Bioquímica de los Alimentos, Junio 2011

1. Introducción Las peroxidasas son oxidorreductasas que catalizan la reacción entre H2O2 y diversos compuestos reductores y la mayoría son hemo proteínas que contienen hierro (III) protoporfirina IX, como grupo prostético. Las peroxidasas de plantas clase III (EC 1.11.1.7) participan en lignificación, el mecanismo de defensa de daños físicos o tejidos infectados, la degradación del ácido indol acético y la respuesta de estrés entre otros procesos fisiológicos. Dado que la peroxidasa es relativamente estable a altas temperaturas es usada como indicador de escaldado en los productos vegetales procesados. Además, la facilidad para medir su actividad ha permitido su uso como enzima modelo en el estudio de la estructura de la proteína y las reacciones y funciones de la enzima. Las raíces de rábano (Armoracia rusticana) son la principal fuente de la peroxidasa, y la más abundante isoenzima (HRP-C) es ampliamente utilizada en síntesis orgánica, junto con análisis enzimático, ensayos de quimioluminiscencia y terapia del cáncer. (1) Por lo que es de gran importancia saber cómo se mide la actividad enzimática de la enzima. En este trabajo se determinó la actividad enzimática de la peroxidasa de rábano; ocupando como sustrato guayacol, que es oxidado a un complejo coloreado de tetraguayacol en presencia de peroxidasa (fig.1), la velocidad de formación del color rojo ladrillo que se lee en espectrofotómetro puede ser utilizada como medida de la actividad enzimática de la enzima.(2)

Fig.1 Reacción utilizada para medir actividad enzimática de peroxidasa de rábano. El sustrato guayacol incoloro pasa a tetraguayacol de color rojo ladrillo.

2. Materiales y Métodos2.1 MaterialesPara la extracción de la enzima se utilizó agua destilada y una gasa como filtro.En el ensayo enzimático se ocupó H 2O2 6%,

solución de guayacol al 1% en 50% etanol 50% H 2O

, agua destilada, cubeta de plástico de 1 cm y el extracto enzimático de rábano preparado anteriormente.2.2 Metodologías2.2.1 Extracción de PeroxidasaLuego de pelar los rábanos estos fueron molidos en una licuadora a velocidad “frape”, con agua en una proporción 1 gr rábano: 1 ml H 2O, por 15 segundos. La pasta obtenida se filtró; se llevó 5 ml de filtrado a un tubo con tapa y se guardo en hielo para su posterior uso.2.2.2 Curva de progreso La solución de H 2O2 6% se llevó a 1%. Se preparó 5

ml de solución “A” compuesta por: 4,7 ml H 2O, 0,1

ml guayacol y 0,2 ml H 2O2. Para la primera curva de progreso con la enzima a cierta concentración, se diluyó el extracto de enzima con un factor de dilución de 10 (concentración 1); con 0,5 ml de esta

Determinación de la actividad enzimática de peroxidasa de rábano (Raphanussativus L.) a diferentes concentraciones de enzima.Diamara Vergara F.Laboratorio de Bioquímica de Alimentos, Universidad de Chile.

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solución y 2 ml H 2O se preparó la solución “B”. La sol. A se utilizó como blanco de la reacción y se llevó a cero en un espectrofotómetro a 470 nm. A continuación se agregó 1,5 ml de sol. A y 1,5 ml de sol. B en una cubeta, se agitó y se leyó en el espectrofotómetro en ese instante, luego se registró la absorbancia cada 15 segundos por 3 minutos. Este mismo procedimiento se efectuó para la segunda y tercera curva de progreso, en donde el factor de dilución del extracto de enzima fue 20(concentración 2) y 30 (concentración 3) respectivamente.3. ResultadosLas absorbancias (Abs) obtenidas para las diferentes concentraciones de enzimas se muestran en la tabla 1.Tabla 1 Absorbancias de tetraguayacol para las distintas

concentraciones de enzima peroxidasa.

Obteniéndose las curvas de progreso para cada concentración de la enzima. (fig.2)

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.50

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

f(x) = 0.054989010989011 x − 0.00948351648351646

f(x) = 0.0658901098901099 x − 0.0100659340659341

f(x) = 0.127604395604396 x + 0.00613186813186817

Curvas de Progreso

Concen-tración 1

Linear (Concen-tración 1)Tiempo (min)

Abso

rban

cia

Fig. 2 Curvas de Progreso para las diferentes concentraciones de peroxidasa de rábano, se aprecia linealidad en las curvas.

Con las pendientes de estas cuervas podemos calcular velocidad inicial (m), obteniéndose:m (conc. 1): 0,1276m (conc.2): 0,0659m (conc.3): 0,055Como el volumen total (VR) de la reacción fue 3 ml y el coeficiente de extinción molar (€) del completo tetrahidroguayacol es 7.019 M−1 cm−1 (3), ocupamos la siguiente fórmula para calcular la actividad enzimática (U):

U=m ∙VR ∙103

€Esta ecuación se multiplica por el factor de dilución total que fueron respectivamente 100, 200 y 300. Se obtiene finalmente:Conc 1: 5,454 UConc 2: 5,633 UConc 3: 7,052 U4. Discusiones y ConclusiónDe acuerdo a las actividades enzimáticas obtenidas para la misma enzima, se puede apreciar que U de la enzima con concentración 3 se distanció de los otros dos valores, esto pudo deberse por ocupar solución A preparada posteriormente a la que se ocupó para las dos primeras concentraciones de

Tiempo (seg)

(min) Abs Conc. 1

Abs Conc. 2

Abs Conc. 3

0 0 0,006 0,003 0,00315 0,25 0,03 0,008 0,00730 0,5 0,065 0,018 0,01545 0,75 0,102 0,033 0,02660 1 0,136 0,05 0,0475 1,25 0,171 0,068 0,05490 1,5 0,204 0,087 0,069

105 1,75 0,235 0,105 0,085120 2 0,264 0,123 0,101135 2,25 0,296 0,141 0,116150 2,5 0,325 0,157 0,13165 2,75 0,354 0,173 0,146180 3 0,38 0,188 0,157

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enzima, y también porque la primera lectura en el espectrofotómetro (t=0) de esta concentración se demoró unos segundos más en comparación con los dos primeros casos; esto llevó a tener un coeficiente de determinación (r2) en la regresión lineal de 0,991 mientras que en las demás concentraciones se acercaban a 1. Por lo que en este caso sería propicio eliminar este dato si es que se quiere sacar un promedio de las actividades enzimáticas para informar la actividad enzimática de la peroxidasa de rábano en el extracto original, (5,544 U).En el periodo de tiempo utilizado para medir las absorbancias (3 min) no se alcanzó el equilibrio de la reacción, esto se puede ver en fig.2 donde se aprecia claramente curvas lineales. Debido a esto, 3 minutos ocupados para realizar el análisis es un buen periodo de tiempo para determinar la actividad de la peroxidasa, pero esto no es un periodo de tiempo general ya que depende de la concentración de la enzima, pues a mayor concentración de enzima la reacción llegará al equilibrio más rápido por lo que se deberá hacer el análisis en un periodo de tiempo menor.Por lo anteriormente señalado la concentración enzima óptima para realizar este análisis es la concentración 2, ya que la concentración 1 tiene una leve curvatura pues al estar más concentrada llegara al equilibrio rápidamente.La reacción con guayacol es un buen método para determinar la presencia de peroxidasa y en este caso para medir la actividad de la enzima, por ser fácil de cuantificar y rápida.En este análisis de la actividad se trabajó con diferentes concentraciones de enzima pero con una misma cantidad de sustrato por lo tanto por los datos obtenidos no se pueden calcular los parámetros cinéticos como lo son Km y Vmáx ya que para esto se necesitan realizar diferentes curvas de progreso para diferentes cantidades de sustrato a concentración de enzima constante.

5. Bibliografía(1) Rodríguez-Cabrera, N.; Regalado, C.; García-Almendárez, B. Cloning, Heterologous Expression and Properties of a Recombinant Active Turnip Peroxidase. J. Agric. Food Chem. 2011.(2) Schmidt Hebbel, H.; Pennacchiotti Monti, I. Las enzimas en los alimentos, su importancia en la química y la tecnología de los alimentos. Fundación Chile. 1982. Pag. 66(3) Abugouch, L.; Horacio; M. Guía de Trabajos Prácticos. Bioquímica de Alimentos. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas. Universidad de Chile. 2011.