Lina María Ruiz Hincapié

Director: Nicolas Guiliani

Co-Director: Carlos Jerez

Facultad de Ciencias

Acidithiobacillus ferrooxidans

Bacteria Gram-negativa

Acidófila

Quimiolitoautotrófica

Importante en la biominería

EPS/ Fe3+

Sulfuro metálico

Formación de Biopelículas en A. Ferrooxidans

Cantidad y composición química del EPS

Adaptado

Fuente energética

T. Gehrke et al. Appl Env Microbiol (1998)

T. Rohwerder et al. Appl Microbiol Biotechnol (2003)

Formación de Biopelículas en A. Ferrooxidans

Estados durante el desarrollo de biopelículas

Unión

Producción de EPS

Formación de microcolonias

Maduración de la arquitectura

Dispersión de las bacterias de la biopelícula

Quorum Sensing (QS)

QS formación de la biopelícula de varias especies.

Unión

Producción de exopolisácarido

Formación de microcolonias

Maduración

Dispersión de las bacterias de la biopelicula

Baja densidad celular

Alta densidad celular

Vía de señalización del mensajero secundario diguanilato cíclico (c-di-GMP)

DGC

GGDEF

l-di-GMP

PDE-A

EAL

PDE-B

PDE

HD-GYP

Efectores PilZ Sitio I DGC

EAL degenerado FLeQ cNMP

GEMM

c-di-GMP

Biopelícula Motilidad

Blancos

2 GTP 2 GMP

Interconexión del QS y el c-di-GMP

Ueda y col., 2009

Camilli y Bassler, 2006

¿Qué se conocía sobre los mecanismos moleculares que intervienen en la

regulación de la formación de biopelículas en A. ferrooxidans?

Sistema funcional de QS AI-1 en A. ferrooxidans

afeI afeR Caja 30pb orf3

C. Farah et al. Appl Env Microbiol (2005)

ORFs Probable actividad enzimática

GGDEF/EAL DGC/ PDE

EAL PDE

PilZ type IV pilus assembly

ORFs codificando para proteínas implicadas en la vía del c-di-GMP en A. ferrooxidans

Hipótesis

La formación de biopelículas en Acidithiobacillus ferrooxidans podría ser regulada por el sistema QS de tipo AI-1 y por la transducción de señales mediante el mensajero secundario c-di-GMP.

Objetivo General

Estudiar el posible papel del sistema de QS de tipo AI-1 y la vía c-di-GMP en la regulación del desarrollo de la biopelícula en A. ferrooxidans.

Objetivos Específicos

Caracterizar mediante análisis bioinformáticos los componentes

moleculares de la vía c-di-GMP.

Evaluar la funcionalidad de algunas de las putativas diguanilato ciclasas (DGCs) y/o fosfodiesterasas (PDEs).

Analizar los niveles del mensajero secundario c-di-GMP en células conformando biopelículas sobre perlas de azufre versus células planctónicas.

Analizar el efecto de AHL y análogos de AHL en la formación de biopelícula sobre pirita.

Metodología c-di-GMP

Identificación y caracterización in silico de los componentes

moleculares de la vía c-di-GMP

Herramientas bioinformáticas

Análisis de la transcripción de

los ORFs involucrados en

la vía del c-di-GMP

Extracción de RNA

RT-PCR

PCR en tiempo real (qPCR)

Caracterización de la presencia del c-di-GMP y actividad PDE

específica

Extracto proteinico

Extracto nucleotidico

Detección del c-di-GMP (MS/MS)

Cuantificación del c-di-GMP (LC-MS)

Estudios funcionales en E. coli de las proteínas con

dominios GGDEF/EAL

Clonamiento molecular

SDS-PAGE y Western blot

Unión de Rojo de Congo

Detección del c-di-GMP (MS/MS)

Actividad PDE específica

Análisis del papel de la vía c-di-GMP en la regulación de la

formación de biopelícula

Extractos de nucleótidos desde

células conformando biopelículas

Cuantificación del c-di-GMP (LC-MS)

Caracterizar mediante análisis bioinformáticos los

componentes moleculares de la vía c-di-GMP.

Gen Probable actividad enzimática Dominios

(e-value)

AFE_0053 DGC/ PDE (841 aa) GGDEF (1e-42)

EAL (2e-44)

AFE_1360 DGC/ PDE (709 aa) GGDEF (4e-39)

EAL (3e-62)

AFE_1373

DGC/ PDE (665 aa) GGDEF (5e-33)

EAL (6e-72)

AFE_1379 DGC/ PDE (1057 aa) GGDEF (1e-37)

EAL (1e-44)

AFE_1852 PDE(228 aa) EAL (2e-23)

AFE_1172 type IV pilus assembly protein PilZ (118 aa) PilZ (1.2e-10

AFE_1374 type IV pilus assembly protein PilZ (185 aa) PilZ (4.6e-06)

AFE_2122 Phosphohydrolase (862 aa) HDc (8.6e-08)

AFE_2309 Phosphohydrolase(399 aa) HDc (1.9e-11)

AFE_2473 Phosphohydrolase(734 aa) HDc (1.8e-09)

ORFs codificando para proteínas implicadas en la vía del c-di-GMP en A. ferrooxidans

Arquitectura de proteínas implicadas en la vía c-di-GMP en A. ferrooxidans

EAL

GGDEF EAL

GGDEF EAL

GGDEF EAL

GGDEF EAL

PAS

GAF AFE_0053

AFE_1360

AFE_1373

AFE_1379

AFE_1852

GAF PAS PAS GAF

PAS PAC

PAC

PAC

Análisis comparativo de las secuencias de las probables proteínas DGCs y PDEs de

A. ferrooxidans

PdeA1

PdeA3

PdeA2

Dos

YahA

VCA0785

VieA

AFE0053

AFE1379

AFE1360

AFE1373

Dgc2

Dgc3

Dgc1

AFE1852

YhjH

PdeA1

PdeA3

PdeA2

Dos

Dgc2

Dgc3

Dgc1

PleD

AFE0053

AFE1379

AFE1360

AFE1373

VCA0785

Sitio I Sitio A

PdeA1

PdeA3

PdeA2

Dos

YahA

VCA0785

VieA

AFE0053

AFE1379

AFE1360

AFE1373

Dgc2

Dgc3

Dgc1

AFE1852

YhjH

PdeA1

PdeA3

PdeA2

Dos

Dgc2

Dgc3

Dgc1

PleD

AFE0053

AFE1379

AFE1360

AFE1373

VCA0785

Evaluar la funcionalidad de algunas de las putativas

diguanilato ciclasas (DGCs) y/o fosfodiesterasas

(PDEs).

Análisis transcripcional de los ORFs que codifican para proteínas involucradas en la vía c-di-GMP de

A. ferrooxidans ATCC 23270

RT_PCR qRT_PCR

GGDEF/EAL

PilZ

Análisis mediante espectrometría de masas del c-di-GMP sintetizado químicamente

MS, m/z 689 (rojo) corresponde a una masa nominal de 690 g/mol ([M-H]-)

MS/MS de la señal m/z 689, señales más intensas m/z 344 y m/z 538

Análisis de la presencia del mensajero secundario celular c-di-GMP en células de A. ferrooxidans.

Análisis de los niveles del c-di-GMP durante la curva de crecimiento de A. ferrooxidans crecido

en tiosulfato mediante HPLC acoplado a espectrometría de masas

Determinación de la presencia de una actividad fosfodiesterasa específica para el c-di-GMP en extractos proteicos totales de A. ferrooxidans

ATCC23270.

Extractos proteicos

totales

(1 mg)

Liberación de pNP

Absorbancia (410 nm)

Fe exp 0.214 ± 0.016

Fe est 0.201 ± 0.016

Tio exp 0.449 ± 0.032

Tio est 0.765 ± 0.013

5 mM bis-pNPP

Tio: tiosulfato, Fe: hierro exp: exponencial, est: estacionaria

SDS-PAGE de los extractos totales de proteínas de la cepa E. coli que sobreexpresan las probables proteínas con

dominios GGDEF/EAL de A. ferrooxidans.

220160120100

9080706050

AFE0053

0h 2h 4h 6h 0h 2h 4h 6h 0h 2h 4h 6h

AFE1360 AFE1373MW(kDa) CTR -

► ► ►► ► ►

►

E. coli BL21(DE3) E. coli TOP10

pET-21b

IPTG

pBADTOPO

Caracterización fenotípica de la expresión de los genes de A. ferrooxidans que codifican para probables proteínas

con dominios GGDEF/EAL en la cepa de E. coli BL21 (DE3) crecida sobre placas.

Caracterización de la incorporación de Rojo de Congo en E. coli que expresan los genes que codifican para probables proteínas con dominios GGDEF/EAL de

A. ferrooxidans.

■ sin IPTG

□ con IPTG

■ inducido con Arabinosa

E. coli TOP10

pET-21b

pBADTOPO

E. coli BL21(DE3)

Análisis de la presencia del c-di-GMP en extractos nucleotídicos de la cepa E. coli sobreexpresando

proteínas con dominios GGDEF y EAL de A. ferrooxidans.

Presencia del c-di-GMP

BLANCO n.d.

PleD::pET-42b/ BL21 + I +*

pET21b / BL21 + I n.d.

AFE0053::pET21b / BL21 + I +

AFE1360::pET21b / BL21 + I +

AFE1373::pET21b / BL21 + I +

pBADTOPO / TOP10 + A n.d.

AFE1379::pBADTOPO/ TOP10 + A +

n.d., no detectado; , presente; *, cantidad relativa 10 veces mayor

I, IPTG; A, arabinosa

Analizar los niveles del mensajero secundario c-di-GMP

en células conformando biopelículas sobre perlas de

azufre versus células planctónicas.

Análisis mediante HPLC acoplada a espectrometría de masas de los niveles del c-di-GMP en células de A. ferrooxidans conformando biopelícula sobre

diferentes fuentes energéticas.

Fuente Energética ng c-di-GMP/

mg proteína

Azufrea 382.9

Concentrado de Cobrea 168.6

Piritaa 49.9

Tiosulfatob 24.0

Sulfato de hierrob 2.2

a Células adheridas a sustratos sólidos b Células planctónicas en sustratos solubles

Azufre

•Se identificaron y caracterizaron in silico los componentes moleculares de la vía c-di-GMP.

•Los ORFs involucrados en la vía del c-di-GMP en A. ferrooxidans se transcriben.

•El mensajero secundario c-di-GMP está presente en la bacteria extremófila A. ferrooxidans.

•Se caracterizó la presencia de una actividad fosfodiesterasa específica para el c-di-GMP en A. ferrooxidans.

•Estudios funcionales de las proteínas con dominios GGDEF/EAL sobreexpresadas en E. coli, indico que son DGCs.

•La vía c-di-GMP está involucrada en la regulación de la formación de biopelícula en A. ferrooxidans .

C-di-GMP C-di-GMP

Ac. PDEg Ac. PDEg

Ac. DGCg Ac. DGCg

Fase estacionaria Fase exponencial

Tiosulfato

C-di-GMP C-di-GMP

Ac. PDEg Ac. PDEg

Ac. DGCg Ac. DGCg

Hierro Tiosulfato

Fase exponencial

C-di-GMP C-di-GMP

Ac. DGCg Ac. DGCg

Planctónicas Biopelícula

Azufre

Ac. PDEg Ac. PDEg

Analizar el efecto de AHL y análogos de AHL en la

formación de biopelícula sobre pirita.

Metodología QS Análisis del efecto de AHLs y análogos de AHLs en la formación de biopelícula

por A. ferrooxidans ATCC 23270 sobre pirita

Ensayo de unión a pirita

Análisis de la biopelícula (AFM, EFM)

Análisis del efecto de una mezcla AHL sobre la unión de Acidithiobacillus ferrooxidans a pirita.

Mezcla de AHL

3-OH-C10-AHL

3-OH-C12-AHL

3-OH-C14-AHL

3-OH-C16-AHL

3-oxo-C10-AHL

3-oxo-C12-AHL

3-oxo-C14-AHL

3-oxo-C16-AHL

Mezcla de AHL [3.3 M] disminuye la unión de Acidithiobacillus ferrooxidans a la pirita en un 42 % (■ 30.4 ± 7.6), CTR ( 52.2 ± 10.1).

Análisis del efecto de análogos de AHL sobre la unión de Acidithiobacillus ferrooxidans a pirita.

4-phenyl-3-oxo-HSL (●)

CTR ()

Análogos de AHL Adherencia (%)

Control sin análogos de AHL

39.4 ± 10.1

3-sulfonilamida-C8-HSL

47.1 ± 11

4-bromo-3-(bromometileno)-

furanona

49.9 ± 3.5

p-bromo-3-fenil-HSL

55.4 ± 9.7

SO2

Análisis del efecto de una mezcla de AHLs en el desarrollo de biopelícula en A. ferrooxidans mediante microscopía de epifluorescencia.

5 µm

Adherencia Microcolonia Monocapa

•En células crecidas en azufre versus las crecidas en sulfato de hierro

durante la fase estacionaria, se induce la expresión del gen afeI que

codifica para la sintasa de AHLs correlacionándose con una mayor presencia de C12-AHL y C14-AHL (Farah y col., 2005)..

•A su vez, éstas moléculas adicionadas exógenamente a células de

A. ferrooxidans aumentan la formación de biopelícula en azufre (González, 2010; Tesis de Doctorado Sigde Mamani).

•Por otro lado, una mezcla de AHLs, disminuyó la adherencia de

A. ferrooxidans a los granos de pirita y la formación de biopelícula (esta tesis).

•Todo esto nos ha permitido concluir que el sistema de QS de tipo AI-1

regula la formación de biopelícula en A. ferrooxidans ATCC23270.

Conclusiones

Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270 posee una vía funcional de señalización mediante el mensajero secundario diguanilato cíclico (c-di-GMP). Esta vía está involucrada en la respuesta al sustrato energético y en la regulación del desarrollo de biopelícula de A. ferrooxidans.

El sistema de QS de tipo AI-1 de A. ferrooxidans ATCC 23270, está involucrado en la regulación del desarrollo de la biopelícula de A. ferrooxidans sobre pirita.

Perspectivas

Proteínas bifuncionales actividad DGC y PDE proteínas con los

dominios GGDEF/EAL de A. ferrooxidans ATCC 23270 podrían presentar

actividad PDE.

Indagar si existen algunas condiciones experimentales que favorezcan que

AFE0053, AFE1360, AFE1373 y AFE1379 actúen como PDEs.

Cuantificar el mRNA de los genes que codifican para proteínas con los

dominios GGDEF/EAL mediante qPCR o experimento de microarreglos de

DNA comparando las diferentes fases del crecimiento bacteriano, con

diferentes sustratos energéticos y en células planctónicas versus células

conformando biopelículas .

Correlacionar el número de copias de mRNA de los genes que codifican

para proteínas con dominios GGDEF/EAL con la medición de los niveles de

proteína.

Perspectivas Interconexión del sistema de QS y la vía

c-di-GMP en A. ferrooxidans

S○ fase estacionaria C12-AHL y C14-AHL inducir la

formación de biopelícula.

Biopelícula sobre S○ c-di-GMP

¿Tienen C12-AHL y C14-AHL la capacidad de inducir actividad DGC

o inhibir actividad PDE?

¿Tiene la mezcla de AHLs la capacidad de inhibir actividad DGC o

activar actividad PDE?

Para tratar de contestar estas preguntas, nuestro laboratorio

planifica realizar ensayos de qPCR y microarreglos de DNA.

Publicaciones González A., Bellenberg S., Mamani S., Ruiz L., Echeverría A., Soulère L., Doutheau A.,

Demergasso C., Sand W., Queneau Y., Vera M., Guiliani N. 2013. AHL signaling molecules with a large acyl chain enhance biofilm formation on sulfur and metal sulfides by the bioleaching bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans. Appl Microbiol Biotechnol. 97(8):3729-3737.

Ruiz L.M., Castro M., Barriga A., Jerez C.A., Guiliani N. 2012. The extremophile Acidithiobacillus ferrooxidans possesses a c-di-GMP signalling pathway that could play a significant role during bioleaching of minerals. Lett Appl Microbiol. 54(2):133-139.

Castro M., Ruiz L.M., Barriga A., Jerez C. A., Holmes D., and Guiliani N. 2009. C-di-GMP pathway in biomining bacteria. Journal of Advanced Materials Research. 71-73:223-226.

Ruiz L.M., Valenzuela S., Castro M., González A., Frezza M., Soulère L., Rohwerder T., Queneau Y., Doutheau A., Sand W., Jerez C. and Guiliani N. 2008. AHL comunication is a widespread phenomenon in Acidithiobacillus ferrooxidans species and seems to be involved in mineral-adhesion efficiency. Hydrometallurgy. 94:133-137.

Publicaciones Ruiz L.M., Sand W., Jerez C. A. J. and Guiliani N. 2007. C-di-GMP pathway in

Acidithiobacillus ferrooxidans: analysis of putative diguanylate cyclases (DGCs) and phosphodiesterases (PDEs) bifunctional proteins. Journal of Advanced Materials Research. 20-21:551-555.

Ruiz L. M., Gonzalez A., Frezza M., Soulere L., Queneau Y., Doutheau A., Rohwerder T., Sand W., Jerez C. A., and Guiliani N. 2007. Is the quorum sensing type AI-1 system of Acidithiobacillus ferrooxidans involved in its attachment to mineral surfaces? Journal of Advanced Materials Research. 20-21:345-349.