno (1998) tiene una dura-cin de 12 a 27 das. En condiciones in vitro, la germina-cin del embrin comienza a ser notable hacia el quinto da despus de la siembra, y aproximadamente 25-30 das despus, la plntula se encuentra bien desarrollada con co-tiledones completamente expandidos y con las primeras hojas bien formadas. Probablemente, como lo afirma Pie-rik (1990), debido a la prdida de inhibidores ocasionada al eliminar la testa, el proceso de germinacin se acelera y la plntula se desarrolla rpidamente.

Organognesis indirecta

De los tres tipos de explantes evaluados, slo los seg-mentos de hipoctilo generaron respuesta callognica. En todos los casos, el callo se origin en los extremos de los explantes y se extendi progresivamente por toda la superficie.

En los tratamientos en los que se aplic nicamente AIA (tratamientos 1-3, Tabla 1), la mayor parte de los ex-plantes inoculados (80%, datos no mostrados) generaron callo compacto de color blanco-amarillo o amarillo, sin ninguna evidencia morfolgica ni histolgica de posibles estructuras organognicas. Cuando se aplic nicamente BAP (tratamientos 4-6, Tabla 1) se form callo de tipo compacto de color marrn-verde (70% de los explantes inoculados, datos no mostrados), pero igualmente sin evi-dencias de estructuras organognicas.

Independientemente de las concentraciones utiliza-das, las combinaciones auxina-citoquinina evaluadas (tratamientos 7-9, Tabla 1) originaron callos de colora-cin marrn-verde de tipo organognico (Figura 1A), en los que se formaron, tanto yemas caulinares como radicales (Figuras 1B y C).

La combinacin AIA (1,21 M) + BAP (26,2 M) ge-ner un porcentaje de formacin de callo organognico altamente significativo (75%, p = 0,04122), mientras que las combinaciones AIA (6,84 M) + BAP (26,2 M) y AIA (3,42 M) + BAP (13,1 M) generaron porcentajes de callo organognico de 60 y 45%, respectivamente (Tabla 1).

Los anlisis histolgicos confirmaron la formacin de brotes adventicios a partir de los callos organognicos. La Figura 1D muestra la formacin de zonas meristemticas (domos) y de primordios foliares a partir del tejido paren-quimtico del callo en el caso de brotes caulinares.

Puesto que la recalcitrancia es una caracterstica comn de muchas especies leosas, el proceso de es-tablecimiento y propagacin in vitro de gran parte de ellas se inicia tomando como base explantes juveniles provenientes de lneas germinales debido a su mayor potencial morfognico (Segura, 1993).

En esta clase de explantes la respuesta callognica de un tipo particular como los hipoctilos, puede indicar, como lo sugieren Sujatha y Mukta (1996), un efecto de predisposicin del tejido a sufrir procesos de multiplica-cin celular a una velocidad mayor que otros, debido a que presenta distinto potencial morfognico, y/o como sugieren Tonon et al. (2001), como resultado de diferencias en el contenido hormonal del tejido que afectan la interac-cin con los fitorreguladores exgenos aplicados.

La efectividad de la combinacin AIA-BAP en la induccin de brotes adventicios ha sido reportada en varias especies leosas: Acacia sinuata, Sesbania sesban, Prosopsis cineraria, Dalbergia sissoo, entre otras (Rao, 1988; Vengadesan et al., 2000), evidenciando el papel relevan-te que juega la interaccin especfica auxina-citoquini-na dentro del proceso de desdiferenciacin celular, ad-quisicin de potencial morfogentico y neoformacin de estructuras ocurridas en el callo (Street, 1979; De Klerk, 1997, Quoirin et al., 1998).

Recientes estudios moleculares realizados en Arabidopsis, han identificado genes relacionados con la regulacin hor-

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monal en los procesos organognicos. El gen REV/IFL1 (Revoluta/Interfascicular fiberless) por ejemplo, es importante en el transporte polar de auxinas, en la formacin de meriste-mos de brotes y en procesos de diferenciacin celular. De otro lado, el gen ABP1 (Protena 1 de ligamiento a auxina), al parecer est involucrado con la regulacin de auxinas en procesos de expansin celular. Adicionalmente, se ha pro-puesto que elementos reguladores del ciclo celular como las ciclinas-D, juegan un papel relevante en los procesos de multiplicacin celular que conllevan al desarrollo de callos, como resultado de su induccin por citoquininas (Mizuka-mi, 2001). Dentro de estos hallazgos, uno de gran inters es la respuesta callognica inducida por la accin ectpica del gen Ant (Antegumenta) en tejidos diferenciados y sin la adicin exgena de auxinas o citoquininas, lo que sugiere un papel primordial de este gen en el mantenimiento de la competencia meristemtica, es decir, la capacidad celular de crecimiento y multiplicacin que surge como respuesta a seales de crecimiento y desarrollo durante los procesos organognicos vegetales (Mizukami, 2001).

La formacin de un tipo determinado de estructura (brotes caulinares o radicales) es dirigida en gran parte por la proporcin auxina/citoquinina aplicada (Har-tmann et al., 1997). Sin embargo, en nuestro estudio, la formacin conjunta de brotes caulinares y radicales en el callo no nos permiti establecer un requerimiento especfico de esta proporcin para direccionar el desa-rrollo de uno u otro tipo.

Siguiendo el proceso realizado por Vengadesan et al. (2000), algunos callos se inocularon en medio suplemen-tado con AG

3 (datos no mostrados), con el fin de inducir

la elongacin de los brotes caulinares; sin embargo, los fuertes procesos oxidativos presentados a lo largo de la primera semana despus del cambio de medio, llevaron a su necrosis y prdida total.

La oxidacin es uno de los mayores problemas encon-trados durante el desarrollo de procesos in vitro con espe-cies leosas. No obstante, en muchos casos se ha podido

Figura 1. Organognesis indirecta en Abarco. A. Callo organognico, B. Brotes caulinares ad-venticios, C. Brotes radiculares adventicios, D. Corte histolgico de primordio caulinar originado en callo organognico; aumento 10X.

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solucionar y los sistemas de propagacin han logrado ser optimizados con xito (George, 1993). Es necesario para el caso de abarco, enfocar esfuerzos en la bsqueda de trata-mientos que solucionen el problema oxidativo, de manera que se pueda continuar y mejorar el desarrollo de un siste-ma de multiplicacin por brotacin adventicia.

La formacin de brotes adventicios, y su posterior de-sarrollo a plantas, constituye un sistema con altas tasas de multiplicacin (Jones, 1983; Hartmann et al., 1997); y ha sido utilizado con xito en la propagacin de espe-cies leosas de alta importancia econmica como Citrus sp. y palma de aceite (Jones, 1983; George, 1993).

En el caso del abarco, la optimizacin de este tipo de sistema y de otros procesos de propagacin in vitro, probablemente requieran de una ardua investigacin. Sin embargo, por tratarse de una especie nativa de alto potencial econmico y ambiental para el pas, es impor-tante continuar explorando todas las vas posibles para su multiplicacin y futuro mejoramiento, paralelamente a investigaciones sobre su gentica, fisiologa y ecologa, con el fin de generar el conocimiento necesario para aprovechar al mximo sus beneficios.

Conclusin

S bien el sistema de brotacin adventicia en abarco necesi-ta ser optimizado, la induccin de brotes lograda mediante la adicin conjunta de AIA y BAP constituye un primer paso en el desarrollo de ste y otros procesos in vitro, que en un futuro contribuyan en los programas de propagacin y mejoramiento de esta especie maderable nativa.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Gobernacin del Guaviare y al Plan Nacional de Desarrollo Alternativo (PNDA) por la financiacin brindada, as como al Instituto Amaznico de Investigaciones Cientficas SINCHI, por facilitar los ele-mentos necesarios para el desarrollo de este trabajo.

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