P1. Identificación de material y equipos. · Análisis de microorganismos genéricos. Objetivo : Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la preparación de

Prácticas de Microbiología

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P1. Identificación de material y equipos. Objetivo: Situar e identificar los aparatos y el material general y específico del laboratorio de

microbiología, asociándolo a su correcto uso.

A) EQUIPOS: 1. Generales:

a) Seguridad: - Ducha de emergencia y lavaojos. - Extintores. - Vitrina extractora.

b) Uso común: - Mecheros. - Granatarios. - Estufa de secado. - Placas de calefacción y baños.

2. Específicos: - Autoclaves. - Estufas de incubación. - Equipos de filtración con membrana. - Microscopios. - Lupa binocular. - Agitador excéntrico. - Stomacher. - Contador de colonias.

B) MATERIAL: 1. General:

- Matraces. - Probetas. - Pipetas. - Pipeteadores y peras de goma. - Tubos de ensayo. - Placa de toques.

2. Específico:

- Pinzas. - Asa de siembra y - Pincho de siembra. - Asa de Driglaski. - Frascos de cultivo. - Tubos de cultivo. - Placas de Petri. - Placas de contacto. - Placas de membrana filtrante. - Portaobjetos. - Cubreobjetos. - Campanas de Durham.



P2. Uso del microscopio. Objetivo: Identificar las partes del microscopio óptico y conseguir su correcto uso,

mantenimiento y limpieza, mediante la visualización de preparaciones ya hechas. Material:

- Microscopio óptico. - Aceite de inmersión. - Papel de limpieza óptico.

Procedimientos:

• USO DEL MICROSCOPIO.



USO DEL MICROSCOPIO: 1. Comprueba que las lentes del ocular y de los

objetivos están limpias. 2. Coloca la preparación sobre la platina

sujetándola. 3. Coloca en posición el objetivo de menos

aumentos. 4. Baja al mínimo el condensador y abre

totalmente el diafragma. 5. Enfoca con el tornillo macrométrico:

- Sin mirar por el ocular y con el tornillo macrométrico, acerca al máximo el objetivo a la preparación sin que exista contacto.

- Con el tornillo macrométrico, suba lentamente el objetivo hasta conseguir un enfoque nítido.

6. Pase al objetivo intermedio y sube el condensador.

7. Enfoca con el tornillo micrométrico. Si no lo consigue, repita los puntos 3 al 5.

8. Gira el revólver a medio camino entre los objetivos intermedio y alto.

9. Coloca una gota mínima de aceite de inmersión en el punto de luz.

10. Gira el revólver, asegurándote que el objetivo de más aumentos, no toca la preparación pero sí la gota.

11. Enfoca muy despacio con el tornillo micrométrico. Si no lo consigue, repita los puntos 3 al 10.

12. Una vez acabada la observación, coloca en posición el objetivo de menos aumentos.

13. Retira la preparación de la platina. 14. Limpia perfectamente el objetivo de

inmersión antes de que se seque. 15. Una vez acabadas todas las observaciones,

limpia perfectamente todas las partes ópticas y mecánicas del microscopio y lo guardas en el lugar habilitado para ello. Si va a volver a usarlo en la misma sesión de trabajo, basta con enfundarlo.

Nota: Repetir el proceso para cada una de las preparaciones, seleccionando un campo visual para cada preparación, dibujándolo y anotando las observaciones pertinentes para cada uno de los objetivos utilizados.



P3. Preparación de muestras microscópicas y su observación.

Objetivo: Confeccionar preparaciones microscópicas en fresco y por tinción simple y

diferencial, para su posterior observación. Material:

- Mechero. - Asa de siembra. - Pinzas. - Portaobjetos y cubreobjetos. - Microscopio óptico y aceite de inmersión. - Papel de limpieza óptico. - Papel de filtro.

Reactivos:

- Azul de metileno al 1 %. - Safranina al 0,5 %. - Violeta cristal al 1 %. - Lugol (disolución diluida de yodo). - Alcohol-acetona 1:1 (o etanol de 95º). - Metanol.

Procedimientos:

• OBSERVACIÓN EN FRESCO. • FIJACIÓN DE BACTERIAS. • TINCIÓN SIMPLE. • TINCIÓN DE GRAM.



OBSERVACIÓN EN FRESCO: 1. Toma una gota (o pequeña porción sólida) de

muestra con el asa estéril y deposítala en el portaobjetos.

2. Coloca el cubreobjetos evitando la formación de burbujas.

3. Observa al microscopio sin inmersión, cambiando varias veces de campo.

4. Anota las observaciones de morfología, movimiento, etc., dibujando los diferentes campos observados.

5. Repite el proceso para gota pendiente utilizando un porta excavado.

Nota: La observación se realizará en una muestra de:

- Agua estancada. - Yogurt.

FIJACIÓN DE BACTERIAS: 1. Coloca una pequeña gota de agua en el porta

con el asa de siembra. 2. Transfiere con el asa estéril una pequeña

porción sólida. Suspéndela y extiéndela. Si el cultivo es líquido basta con colocar y extender una gota.

3. Evapora el líquido sin calor. 4. Fija las bacterias al porta:

a) Por calor, pasando 3 veces el porta por la llama durante unos segundos y dejando enfriar entre cada pase.

b) Con metanol, añadiendo unas gotas sobre la extensión seca y evaporando al aire.

Nota: Realiza la fijación en 2 muestras de yogurt y 2 muestras de agua, utilizando las dos técnicas de fijación. TINCIÓN SIMPLE: 1. Cubre el material a colorear con el colorante

durante el tiempo necesario. 2. Lava con agua con el porta inclinado sin que

el agua incida en el frotis, escurriéndola desde el borde superior.

3. Elimina, golpeando de canto, la máxima cantidad de agua posible del porta, secándolo después por presión (nunca frotando) entre papel de filtro.

4. Observa al microscopio con objetivo de inmersión excepto la tinción de la cebolla. Selecciona un buen campo, anota morfología, movimientos, etc., y dibújalo.

Nota: Realiza la tinción de:

- Frotis del yogurt con azul de metileno (15 minutos).

- Frotis del agua con safranina (1 minuto).

TINCIÓN DE GRAM: 1. Tiñe el frotis con violeta cristal durante 1

minuto. 2. Lava abundantemente con agua. 3. Cubre con lugol durante 1 minuto. 4. Lava con agua el exceso de lugol. 5. Decolora con alcohol-acetona (o alcohol de

95º) hasta que el líquido de lavado sea incoloro.

6. Lava con agua. 7. Tiñe con safranina durante 1 minuto. 8. Lava con agua. 9. Seca la pareparación. 10. Observa con el microscopio utilizando el

objetivo de inmersión. Selecciona un buen campo, anota morfología, movimientos, etc., y dibújalo.

Nota: Realiza la tinción de:

- Frotis del agua. - Frotis del yogurt.



P4. Uso del autoclave y otros métodos de esterilización y limpieza.

Objetivo: Preparar las disoluciones desinfectantes a utilizar, así como limpiar y esterilizar el

material que con posterioridad se utilizará. Material:

- Mechero. - Asa de siembra. - Pinzas. - Vasos de precipitados de vidrio. - Vasos de precipitados de politeno. - Probetas de politeno. - Material para limpiar y esterilizar.

Reactivos:

- Etanol o metanol de quemar. - Isopropanol. - Fenol. - Jabón o detergente. - Solución de hipoclorito comercial (lejía).

Procedimientos:

• PREPARACIÓN DE DISOLUCIÓN DESINFECTANTE DE INMERSIÓN. • PREPARACIÓN DE DISOLUCIÓN DESINFECTANTE DE ASPERSIÓN. • ESTERILIZACIÓN DE ASAS Y PINCHOS DE SIEMBRA. • ESTERILIZACIÓN DE PINZAS Y ESCALPELOS. • LIMPIEZA DEL MATERIAL. • UTILIZACIÓN DEL AUTOCLAVE.



PREPARACIÓN DE DISOLUCIÓN DESINFECTANTE DE INMERSIÓN: 1. En un matraz o vaso de precipitados de 1 L,

añade unos 50 mL de lejía comercial y agua hasta completar el litro.

2. Distribuye en probetas de politeno a fin de utilizarlas como cementerios de pipetas.

3. Distribuye en vasos de precipitados de politeno a fin de utilizarlos como cementerios de portaobjetos y cubreobjetos.

PREPARACIÓN DE DISOLUCIÓN DESINFECTANTE DE ASPERSIÓN: 1. Pesa 10 g de fenol. 2. Disuelve en un matraz o vaso de precipitados

de 1 L lleno de isopropanol. 3. Distribuye en pulverizadores a fin de

utilizarlos para la aspersión de manos, superficies y vertidos ocasionales.

ESTERILIZACIÓN DE ASAS Y PINCHOS DE SIEMBRA: 1. Enciende el mechero y pon llama oxidante. 2. Introduce el asa o pincho de siembra inclinado

en la llama y en la zona de fusión o de máxima temperatura.

3. Déjalo que se ponga al rojo en toda su extensión. Enfríalo al lado de la llama.

ESTERILIZACIÓN DE PINZAS Y ESCALPELOS: 1. Sumerge las pinzas o escalpelo en alcohol de

quemar. 2. Con las debidas precauciones, enciende el

alcohol hasta su agotamiento. 3. Envuélvelas, hasta su utilización, en papel

seda (el papel de prensa también es válido y además de barato colaboramos en su reciclado).

LIMPIEZA DEL MATERIAL: 1. Efectúa el tratamiento previo si es necesario

(neutralización de vidrios alcalinos nuevos, limpieza con mezcla crómica si existen rastros de tinción, etc.).

2. Lava el material con agua y jabón perfectamente auxiliándote de los escobillones.

3. Enjuaga, al chorro en grifo, con agua abundantemente.

4. Enjuaga, con los frascos lavadores, con agua destilada o desmineralizada.

5. Seca el material en escurridores o en la estufa de secado.

UTILIZACIÓN DEL AUTOCLAVE:

1. Puesta en marcha:

1. Comprueba que los grifos de desagüe y de vapor estén cerrados.

2. Conecta a la red eléctrica. Abre la tapa del autoclave girando el volante de cierre hasta levantarla totalmente, y hecho esto, girar el brazo hacia afuera.

3. Llena el autoclave con agua destilada hasta el nivel de la gradilla inferior.

4. Introducir el material en el interior bien en bolsas directamente o en cestos, procurando que entre el material queden espacios para la circulación del vapor.

5. No taponar los orificios de la parte alta del interior del depósito.

6. Tener la precaución, de que al colocar los tubos en los cestos, no sobresalgan, para que el cesto siguiente quede perfectamente colocada sobre la de abajo.

7. Cerrar la tapa girando el brazo hasta el tope y apretar el volante de cierre hacia abajo, cerrando completamente.

8. Accionar el interruptor.

9. Asegurarse que el terminal posterior de desagüe, por el que saldrán las gotas de agua de condensación del aire, está colocado en la rejilla de salida y ésta no está obstruida.

10. Comprobar que la temperatura y el tiempo están seleccionados.

11. La esterilización empieza y acaba cuando suena un zumbador bitonal.

2. Durante la esterilización:

1. Al accionar el interruptor mirar que se enciende el piloto de red, el de calefacción y el regulador de temperatura real del autoclave.

2. Observar el aumento de la temperatura y la purga automática del aire hasta encenderse, el piloto de purga total.

3. La temperatura aumenta hasta llegar a la seleccionada, generalmente 121 ºC, apagándose entonces el piloto de calefacción



e iluminándose el piloto del temporizador, hasta acabar el tiempo seleccionado, generalmente, 20 minutos.

4. El temporizador va graduado de 0 a 1, con divisiones decimales. Para pasar a minutos, debemos tener en cuenta, el multiplicar los decimales por 60.

5. El temporizador no inicia la cuenta del mismo hasta no alcanzar la temperatura seleccionada.

3. Parada:

1. Cuando suena el zumbador, cerrar el interruptor. Dejar enfriar el autoclave hasta que la presión sea 0 y la temperatura sea inferior a 100 ºC. NUNCA ABRIR ANTES.

2. Abrir el autoclave.

3. Sacar los cestos y las bolsas con el material. Comprobar el nivel de agua del interior.

Nota: Siempre que se trabajen con muestras, además de lavarse con agua y jabón, es preceptivo rociar las manos con solución desinfectante, no sacar la bata hasta su lavado y limpiar todas las superficies utilizadas con la misma solución desinfectante.



P5. Análisis de microorganismos genéricos. Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la preparación de

muestras, preparación de medios de cultivo, siembra, incubación, identificación y recuento, mediante el análisis de microorganismos aerobios mesófilos.

Material: - Mechero. - Estufas de cultivo. - Equipo de filtración con membrana. - Placas de Petri de 90 mm. - Placas de cultivo de membranas. - Tubos de ensayo de 160x16 mm. - Campanas de Durham. - Tubos de ensayo normales. - Matraces de Erlenmeyer o vasos de precipitados. - Pipetas de 10 y 1 mL graduadas. - Pipetas de Pasteur. - Asa de siembra. - Asa de Driglaski. - Pinzas. - Espátulas o cucharillas. - Portaobjetos. - Microscopio óptico y aceite de inmersión. - Papel de limpieza óptico. - Papel de filtro. - Parafina.

Reactivos: - Safranina al 0,5 %. - Violeta cristal al 1 %. - Lugol (disolución diluida de yodo). - Etanol de 95º. - Rojo de metilo al 0,2 % (disolución hidroalcohólica).

Medios de cultivo: - Agua de peptona (o de triptona). - Agar nutritivo (o agar de recuento de placas PCA). - Caldo nutritivo (o caldo lactosado). - Agar nutritivo con 1 % de glucosa. - Agar de cultivo de membranas.

Procedimientos:

• PREPARACIÓN DE DILUCIONES DECIMALES. • ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS EN MEDIO SÓLIDO CON SIEMBRA EN MASA. • ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS EN MEDIO SÓLIDO CON SIEMBRA EN SUPERFICIE. • ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS EN MEDIO LÍQUIDO POR EL MÉTODO N.M.P. • ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS POR FILTRACIÓN CON MEMBRANA. • ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS TOTALES POR EL MÉTODO DE EXTENSIÓN. • AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS. • CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS. • CULTIVO EN ANAEROBIOSIS. • PRUEBAS BIOQUÍMICAS EN MICROORGANISMOS GENÉRICOS.



PREPARACIÓN DE DILUCIONES DECIMALES:

PREPARACIÓN DEDILUCIONES DECIMALES

1. Prepara la muestra a investigar. 2. Homogeneiza por agitación. 3. Toma con pipeta 1 mL de la mezcla

resultante. 4. Añade a un tubo con 9 mL de agua de

triptona (TW), o de agua de peptona (PW) como diluyente, y homogeneiza. Es la suspensión madre que se rotula como tal, o mejor, 1/10 ó 10-1.

5. Transfiere con una pipeta 1 mL de la suspensión madre a un tubo que contenga 9 mL de diluyente y homogeneiza. Marca la dilución como 1/100 ó 10-2.

6. Transfiere con una nueva pipeta, 1 mL de la disolución 10-2 aun tubo con 9 mL de diluyente, homogeneiza y rotula como 1/1000 ó 10-3.

7. Transfiere con una nueva pipeta, 1 mL de la disolución 10-3 aun tubo con 9 mL de diluyente, homogeneiza y rotula como 1/10000 ó 10-4.

8. Repite el proceso hasta conseguir la dilución 1/100000 ó 10-5.

RECUENTO EN MASA: 1. A partir de la serie de diluciones decimales,

y por duplicado, deposita con una pipeta 1 mL de cada dilución, en otras tantas placas de Petri marcadas con la dilución a emplear. Si comenzamos con la más diluida y seguimos de forma ordenada, sólo tendremos necesidad de una pipeta.

2. Añade unos 15 mL de agar nutritivo (PCA), atemperado entre 47-45 ºC en cada placa.

3. Mezcla perfectamente el medio con el inóculo girando en sentido horario y antihorario así como en dos direcciones perpendiculares.

4. Deja solidificar en un plano horizontal. 5. Invierte las placas. 6. Incuba las placas invertidas a 31 ºC durante

72 horas. 7. Cuenta las colonias en la dilución más

adecuada (entre 30 y 300 colonias). 8. Calcula el resultado expresado como

ufc/mL. Nota: El tiempo transcurrido desde que se deposita la muestra y se vierte el medio de cultivo no debe sobrepasar los 10 minutos. Igualmente, desde que se prepara la primera dilución de la serie de diluciones decimales,

hasta que se vierte el agar en la última placa, no superará los 20 minutos.

LC1H2OFECAL

18mL2mL

1 mL

TW = Agua de triptona

-3-2-1

9mL TW (0,1 %)

AGITARAGITARAGITARAGITARAGITAR AGITAR

-4 -5

-5-4

AGITARAGITARAGITAR AGITAR AGITAR

-1 -2 -3

Agar PCA1) 1 mL2) 15 mL de agaratemperado 45-47 ºC3) agitar4) solidificar

DILUCIONES DECIMALES

PCA = Agar de recuento en placa

ANÁLISIS DEMICROORGANISMOSEN MEDIO SÓLIDOSIEMBRA EN MASA

INVERTIR 31 ºC72 h.



RECUENTO EN SUPERFICIE: 1. Prepara las placas de Petri necesarias con

15 mL de agar nutritivo (PCA).

ANÁLISIS DEMICROORGANISMOSEN MEDIO SÓLIDOSIEMBRA EN SUPERFICIE

2. Sécalas en posición invertida en estufa a una temperatura inferior a 45 ºC.

3. A partir de la serie de diluciones decimales, y por duplicado, transfiere 0,1 mL de cada dilución a cada placa ya marcada con la dilución empleada.

4. Disemina el inóculo por toda la superficie con un asa de Driglaski o asa de vidrio acodada.

5. Deja las placas en reposo hasta absorción del inóculo.

6. Invierte las placas. 7. Incuba las placas, en posición invertida, a

31 ºC durante 72 horas. 8. Toma las placas de la dilución cuyo número

de colonias esté comprendida entre 30-300. 9. Cuenta las colonias que aparezcan

perfectamente aisladas. 10. Calcula el resultado, expresado como

ufc/mL. Nota: Debe agitarse cada tubo de dilución perfectamente antes de la toma del inóculo, por rotación entre las palmas de las manos en posición vertical, o mediante el agitador excéntrico. RECUENTO EN MEDIO LÍQUIDO NMP: 1. Prepara 3 series de 3 tubos con caldo

lactosado (BL) y campana de Durham. 2. Rotúlalos en función de las diluciones a

utilizar. 3. Toma las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3. 4. Siembra con pipeta 1 mL de la dilución

10-1, en los tres tubos de la primera serie, mezclando perfectamente.

5. Repite el proceso para cada dilución. Si comienzas por la serie más diluida (10-3), solo tendrás que utilizar una pipeta.

6. Incuba a 31 ºC / 72 horas o a 37 ºC / 48 horas.

7. Lee los tubos positivos (enturbiamiento y/o formación de gas).

8. Aplica las tablas NMP para dar el resultado. Las tablas NMP, expresan tanto el valor más probable, como los valores con una confianza del 95 %, expresado como u.f.c./ g o mL de la dilución más concentrada utilizada, en nuestro caso 10-1.

Nota: Si los tres tubos de la dilución más diluida resultan positivos, repite el proceso para 3 nuevas series más diluidas.

PCA = Agar de recuento en placa


-5-4

AGITARAGITAR

72 h.31 ºC

AGITAR AGITAR AGITAR

-1 -2 -3

Agar PCAplacas secas0,1 mL

INVERTIR

ANÁLISIS DEMICROORGANISMOSEN MEDIO LÍQUIDOPOR EL MÉTODO N.M.P.

BL = Caldo lactosado


-5-4

AGITARAGITAR

72 h.31 ºC

AGITAR1 mL

AGITAR AGITAR AGITAR

-1 -2 -3

10 mL de BL



RECUENTO POR FILTRACIÓN EN MEMBRANA: 1. Prepara con antelación una muestra de agua

contaminando 99 mL de agua de grifo con 1 mL de agua fecal.

2. Prepara el equipo de filtración a vacio. 3. Filtra los 100 mL de la muestra. 4. Con unas pinzas estériles, retira el filtro de

membrana del equipo de filtración, y deposítalo sobre la superficie de una placa con agar de cultivo en placa ENDO.

5. Incuba a 37 ºC durante 24-48 horas. 6. Realiza el recuento. 7. Expresa el resultado como ufc/mL. RECUENTO POR EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO: 1. Prepara la suspensión madre 10-1. 2. Toma 0,01 mL de suspensión y extiéndelo

en 1 cm2 del portaobjetos, dejándolo secar al aire.

3. Fija la extensión mediante calor. 4. Tiñe según Gram. 5. Con el objetivo de inmersión de x100 y el

ocular de x10 (x1000 en total), examina 10 campos de la muestra elegidos al azar y contando las agrupaciones bacterianas encontradas de gérmenes grampositivos y/o gramnegativos.

6. Calcula el resultado como ufc/g, según las fórmulas siguientes:

• ; donde N es ufc/g y n el número de agrupaciones bacterianas de un campo (trabaja con la media de los 10 campos observados).

nN ⋅⋅= 5105

• ; donde N es ufc/g y n el número de agrupaciones bacterianas observadas en los 10 campos.

nN ⋅⋅= 6105,1

• n

kfNr+⋅⋅

=610

ANÁLISIS DEMICROORGANISMOSPOR FILTRACIÓN CON MEMBRANA

; donde N es ufc/g, f un

factor de ponderación en función del tipo de muestra, cuyo valor es 1 si la muestra es seca, 2 si es una muestra con alta actividad de agua y 0,5 si es una muestra no diluida, k el número de agrupaciones contadas en n campos y r el logaritmo decimal de la dilución empleada.

• Nota: Solo se consideran las agrupaciones bacterianas y no el número de bacterias. Para contar una única bacteria, debe estar aislada, es decir, que esté separada del resto

por una distancia superior al eje mayor de la bacteria considerada.

H2OFECAL

48 h.37 ºC

99 mL

1mL

ENDO = Agar para filtración con membrana

H2O

MEMBRANAFILTRANTE

AGITARVACIO

CERRARABRIR

Agar ENDO seca

RECUENTO DEMICROORGANISMOSTOTALES POR EL MÉTODO DE EXTENSIÓN

1 cm2

9 mL1mL

H2OFECAL H2O

0.01 mL

EXTENDER

EVAPORAR AL AIRE

FIJAR

TINCIÓNDE GRAM

MICROSCOPIO



Nota: por duplicado, para trabajar individualmente cada alumno.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS:

PRUEBA DEL ROJO DE METILO Y FORMACIÓN DE GAS:

1. Prepara 2 placas de Petri con agar PCA. 2. Inocula una de ellas, a partir de una colonia

típica de las placas de recuento en superficie, utilizando la técnica de agotamiento en superficie mediante estrías oblicuas.

1. Prepara 2 tubos con caldo lactosado y campana de Durham.

3. Inocula la otra, a partir de un tubo de caldo positivo, de los utilizados en la técnica NMP, utilizando la técnica de agotamiento en superficie mediante estrías perpendiculares.

2. Inocula uno de ellos a partir de una colonia típica superficial y el otro a partir de un tubo de caldo positivo.

3. Incuba a 37 ºC durante 48 horas. 4. Toma con una pipeta de Pasteur de cada tubo 1-

2 mL y deposítalos en un tubo de ensayo normal.

5. Añade 1-2 gotas del reactivo de rojo de metilo. 4. Incuba las placas a 37 ºC durante 48 horas. 6. Visualiza y anota los resultados, incluyendo la

formación o no de gas en los tubos. 5. Visualiza y anota los resultados, dibujando

las placas. Nota: por duplicado, para trabajar individualmente cada alumno.


CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS:

1. Prepara 2 tubos con agar PCA en slant. 2. Inocula uno a partir de la misma colonia

típica, de la placa de recuento en superficie, mediante una estría única superficial.

3. Inocula el otro, a partir del mismo tubo de caldo positivo, mediante una estría única superficial.

4. Incuba a 37 ºC durante 48 horas. 5. Visualiza y anota los resultados. Nota: por duplicado, para trabajar individualmente cada alumno. CULTIVO EN ANAEROBIOSIS: 1. Prepara 2 tubos de ensayo con unos 10 mL

de agar PCA con un 1 % de glucosa. 2. Funde el medio de cultivo y ponlo en baño

María a 100 ºC durante 10 minutos, o mejora aún, manténlos en la estufa de mantenimiento de agares una vez esterilizados.

3. Atempera los tubos a unos 47-45 ºC. 4. Siembra uno, a partir de una colonia típica

en superficie, y el otro, a partir de un tubo positivo de caldo. Homogeneiza ambos tubos agitando suavemente mediante giro y sin formar burbujas de aire.

5. Solidifica los medios en baño de agua o al chorro de agua fría rápidamente.

6. Sella los tubos de ensayo con parafina. 7. Incuba a 37 ºC durante 48 horas en las

condiciones menos oxigenadas posibles. 8. Visualiza y anota los resultados.

CULTIVO EN ANAEROBIÓSIS,AISLAMIENTO, CONSERVACIÓN Y PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE MICROORGANISMOSGENÉRICOS

37 ºC48 h.

PCA

PCA

37 ºC48 h.

PCA (s)

BL

PCA con glucosa (1%)atemperado 45-47 ºC

PARAFINAR 37 ºC48 h.ENFRIAR

1-2 mL37 ºC48 h.

Rojo de metilo

Viraje = ácido(+)

PCA = Agar de recuento en placaBL = Caldo lactosado

BL



P6. Análisis de coliformes totales, coliformes fecales y E. coli. Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a los análisis de

microorganismos indicadores, mediante el análisis de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y E. coli.

Material:

- Mechero. - Estufas de cultivo. - Placas de Petri de 90 mm. - Tubos de ensayo de 160x16 mm. - Campanas de Durham. - Tubos de ensayo normales. - Matraces de Erlenmeyer o vasos de precipitados. - Pipetas de 10 y 1 mL graduadas. - Pipetas de Pasteur. - Asa de siembra. - Asa de Driglaski. - Espátulas o cucharillas. - Papel de filtro.

Reactivos:

- Rojo de metilo al 0,2 % (disolución hidroalcohólica). - α-naftol al 40 % (etanol absoluto). - Hidróxido potásico al 40 % (solución acuosa). - Creatinina (sólida). - Paradimetilaminobenzaldehído al 5 % (alcohol amílico / HCl c.c. 75:25). - Clorhidrato de N,N-dimetilparafenildiamina al 1 % (solución acuosa).

Medios de cultivo:

- Agua de triptona. - Caldo lactosado biliado verde brillante. - Caldo E.C. - Caldo MR-VP. - Agar Levine. - Agar nutritivo (o agar P.C.A.). - Agar citrato de Simmons.

Procedimientos:

• ANÁLISIS DE COLIFORMES TOTALES POR EL MÉTODO N.M.P. • ANÁLISIS DE COLIFORMES FECALES POR EL MÉTODO N.M.P. • DETECCIÓN DE E. COLI. • ANÁLISIS DE E. COLI EN MEDIO SÓLIDO. • CONFIRMACIÓN GENERAL DE E. coli. • CONFIRMACIÓN COMPLEMENTARIA DE E. coli.



ANÁLISIS DE COLIFORMES TOTALES POR EL MÉTODO N.M.P.:

1. Prepara la muestra. 2. Agita la mezcla. 3. Toma 1 ml de la mezcla. 4. Añade 9 mL de agua de peptona (PW) o

agua de triptona (TW) como diluyente, y homogeneiza que se rotula como 10-1.

5. Prepara las diluciones 10-2 y 10-3 de la muestra.

6. Prepara 3 series de 3 tubos con campana de Durham de caldo lactosado biliado verde brillante al 2% (B.G.B.L.).

7. Añade con pipeta de 10 mL, previa agitación de las ciluciones decimales, y comenzando por la más diluida para utilizar una única pipeta, 1 mL de disolución 10-1 a tres tubos rotulados al efecto, 1 mL de disolución 10-2 a otros tres tubos y 1 mL de disolución 10-3 a los otros tres tubos restantes.

8. Incuba a 37 ºC / 24 h. 9. Lee los tubos. Considera positivos aquellos

cuya campana de Durham contiene al menos un 10 % de su volumen ocupado por gas.

10. Aplica la tabla de NMP, expresando el resultado como coliformes totales /mL de muestra.

ANÁLISIS DE COLIFORMES FECALES POR EL MÉTODO N.M.P.: 1. Con un asa de cultivo, subcultiva todos los

tubos positivos para la investigación y recuento en medio líquido de coliformes totales, en 10 mL de B.G.B.L.(o también medio E.C.) con campana de Durham.

2. Incuba 44,5 ºC / 24-48 h en baño de agua, y si no es posible, en incubadora pero separados.

3. Lee los tubos. Considera positivos aquellos cuya campana de Durham contiene al menos un 10 % de su volumen ocupado por gas.

4. Aplica nuevamente la tabla de NMP, expresando el resultado como coliformes fecales /mL de muestra.

Nota: A los coliformes totales se les considera como presuntos E. coli.

H2OFECAL

LC1

2mL 18mL

AGITAR AGITAR AGITAR AGITAR

9mL TW (0,1 %)

1 mL

-1 -2 -3

10 mL BGBL (2%)

ANÁLISIS DECOLIFORMES TOTALESPOR EL MÉTODO N.M.P.

1 mL AGITAR37 ºC24 h.

BGBL = Caldo lactosado biliado al verde brillanteTW = Agua de triptona

10 mL BGBL (2%) incubado a 37 ºC / 24 h

ANÁLISIS DECOLIFORMES FECALESPOR EL MÉTODO N.M.P.

AGITAR

AGITAR 44,5 ºC24-48 h.

10 mL BGBL (2%)

-1 -2 -3

BGBL = Caldo lactosado bilidado al verde brillante



DETECCIÓN DE E. COLI:

1. Todos los tubos positivos presuntos E. coli

se siembran por agotamiento en estrías sobre placas de Petri con agar Levine (E.M.B.).

10 mL BGBL (2%) incubado a 44,5 ºC / 24-48 h.

AGITAR

-1 -2 -32. Incuba las placas a 37 ºC / 24 h. 3. Lee las placas. Las colonias típicas

presentan un centro negro-azulado y generalmente, pero no siempre, un brillo metálico verdoso.

Agar EMB secas

INVERTIR

37 ºC

24 h.

DETECCIÓN DEESCHERICHIA COLI

BGBL = Caldo lactosado biliado al verde brillanteEMB = Agar eosina azul de metileno (de Levine)

ANALISIS DE E. COLI EN MEDIO SÓLIDO SIEMBRA SUPERFICIAL: 1. Prepara una serie de diluciones decimales a

partir de la muestra de LC1 contaminado. 2. A partir de la serie de diluciones decimales,

y por duplicado, siembra 0,1 mL de cada dilución, por extensión superficial con asa de Driglaski, en placas de agar biliado rojo violeta lactosado (V.R.B.L.) perfectamente secas.

3. Incuba con las placas en posición invertida a 44,5 ºC / 24 h.

4. Lee las placas. Las colonias típicas son de color rojo-púrpura rodeadas de una zona violeta.

5. Haz el recuento de las placas (que contengan entre 30-300 colonias).

6. Expresa el resultado como ufc/mL de muestra.

Nota: Alternativa al método del N.M.P.

-3-2-1

1 mL

9mL TW (0,1 %)

AGITARAGITARAGITARAGITAR

18mL2mL

ANÁLISIS DEE. COLIEN MEDIO SÓLIDO SIEMBRA SUPERFICIAL

LC1H2OFECAL

0,1 mL

Agar VRBL secas

EXTENDER 44,5 ºC

24 h.INVERTIR

TW = Agua de triptonaVRBL = Agar lactosa bilis rojo violeta



CONFIRMACIÓN GENERAL Y COMPLEMENTARIA DE E. COLI:

1. Toma una colonia típica por placa de

Levine y la subcultivas por duplicado en caldo B.G.B.L. con campana de Durham y en T.W (5%).

2. Incuba los tubos en baño de agua o en estufa a 44,5 ºC / 24-48 h.

3. Lee los tubos. Se consideran positivos, aquellos que:

• Presentan gas en el tubo de B.G.B.L. y, • Al añadir 0,5 mL de reactivo de Kovacs

para indol (paradimetilaminobenzaldehido) al tubo de T.W., agitar y transcurrido un minuto, se forma un anillo rojo (no amarillo) en su superficie.

4. Expresa los resultados obtenidos. 5. A partir de colonias típicas de Agar Levine,

siembra placas con agar P.C.A. (o agar nutritivo).

6. Incuba a 37 ºC / 18-24 h. 7. Coloca en un cubeta de toques un disco de

papel de filtro (preferiblemente Whatman). 8. Añade 3 gotas de solución acuosa al 1 % de

α-naftol (dimetilparafenilendiamina), preparada recientemente.

9. Con una pipeta de Pasteur de punta cerrada, o mejor un capilar, toma una pequeña cantidad de una colonia y deposítala formando una línea.

10. Una coloración violeta-negro, se considera positiva, y por tanto no es E. coli.

11. En caso de ser oxidasa negativo siembra con la colonia 2 tubos de medio Clark y Lubs (MR-VP).

12. Incuba a 37 ºC / 4 días. 13. De uno de ellos, toma en un tubo de ensayo

1-2 mL y se añaden 1-2 gotas de rojo de metilo. Una coloración rojo indica positiva la prueba, como debe suceder con E. coli.

14. En el segundo tubo, se realiza la prueba de Voges-Proskauer, añadiendo 0,6 mL de α-naftol (al 40 % en etanol absoluto), 0,2 mL de potasa (al 40 % en agua) y unos cristales de creatinina.

15. Un fuerte color entre los 15 minutos y las 4 horas implica reacción positiva, contrario a E. coli.

16. A partir de una colonia reciente en el agar nutritivo utilizado, siembra un tubo en slant de agar citrato de Simmons, mediante estría única superficial.

17. Incuba a 37 ºC / 24 h. 18. Un crecimiento abundante (generalmente

con alcalinización del medio), implica un

resultado positivo de la prueba, lo que no sucede con E. coli.

Nota: A las pruebas del rojo de metilo, Voges-Proskauer, Citrato de Simmons junto con la del indol, se las conoce como pruebas I.M.V.i C.

Agar EMB incubada a 37 ºC / 24 h. 10 BGBL (2%)

10 mL TW (5%)

AGITAR

FORMACIÓN DE GAS

44,5 ºC

24-48 h.

P-DIMETILAMINOBENZLDEHIDO

0,5 mLAGITAR anillo rojo

Agar EMB Agar PCA

37 ºC

24 h.

1 m.

3 gotas de α-naftol

color violeta (-)

Rojo metilocolor rojo

37 ºC

4 días

Agar citrato de Simmons MR-VP

1) 0,6 mL de α-naftol2) 0,2 mL de potasa3) cristal de creatinina

0,25- 4 h.color (-)

37 ºC 24 h.

Crecimiento y alcalinización (-)

CONFIRMACIÓNGENRAL Y COMPLEMENTARIA DE E. COLI

EMB = Agar de LevineBGBL = Caldo lactosado biliado al verde brillanteTW = Agua de triptonaMR-VP = Caldo de rojo de metilo-Voges Proskauer



P7. Análisis de Enterobacteriaceae totales. Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la preparación de

muestras, preparación de medios de cultivo, siembra, incubación, identificación y recuento, mediante el análisis de microorganismos Enterobacteriaceae totales.

Material:

- Mechero. - Estufas de cultivo. - Placas de Petri de 90 mm. - Tubos de ensayo de 160x16 mm. - Campanas de Durham. - Matraces de Erlenmeyer o vasos de precipitados. - Pipetas de 10 mL graduadas. - Asa de siembra. - Pincho de siembra. - Espátulas o cucharillas. - Portaobjetos.

Reactivos:

- Hidróxido potásico al 3 % (solución acuosa). Medios de cultivo:

- Agua de peptona (o de triptona). - Agar nutritivo (o agar de recuento de placas PCA). - Agar violeta rojo bilis glucosa. - Agar de Klinger.

Procedimientos:

• ANÁLISIS EN MEDIO SÓLIDO CON SIEMBRA EN MASA CON DOBLE CAPA. • CONFIRMACIÓN DE ENTEROBACTERIACEAE.



Nota: La lectura sobre agar de Klinger, se verifica mirando el color del fondo (amarillo implica la fermentación de la glucosa y el rojo no), el color de la superficie (amarilla implica la fermentación de la lactosa y roja no), la presencia o ausencia de gas (atrapado en el medio, entre el medio y el tubo, o incluso rotura del agar) y la producción de sulfuro de hidrógeno (ennegrecimiento de la interfase que separa el fondo de la pendiente y que incluso a veces se ennegrece toda la parte inferior del tubo).

ANÁLISIS EN MEDIO SÓLIDO SIEMBRA EN MASA CON DOBLE CAPA: 1. Prepara la muestra contaminando 18 de

yogurt con 2 mL de agua fecal. 2. Pesa 1g de yogur. 3. Prepara una serie de diluciones decimales

hasta 10-3. 4. A partir de las diluciones decimales, y por

duplicado, añade 1 mL a placas de Petri. 5. Añade en cada placa 10 mL de agar biliado

rojo violeta glucosa (V.R.B.G.), fundido y atemperado a 45-47 ºC.

6. Mezcla cuidadosamente y deja solidificar. 7. Cubre las placas con otros 10 mL del

mismo agar y deja solidificar de nuevo.

8. Incuba las placas, en posición invertida, a 37 ºC / 18-24 h.

9. Lee las placas. Las colonias características son de color violeta (fermentación de la glucosa con producción de ácido) con un halo de precipitación alrededor (sales biliares).

10. Expresa el resultado como ufc / g. Nota: Las colonias típicas deben entenderse como presuntas Enterobacteriaceae. CONFIRMACIÓN: 1. A partir de 2 colonias típicas, siembra por

agotamiento en estrías las dos mitades de una placa bien seca de agar V.R.B.G.

2. Incuba a 37 ºC / 24 h. 3. Selecciona 2 colonias típicas y resiembra en

dos mitades de una placa de agar nutritivo o P.C.A.

4. Incuba a 37 ºC / 18-24 h. 5. A partir de las colonias aisladas, siembra 2

tubos en slant de agar Klinger (K.I.A.), sembrando abundantemente en superficie mediante asa, y en el fondo por picadura mediante el pincho.

6. Incuba a 37 1ºC / 24 h. 7. Lee los tubos a las 24 horas siempre. 8. Compara los resultados obtenidos con la

tabla de identificación sobra agar Klinger. 9. Como prueba adicional, toma una porción

de una colonia y llévala sobre un portaobjetos con una gota de potasa.

10. Mezcla perfectamente con el asa de siembra y observa si al tirar del asa se forman filamentos o no, para comprobar si son Gram positivos o Gram negativos como corresponde a Enterobacteriaceae.

ANÁLISIS DEENTEROBACTERIACEAEEN MEDIO SÓLIDO SIEMBRA EN MASA CON DOBLE CAPA

TW = Agua de triptonaVRBG = Agar glucosa bilis rojo violetaPCA = Agar recuento en placaKIA = Agar de Klinger hierro

INVERTIR

24 h.

37 ºC

Agar VRBG secas

H2OFECAL

2mL 18 g


9mL TW (0,1 %)

1 mL

-1 -2 -3

YOGURT

1) 1 mL2) 10 mL de agar atemperado3) agitar4) solidificar5) 10 mL de agar atemperado6) solidificar

18-24 h.37 ºC

VRBG

PCA Agar KIA

24 h.37 ºC

KOH

Gramnegativo

TABLA IDENTIFICACIÓN



P8. Análisis de estreptococos fecales. Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la preparación de

muestras, preparación de medios de cultivo, siembra, incubación, identificación y recuento, mediante el análisis de microorganismos estreptococos fecales.

Material:

- Mechero. - Estufas de cultivo. - Placas de Petri de 90 mm. - Matraces de Erlenmeyer o vasos de precipitados. - Pipetas de 10 mL graduadas. - Asa de siembra. - Espátulas o cucharillas. - Portaobjetos y cubreobjetos. - Microscopio óptico y aceite de inmersión. - Papel de limpieza óptico. - Papel de filtro.

Reactivos:

- Safranina al 0,5 %. - Violeta cristal al 1 %. - Lugol (disolución diluida de yodo). - Etanol de 95º. - Hidróxido potásico al 3 % (disolución acuosa). - Peróxido de hidrógeno (10 volúmenes).

Medios de cultivo:

- Agua de peptona (o de triptona). - Agar nutritivo (o agar de recuento de placas P.C.A.). - Caldo azida de Rothe. - Caldo etil violeta azida o de Litsky.

Procedimientos:

• DETECCIÓN Y RECUENTO DE STREPTOCOCOS DEL GRUPO D DE LANCEFIELD: • CONFIRMACIÓN DE LOS ESTREPTOCOCOS FECALES:

Nota: actualmente se suelen denominar como enterococos.



ANÁLISIS PRESUNTIVO DE ESTREPTOCOCOS FECALES POR EL MÉTODO N.M.P.

1. Prepara la muestra. 2. Pesa 1 g o toma 1 mL 3. Prepara la serie de diluciones decimales

hasta 10-3. 4. Prepara, ya rotulados, 3 series de 3 tubos

con 10 mL de caldo de cultivo glucosa azida (Rothe).

5. Inocula 1 mL de cada dilución a cada serie. 6. Incuba a 37 ºC / 24-48 h. 7. Lee los tubos. Se consideran positivos si

existe enturbiamiento del medio. 8. Expresa el resultado según la tabla de NMP

en ufc /g. ANÁLISIS CONFIRMATIVO DE ESPTREPTOCOCOCOS FECALES POR EL MÉTODO N.M.P. 1. Resiembra con tres asas de cultivo los

tubos positivos del caldo presuntivo azida de Rothe, en caldo confirmativo etil violeta azida (E.V.A.) o caldo Litsky.

2. Incuba a 37 ºC / 24-48 h. 3. Lee los tubos. Se consideran positivos los

que presentan enturbiamiento y/o sedimento violeta.

4. Resiembra los tubos sospechosos en placa de agar nutritivo o agar P.C.A., previamente sectorizadas.

5. Incuba a 37 ºC / 24-48 h. 6. A partir de una colonia aislada efectúa una

tinción de Gram. Deben observarse cadenas de cocos Gram positivos.

7. A partir de una colonia aislada efectúa la prueba de la potasa.

8. Sobre un portaobjetos añade 1 gota de H2O2 de 10 volúmenes sobre la que se emulsiona el cultivo a estudiar. En el caso de desprendimiento de burbujas se considera al microorganismo catalasa positivo. Los estreptococos del grupo D de Lancefield son catalasa negativos.

Nota: Después de suspender, sobre unas gotas de solución acuosa de potasa al 3 % en un porta, con movimientos circulares una porción de colonia, sólo puede considerarse positivo el ensayo, si al tirar del asa se forma un mucus que se adhiere al asa de siembra.

H2OFECAL

2mL 18 g


9mL TW (0,1 %)

1 mL

-1 -2 -3

10 mL GAB

ANÁLISIS PRESUNTIVO DEESTREPTOCOCOS FECALESPOR EL MÉTODO N.M.P.

YOGURT

1 mL AGITAR37 ºC24-48 h.

GAB = Caldo glucosa azida (Rothe)TW = Agua de triptona

EVA = Caldo azida violeta de etilo (Litsky)

ANÁLISIS CONFIRMATIVO DEESTREPTOCOCOS FECALESPOR EL MÉTODO N.M.P.

AGITAR

37 ºC24-48 h.

-1 -2 -3

3 ASAS

10 mL Azida de Rothe incubados 37 ºC / 24-48 h.

AGITAR

10 mL caldo EVA

H2O2

KOH

Gram cocos Gram (+)

Gram (+)

Catalasa (-)

37 ºC24-48 h.



P9. Análisis de Clostridium sulfito reductores. Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la preparación de

muestras, preparación de medios de cultivo, siembra, incubación, identificación y recuento, mediante el análisis de microorganismos Clostridium sulfito reductores.

Material:

- Mechero. - Estufas de cultivo. - Baño de agua termostatizado. - Jarra de anaerobiosis (o similar). - Tubos de ensayo de 160x16 mm. - Matraces de Erlenmeyer o vasos de precipitados. - Pipetas de 10 y 1 mL graduadas. - Espátulas o cucharillas. - Parafina.

Medios de cultivo:

- Agua de peptona (o de triptona). - Agar sulfito-polimixina-sulfadiazina.

Procedimiento:

• PRESENCIA O AUSENCIA DE CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES. Nota: Actualmente, se está sustituyendo este parámetro microbiológico por el de Clostridium perfringens.



PRESENCIA / AUSENCIA DE CLOSTRIDIOS SULFITOREDUCTORES:

1. Prepara la muestra. 2. Pesa 1g o mide 1 mL. 3. Añade 9 mL de agua de peptona (PW) o

agua de triptona (TW) como diluyente, y homogeneiza.

4. Prepara 2 tubos con un 8 mL de agar sulfito polimixina sulfadiazina (S.P.S.) licuado y regenerado.

5. Atempera a 47-50 ºC. 6. Transfiere con una pipeta 1 mL de la

suspensión madre a cada tubo de agar S.P.S., introduciendo la pipeta hasta el fondo y depositándolo de abajo a arriba.

7. Enfría con baño o al chorro de agua fría y sella los tubos con parafina estéril.

8. Deja solidificar la parafina. 9. Incuba a 46 ºC / 24-48 h. en las condiciones

más anaeróbicas posibles. 10. Lee los tubos. Se consideran positivos

aquellos que formen colonias negras, al haber reducido el sulfito a sulfuro y reaccionar este con el citrato de hierro para dar sulfuro ferroso, precipitado negro que se deposita alrededor de las colonias.

Nota: Mediante este procedimiento, determinamos la presencia/ausencia tanto de las formas vegetativas como esporuladas de clostridios sulfito-reductores conjuntamente. Para el análisis únicamente de las formas esporuladas, podemos aprovechar la termorresistencia de las mismas, destruyendo las formas vegetativas, bien en el producto, bien en la suspensión madre, bien en las diluciones decimales (caso de recuento), o bien en el medio ya inoculado y antes de sellarse con parafina por inmersión de la misma en un baño de agua a 80 ºC durante 5 minutos, enfriar rápidamente al chorro del grifo, para seguir el mismo procedimiento. Para regenerar el medio de cultivo, se mantiene en baño de agua hirviendo durante 10 minutos para expulsar el oxígeno disuelto y posteriormente enfriar rápidamente bajo el chorro del grifo hasta atemperar.

PRESENCIA/AUSENCIA DE CLOSTRIDIOS SULFITOREDUCTORES

YOGURTH2OFECAL

2mL 18 g

AGITAR

1 mL

1 mL

9mL PW (0,1 %)

AGITAR

8 mL SPS regenerado y atemperado

37 ºC24-48 h.

PARAFINAR

SPS = Agar sulfito polimixina sulfadiazinaPW = Agua de peptona



P10. Análisis de Salmonella y Shigella. Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la preparación de

muestras, preparación de medios de cultivo, siembra, incubación, identificación y recuento, mediante el análisis de los microorganismos Salmonella y Shigella.

Material:

- Mechero. - Estufas de cultivo. - Placas de Petri de 90 mm. - Tubos de ensayo de 160x16 mm. - Matraces de Erlenmeyer o vasos de precipitados. - Pipetas de 10 mL graduadas. - Asa de siembra. - Espátulas o cucharillas. - Portaobjetos. - Parafina.

Reactivos:

- Peróxido de hidrógeno (10 volúmenes). - Hidróxido potásico al 3 % /solución acuosa). - Reactivos I.M.V.i C:

Medios de cultivo:

- Agua de peptona tamponada. - Agar nutritivo (o agar de recuento de placas PCA). - Agar de Hektoen. - Agar urea de Christensen. - Agar Klinger. - Caldo tetrationato bilis verde brillante. - Caldo selenito verde brillante sulfamida. - Caldo lisina descarboxilasa.

Procedimientos:

• PRESENCIA O AUSENCIA DE SALMONELLA. • PRESENCIA O AUSENCIA DE SHIGELLA.



PRESENCIA / AUSENCIA DE SALMONELLA:

1. Prepara la muestra. 2. Toma 25 g o 25 mL. 3. Prepara una disolución con la muestra y

225 mL de agua de peptona. Incuba a 37 ºC / 16-20 h.

4. Homogeneiza el cultivo y transfiere 10 mL del mismo sobre 100 mL de caldo tetrationato bilis verde brillante (de Müller-Kauffmann) y otros 10 mL sobre 100 mL de caldo selenito verde brillante sulfamida.

5. Incuba el caldo tetrationato a 43 ºC / 18-24 h.

6. Incuba el caldo selenito a 37 ºC / 18-24 h. 7. Siembra por duplicado y sin cargar el asa

en la segunda placa, por agotamiento en estrías y para cada líquido selectivo, placas de agar BGA. Incuba a 37 ºC / 24-48 h.

8. Lee las placas. Las colonias de Salmonella son verde-azuladas con o sin centro negro.Selecciona al menos tres colonias típicas. Por duplicado y en placas de agar nutritivo divididas en tres sectores, siembra por agotamiento en estrías las tres colonias. Incuba a 37 ºC / 18-24 horas.

9. Por duplicado, siembra en tubos con agar urea en slant una colonia aislada de cada sector de las obtenidas en agar nutritivo. Incuba a 37 ºC / 24 horas. Salmonella como ureasa negativa no modifica el medio que sigue de color amarillo.

10. Siembra por duplicado, una colonia aislada de cada sector, en caldo lisina descarboxilasa de Taylor. Recubre con una capa de parafina estéril. Incuba a 37 ºC / 4 días, observando diariamente. Se considera reacción positiva, como debe producir Salmonella, la aparición de un color rojo o violeta.

11. En el caso de que los resultados sean ureasa negativo y lisina descarboxilasa positivo, realizar las pruebas sobre el agar de Klinger. En el caso de que se confirme Salmonella mediante las pruebas anteriores realiza la pruebas I.M.V.i C.

Nota: De forma alternativa podemos utilizar agar Hecktoen lugar de BGA, pero no, si queremos que no prolifere Shigella. Salmonella es I (-), M (+), V (-) y C (d). Salmonella fermenta la glucosa con producción de gas, no fermenta la lactosa y produce generalmente sulfuro de hidrógeno.

PRESENCIA/AUSENCIA DE SALMONELLA

YOGURTH2OFECAL

2mL 23 g

43 ºC18-24 h.

CT = Caldo tetrationato bilis verde brillante (Müller-Kaufmann)CS = Caldo selenito verde brilante sulfamidaAgar Urea = Agar de CristensenXLD = Caldo lisina descarboxilasa (Taylor)PW = Agua de peptona; PCA = Agar recuento en placaBVA = Agar al verde brillante

225 mL PW (1%)

CT

100 mL Caldo tetrationato

100 mL Caldo selenito

37 ºC

16-20 h 10 mL37 ºC

18-24 h.CS

CT

CS

18-24 h.

37 ºC

Agar PCA24 h.

37 ºC

Agar Urea XLD

37 ºC 24 h. 37 ºC 4 días

(-) color rojo-violeta (+)

KlingerIMViC

I(-) M(+) V(-) C(d)

BVA



PRESENCIA / AUSENCIA DE SHIGELLA: 1. Prepara la disolución madre como en el

caso anterior. PRESENCIA/AUSENCIA

DE SHIGELLA 2. Incuba a 37 ºC / 16-20 h. YOGURTH2O

FECAL 3. Con asa de cultivo siembra, y por duplicado, mediante agotamiento en estrías, placas con agar de Hektoen. Incuba a 37 ºC / 24-48 h.

2mL 23 g 4. Lee las placas. Las colonias típicas de

Shigella son de color verde.

5. Subcultiva 3 colonias seleccionadas por placa, en una placa de agar nutritivo dividida en tres sectores y por duplicado. Incuba a 37 ºC / 24 h.

6. A partir de una colonia aislada, realiza la prueba de la potasa. Shigella es Gram negativa.

7. A partir de una colonia aislada, realiza la prueba sobre agar urea de Christensen. Shigella es ureasa negativa.

8. A partir de una colonia aislada, realiza la prueba de la catalasa. Shigella es catalasa positiva (excepto Sh. Dysenteriae 1).

9. Si las pruebas anteriores son acordes a Shigella, realiza las pruebas sobre agar de Klinger.

10. En el caso de que se confirme Shigella mediante las pruebas anteriores, realiza las pruebas I.M.V. i C.

Nota:. Shigella es I (v), M (+), V (-) y C (-). Shigella fermenta la glucosa sin gas, no fermenta la lactosa ni produce sulfuro de hidrógeno.

Agar Urea = Agar de CristensenPW = Agua de peptonaPCA = Agar recuento en placa

225 mL PW (1%)

37 ºC

16-20 h

Agar Hecktoen

24-48 h.

37 ºC

Agar Urea

Klinger

IMViC

18-24 h.

37 ºC

Agar PCAAgar Hecktoen

H2O2 Catalasa (+)

KOH Gram (-)

37 ºC

24 h.(-)

I (v)M (+)V (-)C (-)



P11. Análisis de Staphylococcus aureus. Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la preparación de

muestras, preparación de medios de cultivo, siembra, incubación, identificación y recuento, mediante el análisis de microorganismos Staphylococcus aureus.

Material:

- Mechero. - Estufas de cultivo. - Placas de Petri de 90 mm. - Matraces de Erlenmeyer o vasos de precipitados. - Pipetas de 10 y 1 mL graduadas. - Asa de Driglaski. - Espátulas o cucharillas.

Medios de cultivo:

- Agua de peptona (o de triptona). - Agar de Baird-Parker (B.P.) - Emulsión estéril de yema-telurito.

Procedimiento:

• DETERMINACIÓN DE PRESENCIA O AUSENCIA DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS.



DETERMINACIÓN DE PRESENCIA O AUSENCIA DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS: 1. Prepara la muestra. 2. Pesa 1go 1 mL. 3. Añade 9 mL de agua de peptona (PW) o

agua de triptona (TW), como diluyente, y homogeneiza.

PRESENCIA/AUSENCIA DE STAPHYLOCOCCUSAUREUS

YOGURTH2OFECAL4. Transfiere con una pipeta 0,1 mL de la

suspensión madre a 2 placas de Petri con agar de Baird-Parker bien secas inoculando superficialmente.

5. Incuba a 37 ºC durante 18-24 h. 6. Lee las placas. Las colonias típicas son: • Pequeñas (puntiformes). • Negras y brillantes (debidas al teluro

formado). • Convexas. • Con un borde blanco muy fino. • Rodeadas de una zona clara (2-5 mm) que

puede mostrar viso oleoso y zona opaca.

2mL 18 g

AGITAR

1 mL

0,1 mL

9mL PW (0,1 %)

AGITAR

Agar BP

37 ºC18-24 h

BP = Agar Baird-ParkerPW = Agua de peptona



P12. Control de superficies y de manipuladores. Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la preparación de

muestras, preparación de medios de cultivo, siembra, incubación, identificación y recuento, mediante el análisis de la flora aeróbica superficial y del S. aureus en personas.

Material:

- Mechero. - Estufas de cultivo. - Placas de Petri de 90 mm. - Tubos de ensayo de 160x16 mm. - Tubos de ensayo normales. - Pipetas de 10 mL graduadas. - Papel satinado.

Medios de cultivo:

- Agua de peptona (o de triptona). - Agar nutritivo (o agar de recuento de placas PCA). - Agar de Baird-Parker.

Procedimientos:

• RECUENTO DE LA FLORA AERÓBICA EN SUPERFICIES. • PRESENCIA/AUSENCIA DE S. AUREUS EN MANIPULADORES.



RECUENTO DE LA FLORA AERÓBICA EN SUPERFICIES:

1. Prepara una ventana estéril de 9 cm2. ANTEBRAZO

VENTANA 9 cm 2

2. Prepara un hisopo en un tubo de ensayo con 8 mL de agua de peptona al 0,1 % y esteriliza el conjunto.

3. Prepara 3 tubos esterilizados con 9 mL de agua de peptona para hacer las diluciones hasta 10-3.

4. Con el hisopo escurrido y utilizando la técnica adecuada, toma la muestra en la superficie del antebrazo.

5. Homogeneiza en el agua de peptona y escurre perfectamente el hisopo antes de desecharlo para su posterior esterilización.

6. A partir de la disolución de la muestra, prepara las diluciones hasta 10-3.

7. Siembra en masa, y por duplicado, en placas de agar P.C.A. cada dilución.

8. Incuba a 31 ºC / 3 días ó a 37 ºC / 2 días). 9. Efectúa el recuento. 10. Haz los cálculos y expresa el resultado

como u.f.c. / cm2.

PRESENCIA/AUSENCIA DE S. AUREUS EN MANIPULADORES:

1. Prepara 1 placa de agar Baird-Parker, sécala perfectamente y divídela en 2 sectores.

2. Prepara 2 hisopos estériles secos. 3. Con uno de ellos toma una muestra de la

faringe y con el otro de las fosas nasales. 4. Inocula en cada uno de los sectores cada

una de las muestras. 5. Incuba a 37 ºC / 18-24 h. 6. Identifica la presencia / ausencia del

microorganismo investigando sus característica culturales.


AGITAR

8 mL PW (0,1%)

1) 1 mL2) 15 mL de agar atemperado3) agitar4) solidificar

9mL PW (0,1 %)

AGITARAGITARAGITAR

-3-2

Agar PCA

37 ºC48 h.

INVERTIR

-1

SECAS

FOSAS NASALES

GARGANTA

37 ºC18-24 h.

Agar BP

RECUENTO FLORA AERÓBICAEN SUPERFICIES

PRESENCIA/AUSENCIAS. AUREUS EN MANIPULADORES

PW = Agua de peptonaPCA = Agar de recuento en placasBP = Agar de Baird-Parker



P13. Control del aire. Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la preparación de

muestras, preparación de medios de cultivo, siembra, incubación, identificación y recuento, para evidenciar la presencia de microorganismos en el aire.

Material:

- Mechero. - Estufas de cultivo. - Placas de Petri de 90 mm. - Placas de filtración. - Filtros de 0,45 μ. - Bomba de vacío de membrana para filtración con caudal controlado.

Medios de cultivo:

- Agar nutritivo (o agar de recuento de placas PCA). - Agar de Sabouraud CeNAN. - Caldo de triptona soja (TSB).

Procedimientos:

• EVIDENCIA DE BACTERIAS EN EL AIRE. • EVIDENCIA DE HONGOS Y LEVADURAS EN EL AIRE. • RECUENTO DE MICROORGANISMOS AERÓBICOS MESÓFILOS EN EL AIRE.



EVIDENCIA DE BACTERIAS EN EL AIRE:

1. Prepara tres placas de agar P.C.A. y sécalas perfectamente.

2. En una zona determinada del laboratorio, abre las placas y ciérralas una a los 10 m., otra a los 20 m. Y otra a los 30 m.

3. Incuba a 37 ºC / 2 días. 4. Efectúa el recuento.

10 m.

5. Representa en un histograma: u.f.c. / tiempo. 37 ºC

48 h. EVIDENCIA DE HONGOS Y LEVADURAS:

1. Prepara una placa de agar Sabouraud CeNAN y sécala perfectamente.

2. Expónla al aire durante 15 minutos. 3. Incuba las placas a 31 ºC durante cuatro

días o más. 4. Cuenta las colonias. 5. Describe las características culturales de las

diferentes colonias.

RECUENTO DE AEROBIOS MESÓFILOS EN EL AIRE:

1. Prepara dos placas de filtración en membrana con caldo TSB a razón de 2 mL de caldo por placa.

2. De forma aséptica coloca el filtro de 0,45 m en el portafiltros.

3. Conecta la bomba de vacío y asegúrate que tenga el caudal nominal de 4 L/minuto.

4. Mantén encendido durante 25 minutos

exactos. Una vez finalizada la aspiración, de forma aséptica, 5. traslada el filtro sobre la placa de filtración. 6. Repite el proceso (puntos 2-5) para realizar

en recuento por duplicado. 7. Incuba a 31 ºC durante al menos 72 h. 8. Realiza el recuento de ambas placas. 9. Calcula la media. 10. Expresa el resultado como u.f.c./m3.

Agar PCA

ABRIR 20 m.

30 m.

CERRAR

CeNAN

ABRIR 15 m. CERRAR 31 ºC4 días

PCA = Agar de recuento en placaCeNAN = Agar de Saboreaud

EVIDENCIA DEBACERIAS, HONGOS YLEVADURAS EN EL AIRE

31 ºC 72 h

VACIO

MEMBRANAFILTRANTE

CERRAR ABRIR

Recuento de m.o. Aeróbicos mesófilos En el aire

aire

TSB: Caldo Triptona Soja



P14. Control del agua. Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos a lo largo del Curso y

acorde al contenido organizador del módulo de Análisis Microbiológicos “Organizar / realizar ensayos microbiológicos”, mediante el análisis de una muestra de “agua para consumo humano”según la legislación vigente, lo que supone:

1. Preparación de la documentación necesaria. 2. Esquema simbólico del trabajo a realizar. 3. Organización del trabajo a realizar. 4. Temporalización del trabajo a realizar. 5. Procedimiento escrito para cada investigación. 6. Preparación del material necesario. 7. Preparación de los medios de cultivo necesarios. 8. Elaboración del plan de muestreo y toma de muestra. 9. Preparación y adecuación de la muestra. 10. Realización de los ensayos (inoculación e incubación). 11. Identificación y/o recuento de los microorganismos implicados. 12. Expresión de resultados. 13. Comparación de los resultados con los prescritos. 14. Evaluación de la muestra.

Referencias:

- R.D. 140/2003 de 7 de febrero (B.O.E. número 45 de 21 de febrero de 2003). - R.D. 1074/2002 de 18 de octubre (B.O.E. número 259 de 29 de octubre de

2002).



P15. Control de los alimentos. Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos a lo largo del Curso y

acorde al contenido organizador del módulo de Análisis Microbiológicos “Organizar / realizar ensayos microbiológicos”, mediante el análisis de una muestra de “carne picada” según la legislación vigente, lo que supone:

15. Preparación de la documentación necesaria. 16. Esquema simbólico del trabajo a realizar. 17. Organización del trabajo a realizar. 18. Temporalización del trabajo a realizar. 19. Procedimiento escrito para cada investigación. 20. Preparación del material necesario. 21. Preparación de los medios de cultivo necesarios. 22. Elaboración del plan de muestreo y toma de muestra. 23. Preparación y adecuación de la muestra. 24. Realización de los ensayos (inoculación e incubación). 25. Identificación y/o recuento de los microorganismos implicados. 26. Expresión de resultados. 27. Comparación de los resultados con los prescritos. 28. Evaluación de la muestra.

Referencias:

- R.D. 1436/1992 de 27 de noviembre (B.O.E. 13 de enero de 1993). - R.D. 2275/1993 de 22 de diciembre (sólo corrección de entrada en vigor). - R.D. 1916/1997 de 19 de diciembre (B.O.E. 13 de enero de 1998).



TABLA DE CONTENIDOS P1. Identificación de material y equipos. _______________________________ 1 P2. Uso del microscopio. ____________________________________________ 3 P3. Preparación de muestras microscópicas y su observación. ____________ 5 P4. Uso del autoclave y otros métodos de esterilización y limpieza. ________ 7 P5. Análisis de microorganismos genéricos. ___________________________ 11 P6. Análisis de coliformes totales, coliformes fecales y E. coli. ___________ 17 P7. Análisis de Enterobacteriaceae totales. ____________________________ 21 P8. Análisis de estreptococos fecales. ________________________________ 23 P9. Análisis de Clostridium sulfito reductores. _________________________ 25 P10. Análisis de Salmonella y Shigella._________________________________ 27 P11. Análisis de Staphylococcus aureus. ______________________________ 31 P12. Control de superficies y de manipuladores._________________________ 35 P13. Control del aire.________________________________________________ 37 P14. Control del agua._______________________________________________ 41 P15. Control de los alimentos. ________________________________________ 43

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P1. Identificación de material y equipos. · Análisis de microorganismos genéricos. Objetivo : Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la preparación de