Parte III. Monitoreo del proceso de purificación

A. Determinación de la concentración de proteínas

Cuantificación por Bradford

Extracción y precipitación

PurificaciónDeterminación

pureza y rendimiento

Monitoreo del proceso de purificación

Para obtener el rendimiento y grado de pureza debemos conocer la cantidad de proteína total en cada muestra obtenida durante el proceso de purificación.

Rendimiento: medida de la actividad biológica existente después de cada paso de purificación. Se expresa como porcentaje.

Grado de pureza: mide el incremento en pureza a lo largo del proceso, y se obtiene:

Actividad específica de cada paso/ actividad específica del paso inicial de purificación

Proteína total: cantidad de proteína presente en una fracción. Se obtiene determinando la concentración de proteína en una alícuota multiplicándola por el volumen total de la fracción.

Conocer estos parámetros permite determinar el éxito de un protocolo de purificación de proteínas

¿Qué representa el 100%?

= La actividad del extracto inicial

Necesitamos:

a) Determinación de la cantidad de proteína de interés (LDH)

• Propiedades espectroscópicas

• Detección por fluorescencia

• Unión a fluoróforos

• Ensayo enzimático

b) Determinación de la cantidad total de proteína

La purificación se mide como un incremento en la actividad específica.

Actividad total vs actividad específica

Actividad total: Actividad enzimática de cada fracción. Se obtiene midiendo la actividad enzimática de una alícuota y multiplicándola por el volumen total de la fracción. Se expresa en:

Actividad específica: este parámetro se obtiene dividiendo la actividad total por la proteína total presente en la fracción. Se expresa en:

µmoles de producto formado/min = Unidades (U)

Mayor actividad específica

Monitoreo del proceso de purificación

Cuantificación de proteínas

Métodos de Absorción

Absorción intrínseca

Absorbancia a 280nm

Métodos Colorimétricos

Formación de derivado químico

Biuret Lowry BCA

Unión de colorantes

Bradford

Métodos Fluorométricos

Emisión de luz

O-ftaldehído

Sensibilidad

Determinación de la cantidad de proteína

Método Bradford

Fundamento: Se basa en el cambio de color del colorante Azul Brillante de Coomassie G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteína. El compuesto interactúa con aminoácidos básicos (Arg, Lys, His) y aromáticos (Trp, Tyr y Phe) en condiciones ácidas. La unión a estos residuos cambia el máximo de absorción del colorante, de 465 a 595nm.

El colorante tiene 3 formas:

• Forma catiónica (470 nm)

• Forma neutral (650 nm)

• Forma aniónica (595 nm)

Absorbancia a 280 nm Bradford

Ventajas • Simple y rápido• No destruye proteínas

• Muy sensible (1-15 ug/mL)• Posee alto ε

Desventajas • Interferencia de otroscompuestos que absorben a 280nm

• Requiere proteínas puras• Requiere la presencia de

residuos Tyr y Trp

• Muestra interferencias con detergentes

• El colorante se une a las celdas de cuarzo

Cálculo de concentración • Requiere coeficiente de extinción molar (ε)

• Curva patrón

Características principales del método Bradford

Pasos a seguir en la práctica

Preparación de curva estándar de BSA [BSA] = 0.1 mg/mL

Cuantificación por Bradford

Curva estándar

Medición Absorbancia

muestra

Cálculo de concentración

Donde:

b = ordenada al origen

m = pendiente

F = factor de dilución

Diluciones…

• Seriadas

• No seriadas

Seriadas: sucesión de diluciones con incrementos progresivos y regulares. Proporcional

No Seriadas: sucesión de diluciones con incrementos progresivos, no regulares, en una proporción desconocida

Ejemplo: preparar 750 uL de una dilución 1:10 de HCl a partir de HCl comercial

10/1 = 10 (F), entonces 1 parte de HCl + 9 de H2O

750 uL/ 10 = 75 uL 75 uL HCl + 675 uL de H2O

Pasar la dilución 1:10 a una concentración 1:30

30/10 = 3 (F), entonces 1 parte de HCl 1:10 + 2 partes de H2O Requiero 600 uL

600 uL/ 3 = 200 uL 200 uL HCl 1:1 + 400 uL de H2O