PARTE V Métodos de propagación y conservación de germoplasma

161Biotecnología y Mejoramiento Vegetal

PARTE VMétodos de propagación y

conservación de germoplasma

162 OLMOS, Sofía; LUCIANI, Gabriela; GALDEANO, Ernestina


V.-Capítulo 1

Micropropagación

Olmos, Sofía; Luciani, Gabriela;Galdeano, Ernestina

1 Introducción

La micropropagación consiste en la pro-pagación de un genotipo a gran escala a tra-vés del empleo de técnicas de cultivo de teji-dos. El cultivo es así una herramienta muy útilen los programas de mejoramiento, ya quetiene el potencial de producir plantas de cali-dad uniforme a escala comercial, a partir deun genotipo selecto y con una tasa de multi-plicación ilimitada.

Esto es posible gracias a la propiedad detotipotencia que tienen las células vegeta-les; esto es la capacidad de regenerar unaplanta completa cuando están sujetas a losestímulos adecuados. Así, las célulassomáticas de cualquier tejido podrían formartallos, raíces o embriones somáticos de acuer-do con la competencia que posean y al estí-mulo que reciban.

Esta regeneración ocurre en fases conse-cutivas: la fase de desdiferenciación, dondelas células se vuelven competentes para res-ponder ante cualquier estímulo organogénicoo embriogénico; la fase de inducción, don-de las células se determinan para formar unórgano o embrión, y la fase de realización,donde se forma el órgano o embrión pro-piamente dicho. Estas fases están directa-mente afectadas por el balance hormonal delmedio de cultivo, por lo cual la optimizaciónde los protocolos de regeneración debe rea-lizarse teniendo en cuenta los requerimien-tos intrínsecos de cada genotipo en cada fasedel cultivo. Así, en general, puede decirse queel proceso de desdiferenciación generalmen-te es promovido por una auxina, la fase deinducción por un balance hormonal específi-co del órgano o embrión a formarse y la fasede realización, por una disminución de la con-centración hormonal en el medio de cultivo.

2 Etapas de la micropropagación

La regeneración de plantas in vitro pre-senta cuatro etapas principales: 1) estableci-

miento del cultivo, 2) desarrollo y multiplica-ción de vástagos, 3) enraizamiento y 4) acli-matación de las plántulas. Generalmente, lasetapas de enraizamiento y aclimatación pue-den combinarse en condiciones ex vitro. Enalgunos casos tiene importancia consideraruna etapa previa (Etapa 0), que es la etapade preparación de los explantos para el es-tablecimiento.

• Etapa 0: Preparación del material ve-getal

El empleo de explantos que se encuen-tran expuestos a bajos niveles de patógenospuede resolver el problema de la contamina-ción por hongos y bacterias durante el esta-blecimiento del cultivo in vitro. Los factoresque influyen sobre la calidad del explanto son:1) El tipo de órgano que sirve como explanto,2) la edad ontogénica y fisiológica del mis-mo, 3) la estación en la cual se colecta elmaterial vegetal, 4) el tamaño y 5) el estadosanitario general de la planta donante.

La planta donante debe elegirse sobre labase de una selección masal positiva para lascaracterísticas agronómicas deseables. Unavez seleccionados los individuos, es precisodefinir el tipo de explanto a establecer encondiciones in vitro. En general, los órganosjóvenes o bien rejuvenecidos son los que tie-nen mejor respuesta en el establecimientoque los obtenidos a partir de materiales adul-tos.

Se recomienda colectar explantos prima-rios a campo durante la estación primaveraly estival, cuando existe una brotación activade las yemas, ya que el empleo de yemas enestado de dormición ocasiona serios proble-mas de contaminación.

A fin de lograr explantos de óptima cali-dad es conveniente hacer crecer las plantasdonantes por un tiempo mínimo en condi-ciones de invernáculo. De esta forma es posi-ble incidir directamente sobre el estado sani-tario y la calidad de los explantos medianteel control de la intensidad lumínica, tempe-ratura y reguladores de crecimiento. Para es-pecies ornamentales tropicales ysubtropicales se recomienda mantener lasplantas donantes en condiciones de alta tem-peratura (25ºC) y baja humedad relativa(75%), a fin de reducir la proliferación depatógenos.


Los procesos morfogénicos de floración,dormición y bulbificación son controlados porel fotoperíodo y la temperatura. Controlan-do estos factores también es posible obte-ner plantas donantes y explantos más ho-mogéneos durante todo el año. Pueden apli-carse además pretratamientos con regulado-res de crecimiento a las plantas donantes,así como también a los explantos mismos.En especies leñosas suele utilizarse comopretratamiento la inmersión de los explantosprimarios en soluciones con citocininas a finde inducir la brotación de yemas.

• Etapa 1: Establecimiento del cultivoEl objetivo de esta etapa es establecer

cultivos viables y axénicos. El éxito está de-terminado por la edad de la planta donan-te, la edad fisiológica, el estado de desarro-llo y el tamaño del explanto. En esta etapalos principales procesos a controlar son laselección, el aislamiento y la esterilización delos explantos.

Los materiales que demuestran tenermayor capacidad regenerativa son los obte-nidos de tejidos meristemáticos jóvenes, seanyemas axilares o adventicias, embriones osemillas en plantas herbáceas y aquellos teji-dos meristemáticos que determinan el creci-miento en grosor, como el cambium en lasplantas leñosas. En este sentido, es impor-tante señalar que el empleo de yemas ad-venticias (también llamadas yemas formadasde novo) está asociado con una mayor pro-babilidad de ocurrencia de variantessomaclonales respecto de los sistemas depropagación, basados en la regeneración apartir de yemas axilares o embrionessomáticos.

La obtención de cultivos axénicos puedelograrse trabajando tanto sobre aspectospreventivos como curativos. Una acción pre-ventiva la constituye el empleo de métodosde verificación de patógenos en losexplantos. Esto puede realizarse medianteanálisis específicos para las enfermedades delcultivo, tales como DAS-ELISA o PCR, análisisgenerales para patógenos cultivables comoel empleo de medios de cultivo para el creci-miento de bacterias y hongos y métodosespecíficos para la detección e identificaciónde patógenos intracelulares como virus,viroides y bacterias. La realización de estos

análisis directamente sobre las plantas do-nantes, previo establecimiento, presenta dosventajas. En primer lugar, el empleo de teji-dos maduros permite visualizar los síntomasmás marcados de la enfermedad; en segun-do lugar, la carga de patógenos es mayor ypor lo tanto la precisión del sistema de de-tección aumenta. Por otro lado, las plantasenfermas pueden tratarse con técnicas ade-cuadas para la eliminación de patógenoscomo la termoterapia, la quimioterapia a tra-vés de la aplicación de antibióticos, desinfec-tantes, antivirales y el cultivo de meristemas.

La desinfección superficial incluye variospasos: el lavado de los explantos con aguacorriente, el empleo de etanol al 70% por 1minuto, seguido de concentraciones variablesde hipoclorito de sodio (0,5 a 1,5% de cloroactivo) con unas gotas de tensoactivos parafavorecer su penetración y actividad. Poste-riormente, los explantos deben ser enjuaga-dos al menos tres veces con agua destiladaestéril.

Algunos patógenos permanecen latentesy se expresan cuando son transferidos a unmedio de cultivo nuevo. En general, estospatógenos incluyen los patógenos superficia-les del material vegetal, los patógenosendógenos y los patógenos propios del ma-nejo en laboratorio. En la Etapa 1 tambiénpueden observarse infecciones por bacteriasy hongos asociados a trips que sobreviven alos tratamientos de esterilización y porpatógenos endógenos latentes dentro delsistema vascular, resultado de una esteriliza-ción inefectiva de los explantos. Estospatógenos latentes podrían manejarse me-diante el empleo de bacteriostáticos oantibióticos en el medio de cultivo.

• Etapa 2: MultiplicaciónEl objetivo de esta etapa es mantener y

aumentar la cantidad de brotes para los nue-vos ciclos de multiplicación sucesivos y poderdestinar parte de ellos a la siguiente etapade producción (enraizamiento, bulbificación,etc.). Es importante señalar que en esta eta-pa, cualquiera que sea la vía de regeneraciónempleada, es conveniente evitar la formaciónde callo para disminuir el riesgo de variaciónsomaclonal. En esta etapa, los medios decultivo, los reguladores de crecimiento comoauxinas, citocininas y ácido giberélico y las


condiciones de crecimiento juegan un papelcrítico sobre la multiplicación clonal de losexplantos.

Ambas vías de regeneración, organogé-nesis y embriogénesis, pueden darse en for-ma directa o indirecta. Esta última implica laformación de callo. En general, la organo-génesis conduce a la producción de vástagosunipolares que enraízan en etapas sucesivas,mientras que por embriogénesis somática seforman embriones bipolaresa través de etapas ontogé-nicas similares a la embriogé-nesis cigótica.

La organogénesis puededarse por inducción de yemasaxilares o adventicias. La in-ducción de yemas axilarescomprende la multiplicaciónde yemas preformadas, usual-mente sin formación de callo.La inducción de yemas adven-ticias comprende la inducciónde tejido meristemático loca-lizado mediante un trata-miento con reguladores decrecimiento, conduciendo a ladiferenciación del primordio ydesarrollo del vástago, estoúltimo generalmente en au-sencia del regulador de creci-miento que indujo laorganogénesis.

La principal desventaja delprimer método es que el número de yemasaxilares por explanto limita la cantidad devástagos. Esto se ve compensado, sin embar-go, por un aumento en la tasa de multiplica-ción con los sucesivos subcultivos. La forma-ción de yemas adventicias ofrece mayor po-tencial para la producción de vástagos, yaque la inducción de vástagos ocurre en sitiosdistintos al de los meristemas.

La embriogénesis somática es una vía másconveniente porque permite saltar las eta-pas de formación de yemas y enraizamientoregenerando plantas en una forma muchomás rápida y eficiente, disminuyendo ademásel riesgo de variación somaclonal. A su vez, ladisponibilidad de protocolos para la obten-ción de embriones somáticos es clave para laautomatización de la micropropagación y laconsecuente reducción de costos para su

implementación a escala comercial. Losbiorreactores son equipos que contienenaproximadamente 2 litros de medio de culti-vo líquido estéril y donde los embrionessomáticos pueden regenerar y madurar apartir de suspensiones celulares, sustentadospor la circulación permanente de nutrientesy de aire (Fig.1). Hoy en día, el empleo debiorreactores para la micropropagación a granescala está limitado por dos motivos críticos.

En primer lugar, el declinamiento de las líneascelulares (clones) por efecto de la variaciónsomaclonal y segundo, por los altos costosasociados con la conversión de estos embrio-nes somáticos en plántulas.

Las condiciones culturales en las cualescrece el explanto son el resultado de lainteracción de tres factores: el estado delexplanto o material vegetal, determinado enparte por el medio de cultivo, el recipientede cultivo y el ambiente externo o condicio-nes de crecimiento del cuarto de cultivo. Lacapacidad de respuesta de los explantos aun mismo medio de cultivo cambia con elnúmero de subcultivos, el tipo de explantosubcultivado y el método del repique. Poresto mismo, el medio de cultivo debeoptimizarse a fin de lograr la mayor tasa demultiplicación vegetativa. Comúnmente se

Figura 1: Embriogénesis somática en zanahoria. A partir de células del floemase obtienen los embriones somáticos que son un excelente sistema depropagación clonal. Los biorreactores permiten el cultivo a gran escala delos mismos.(Gentileza Dr. Miguel Pedro Guerra)


emplea como medio basal el medio MS com-pleto sugerido por Murashige & Skoog (1962)suplementado con 3% de sacarosa comofuente de carbono. A este medio se le adi-cionan además reguladores de crecimiento,tanto del tipo de auxinas como de citocininas.

La etapa de multiplicación generalmentecomprende dos períodos, la fase de induc-ción y la fase de multiplicación propiamentedicha. La primera implica, generalmente, elempleo de concentraciones elevadas de re-guladores de crecimiento (generalmente deauxinas más que citocininas) para favorecerla desdiferenciación. La segunda etapa re-quiere del empleo de un balance hormonaladecuado para favorecer los procesos de di-ferenciación y multiplicación celular. En estecaso, el sistema es más dependiente de re-guladores del tipo de las citocininas. En algu-nos casos, como ocurre en la formación deembriones somáticos, se requiere de una ter-cera y cuarta etapa, denominadas de madu-ración y de germinación respectivamente,cuya duración varía entre 1 a 2 semanas. Parala etapa de maduración se adiciona ABA (áci-do abscícico) al medio basal en rangos de 5 a20 micromolar, seguido del subcultivo a unmedio basal conteniendo AG (ácidogiberélico) en concentraciones de 0,1-1micromolar, cuyo fin es lograr la germinaciónde los embriones obtenidos.

Los tipos de auxinas (a) y citocininas (b) ylos rangos de concentración más empleadosse mencionan a continuación: a) IBA (ácido3-indolbutírico): 0,1-2 µM; 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético): 4-35 µM; AIA (ácido 3-indolacético): 0,1-2 µM ; ANA (ácidonaftalenacético): 1-5 µM; y, picloram: 1-10µM; b) BA (N6-benciladenina): 1-20 µM; CIN(cinetina): 0,1-1 µM; ZEA (zeatina): 1-10 µM;2ip (isopentiladenina): 1-5 µM; y, TDZ(tidizuron): 0,01-1 µM.

Los tipos de reguladores, sus combinacio-nes y rangos de concentraciones deben seroptimizados para cada especie, genotipo yetapa de multiplicación determinada. Loscultivos se incuban en luz a 27±2º C con 14horas de fotoperíodo e intensidad lumínicamoderada (100 µmol m-2 s-1).

La presencia de compuestos fenólicosoxidados se encuentra asociada con tejidosvegetales sometidos a situaciones de estrés,tales como aquel provocado por el dañomecánico producido durante el aislamientodel explanto de la planta madre.

Estos compuestos se encuentran en ge-

neral en las plantas en estado reducido y elataque de patógenos produciría su oxidacióny liberación. Esto inhibiría el crecimiento delos mismos, dañando, indirectamente, a losexplantos. Estas sustancias (quinonas,fitoalexinas y protectores de auxinas) sonmuy lábiles y fácilmente oxidables. Por estomismo, durante el establecimiento y multi-plicación in vitro es necesario emplear estra-tegias tendientes a disminuir el estrés de lasplantas y limitar al mínimo la producción yoxidación de los compuestos fenólicos. Paraello se emplean agentes absorbentes defenoles en el medio de cultivo, tales como elcarbón activado y la polivinilpirrolidona oantioxidantes como el ácido ascórbico, lamodificación del potencial redox con agen-tes reductores, la inactivación de lasfenoloxidasas con agentes quelantes o la re-ducción de su actividad o afinidad por elsustrato utilizando un bajo pH, o bien culti-vando in vitro en condiciones de oscuridad.Es recomendable además lograr que la tasade intercambio gaseoso entre los ambientesdel recipiente y externo sea óptima,evitándose la acumulación de CO2 y deetileno.

En este sentido, el sellado del recipientees importante, el intercambio gaseoso esmás limitado con el empleo de una tapa deplástico que con un film de polietileno exten-sible. La utilización de una tapa perforada contapón de gomaespuma es altamente reco-mendable (Fig. 2).

Los principales problemas que puedenpresentarse durante los sucesivos subcultivosin vitro son la vitrificación y la producciónde compuestos fenólicos por los explantos.

La vitrificación consiste en un proceso demorfogénesis anormal con cambios anató-micos, morfológicos y fisiológicos que produ-cen hojas de una apariencia vidriosa. Este fe-nómeno está regulado por dos factores cla-ve que son la humedad relativa y el poten-cial agua, y afecta a dos procesos fisiológicosfundamentales: la fotosíntesis y la transpira-ción. Debido a la disfunción metabólica aso-ciada, las plantas se vuelven heterótrofas ytranspiran excesivamente debido a un malfuncionamiento estomático y a cambios es-tructurales en las paredes celulares. La princi-pal consecuencia de la vitrificación es la bajasupervivencia de las plántulas obtenida du-


rante la aclimatación ex vitro. Por ello, es fun-damental conocer el rol de los distintos fac-tores que inciden negativamente sobre eldesarrollo morfogénico normal (autótrofo) invitro. Estos factores son el ambiente de cul-tivo, los componentes orgánicos einorgánicos del medio, los reguladores de cre-cimiento, la luz y la temperatura. Una bajahumedad relativa, elevada irradiación, la re-moción de la fuente de carbohidratos delmedio de cultivo y la defoliación de las plan-tas para estimular la formación de hojas nue-vas estimulan la fotosíntesis y otras activida-des metabólicas de las hojas en forma nor-mal. Otras estrategias para lograr un óptimocrecimiento implican el empleo de retar-dantes del crecimiento para estimular la for-mación de hojas nuevas después deltransplante. O bien, el empleo de altos nive-les de CO2 (antagonista del etileno) para es-tabilizar la vía de lignificación y prevenir lavitrificación a través de la inhibición de lahiperhidratación, la hipolignificación y la for-mación de aerénquima.

• Etapa 3: Enraizamiento y aclimataciónEn esta etapa se produce la formación de

raíces adventicias. En las especies herbáceases relativamente fácil mientras que en las

especies leñosas es complicado por su limita-da capacidad rizogénica.

El enraizamiento puede realizarse tantoen condiciones in vitro como ex vitro. En elprimer caso pueden emplearse varios tiposde sustratos y reguladores de crecimiento(auxinas) para promover la rizogénesis. Lossustratos incluyen: medio solidificado conagar, perlita y/o vermiculita humedecidas conmedio nutritivo o agua. En un medio solidifi-cado con agar, los nutrientes se reducen de1/2 a 1/4 de la composición original, y la sa-carosa se reduce a una concentración finalde 1-2%. Medios con baja concentración sa-lina, como el WPM (Lloyd & Mccown, 1980) yGD (Gresshoff & Doy, 1972), incrementan elporcentaje de enraizamiento de vástagosaxilares en plantas latifoliadas. El empleo deagar presenta ventajas y desventajas sobrela rizogénesis. Por un lado, el enraizamientode especies forestales en agar se favoreceríaal producirse una rizogénesis más sincrónicacomo resultado del contacto íntimo de lasestacas con el medio de cultivo. Sin embar-go, las raíces producidas por este método sonusualmente delgadas y no se forman raícescabellera. Adicionalmente, el empleo de agarestá asociado con la formación de callo en labase de las estacas, que conduce al estable-cimiento de conexiones vasculares interrum-pidas entre raíces y vástagos.

Comúnmente, a fin de proceder a suenraizamiento, los vástagos de buen tama-ño provenientes de la etapa de multiplica-ción y provistos de al menos 4-5 yemas, secolocan durante períodos cortos en solucio-nes con concentraciones elevadas de auxinas.La auxina más utilizada es el IBA (ácido 3-indolbutírico), que puede utilizarse a concen-traciones de 1-10 µM durante pocas horas.Alternativamente se pueden emplear nive-les más bajos de auxinas (0.1 a 1µM ), peromanteniendo la inducción por un períodomás prolongado (3 a 7 días). Luego los vás-tagos se transfieren a un medio de cultivobasal desprovisto de reguladores de creci-miento para permitir el desarrollo de las raí-ces. Aproximadamente 20 días después deltratamiento de inducción es posible la ob-tención de una adecuada cantidad de raícesfuncionales que permitan continuar hacia laetapa de aclimatación.

Es importante acentuar que el uso de

Figura 2: Plantas de tabaco creciendo in vitro en unrecipiente de vidrio con tapa metálica perforada y tapónde gomaespuma, que evita la acumulación de CO2, etilenoy excesiva humedad en el ambiente de cultivo.


auxinas a elevadas concentraciones es con-traproducente porque induce la formación decallo en la base de las estacas. Por ello, paracada cultivo es necesario optimizar un proto-colo de rizogénesis que minimice la forma-ción de callo y maximice la tasa de rizogénesisy supervivencia de las plantas.

El enraizamiento ex vitro permite que elenraizamiento y aclimatación se logren simul-táneamente y que raramente se forme calloen la base de las estacas, asegurando así unaconexión vascular continua entre el vástagoy la raíz. Sin embargo, el estrés asociado a laevapotranspiración acelerada de las plantasdurante las etapas iniciales del trasplantepuede reducir considerablemente la tasa desupervivencia. Por ello, es conveniente con-tar con instalaciones de invernadero o cáma-ras de crecimiento adecuadas para brindartemperatura y humedad relativa moderadas,que permitan lograr la rusticación de las plan-tas en forma progresiva. Bajo condiciones exvitro se utilizan diferentes sustratos, mezclasde tierra y arena y/o abonos, los cuales con-viene que estén debidamente esterilizados.

3 Propagación de especies leñosas

El empleo de clones en programas dereforestación genera al menos un 10 % deincremento en ganancia genética en relacióncon el empleo de plantas regeneradas porsemillas de árboles selectos. Sin embargo, lamáxima ganancia genética puede ser obte-nida mediante el empleo conjunto de pro-pagación sexual y agámica. La reproducciónsexual es importante para la introducción degenes nuevos, prevenir los efectos de laendogamia y el mejoramiento de caracterís-ticas controladas por efectos aditivos degenes. La reproducción asexual, por otrolado, permite la multiplicación de individuoso grupos de individuos seleccionados de unapoblación élite, que exhiben una significati-va ganancia genética debida a efectos noaditivos de genes.

Tradicionalmente, las especies forestalesfueron propagadas vegetativamente me-diante el enraizamiento de estacas, debraquiblastos en coníferas, así como tambiénpor injertos. La propagación por estacas deCryptomeria japonica (kiri), Populus (álamo)y Salix (sauce) ha sido llevada a cabo duran-

te siglos en Asia y Europa. Sin embargo, parala mayoría de los árboles propagados por es-tacas se observa una rápida pérdida de ca-pacidad de rizogénesis al aumentar la edadde la planta donante de las estacas. En estesentido, una de las principales ventajas de lamicropropagación es la capacidad potencialde desarrollar protocolos de multiplicaciónoptimizados para multiplicar árboles adultosque han demostrado ser fenotípicamentesuperiores.

3.1 Métodos de Micropropagación

Los trabajos pioneros en el cultivo de te-jidos cambiales de especies forestales condu-jeron, en el año 1940, a la formación de ye-mas adventicias en Ulmus campestris. Duran-te la década del 40 se publicaron logros adi-cionales en al producción separada de vásta-gos y raíces en especies latifoliadas. En 1950se publicó por primera vez la obtención deorganogénesis en coníferas, con la formaciónde vástagos a partir de callos de Sequoiasempervirens. En la década 1970-80 se ob-tuvieron las primeras plantas de álamo(Populus tremuloides) y Pinus palustris. Enambos casos la formación de plántulas se lo-gró vía organogénesis. Luego del año 1975la micropropagación de especies latifoliadasse realizó a través de la regeneración indirec-ta, pasando por una etapa de callo.

Actualmente, la multiplicación in vitro deconíferas y latifoliadas se logra a través detres vías, 1) brotación de yemas adventicias,2) producción de yemas adventicias y 3)embriogénesis somática.

La brotación de yemas adventicias em-plea ápices de vástagos, yemas laterales ymicroestacas. Es el principal método utiliza-do para especies latifoliadas. En las conífe-ras, la elongación de las yemas axilares a par-tir de braquiblastos de plantas adultas no hasido muy exitosa. En latifoliadas de clima tem-plado los mejores explantos los constituyenlas yemas y vástagos en activo crecimientomás que las yemas en estado de dormición.Los vástagos se colectan en primavera y aprincipios del verano a fin de obtener mate-rial con reducido nivel de contaminación. Al-ternativamente, las yemas en dormición pue-den ser colectadas y brotadas en condicio-nes ambientales controladas.


Para la inducción de vástagos, tanto engimnospermas como en angiospermas, serequiere el empleo de citocininas. Las másusadas son la N6-benciladenina (BA) y eltidiazurón (TDZ).

Los medios basales más usados paraangiospermas son el MS (Murashige & Skoog,1962) o el WPM (Lloyd & Mccown, 1980). Parael caso de gimnospermas, el empleo de me-dios reducidos en sales minerales y baja can-tidad de nitrógeno resulta mucho mejor queel empleo de un medio altamente salino ynitrogenado como el MS.

La inducción de yemas adventicias es elmétodo más empleado para gimnospermasy angiospermas. En este caso, las yemas seinducen directamente sobre el explanto engeneral sin previo pasaje por una etapa decallo. En general, cuanto más joven es el teji-do, tanto mayor es la respuesta a los trata-mientos que conducen a la organogénesis denovo. Los explantos más frecuentes sonembriones cigóticos maduros, seguidos decotiledones y epicótilos de plántulas. Gene-ralmente se utiliza BA a concentracionesmayores o iguales a 5 ppm como única fuen-te de inducción o en combinación con otrascitocininas. La adición de auxinas puede serbeneficiosa, aunque en coníferas se ha en-contrado que promueve la formación de ca-llo y reduce el proceso de organogénesis.

En algunos casos, como en Populus spp.,la formación de yemas adventicias se logra apartir de un callo originado a partir de tejidocambial.

El método llamado multiplicación median-te nódulos meristemáticos es un métodotambién utilizado para pino radiata y álamo.En este caso se obtiene básicamente un teji-do meristemático (no un verdadero callo)usando relaciones altas de auxina/citocininapara luego inducir la producción de vástagos.

La disponibilidad de protocolos víaembriogénesis somática para especies fores-tales es aún limitada. En las angiospermas losprimeros embriones somáticos se obtuvieronde Santalum album, donde sin embargo nofue posible la obtención de plantas comple-tas. Veinte años después pudieron lograrseplantas completas de abeto (Picea abies),una gimnosperma. En las gimnospermas losmayores éxitos se lograron empleando comoexplantos embriones cigóticos maduros e

inmaduros. En la mayoría de los casos losembriones se originan en forma indirecta apartir de callos embriogénicos o bien, direc-tamente, desde el explanto. En las coníferaspuede ocurrir un proceso de poliembrionía,previa formación de callo que conduce a unaalta tasa de multiplicación inicial. En general,los medios de cultivo más efectivos para es-tos fines contienen elevados niveles de salesy suministran nitrógeno tanto como NH4

+ yNO3

-. Las auxinas más comúnmente emplea-das en el medio de inducción son el 2,4-D(ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y el ANA (áci-do naftalenacético), en concentraciones ma-yores de 2 µM. En algunos casos es necesarioademás el empleo de alguna citocinina, ge-neralmente en concentraciones mayores a 1µM si se trata de BA y entre 0,1-1 µM en elcaso del TDZ.

3.2 Condiciones de cultivo

Los explantos jóvenes de especies leño-sas, particularmente angiospermas, a menu-do secretan al medio de cultivo polifenolesoxidados, visibles como pigmentos marronesy/o negros. Se observa también que en losexplantos de árboles adultos el problema seacentúa. Por ello se recomienda el empleode explantos primarios juveniles.

Los tipos de explantos más utilizadospara el establecimiento in vitro son los seg-mentos nodales de explantos juveniles, lasyemas axilares obtenidas por rejuvenecimien-to de plantas adultas, y los embrionescigóticos y plántulas obtenidas de semillas deorigen sexual.

La desinfección de los mismos se logramediante inmersión en etanol al 70 % (1 a 2minutos) seguido de una solución delavandina comercial conteniendo de 0,8 a 2,4% de hipoclorito de sodio durante 5-30 mi-nutos. En la mayoría de los casos se empleanagentes tensoactivos, tales como TritónÒ yTween20Ò, adicionados en la solución delavandina. En todos los casos los explantosson lavados finalmente varias veces con aguadestilada estéril.

Los medios basales más empleados sonel MS, formulado por Murashige & Skoog(1962), diluído a la mitad o a un cuarto de suformulación original o el WPM, formulado porLloyd & McCown (1981). Como medios de


multiplicación se emplean además el BTM(broadleaved tree medium, Chalupa, 1983)y el medio de Périnet y Lalonde (1983). Losreguladores de crecimiento más utilizados sonel ácido naftale-nacético (ANA) y labenciladenina (BA). También han sido efec-tivas auxinas como el ácido indol-butírico (IBA)y el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) ycitocininas como la 2- isopentil amino purina(2iP), cinetina (CIN), zeatina (Z) y tidiazurón(TDZ).

En general, los cultivos se incuban a 27±2ºC con 14 horas de fotoperíodo e intensida-

des lumí-nicas moderadas.En la Fig. 3 se muestran las etapas de la

micropropagación de plantas de paraíso gi-gante, Melia azedarach var. gigantea L. (Ol-mos et al., 2002).

3.3 Problemas asociados a lamicropropagación de especie leñosas

Es mucho más difícil propagar materialadulto que juvenil ya que los primeros sonrecalcitrantes, es decir, difíciles de regenerar.Sin embargo, aún en estos casos es posible

Figura 3: Etapas de la micropropagación en plantas de paraíso gigante, Melia azedarach var. gigantea L. (Olmoset al., 2002): A) Huerto semillero de paraíso gigante con ejemplares de seis años de edad, provincia de Misiones,Danzer Forestación S.A. Las semillas de los genotipos seleccionados fueron empleadas para generar una poblaciónde plantas donantes de explantos. B) Etapa 0, Preparación del material vegetal: plantas de origen sexual de 6 mesesde edad crecidas en condiciones de invernadero y utilizadas como donantes de meristemas. C) Etapa 1: Establecimientodel cultivo: vástagos desarrollados a partir de meristemas luego de 30 días sobre medio de establecimiento (Mediobasal de Murashige y Skoog, 1962 (MS) suplementado con 2,22 µM 6-bencil amino-purina (BAP) + 0,29 µM ácidogiberélico (GA3) + 0,25 µM ácido 3-indolbutírico (IBA). D) Etapa de Multiplicación: vástagos luego de 30 días sobremedio de multiplicación (medio MS suplementado con 2,22 µM BAP, estos vástagos fueron empleados comoexplantos para los subcultivos siguientes o para pasar a la etapa de enraizamiento. E) Explantos provenientes de laetapa de multiplicación con problemas de vitrificación y presencia de callo. En estos casos, el medio de multiplicaciónpara los cultivos subsiguientes fue modificado reduciendo la concentración de BAP a 0,44 µM. F) Vástago enraizadoen medio de MS con la concentración salina reducida a la mitad, suplementado con 9,89 µM IBA durante 2 días,seguido por el subcultivo en medio basal durante 30 días hasta estar listo para pasar a la etapa de aclimatación.

blanco y negro


extraer ex-plantos de mayor capacidadregenerativa mediante dos formas: 1) selec-cionando los tejidos más juveniles dentro deun árbol o 2) induciendo el rejuvenecimien-to del árbol donante antes de aislar losexplantos.

Para seleccionar el material más juvenil enuna planta adulta hay que considerar el fe-nómeno de topófisis. Este es un proceso porel cual el tipo de crecimiento de un nuevoindividuo está determinado por la posiciónque ocupaba en la planta adulta. Esto es oca-sionado por efecto del envejecimiento fisio-lógico e implica que los explantos másreactivos in vitro se encuentran en las yemasde las áreas basales del tronco y raíces.

A su vez, el rejuvenecimiento es un pro-ceso de reversión temporaria de las caracte-rísticas adultas que permite lograr materialvegetal en estado de juvenilidad. En gene-ral, a fin de contrarrestar los efectos debidosa la topófisis, se recomienda emplear tejidosjuveniles y un tamaño de explanto muy pe-queño.

La juvenilidad puede lograrse por dosmétodos. En primer lugar, mediante el em-pleo de órganos juveniles separados de plan-tas adultas, la utilización de estacasenraizadas o bien de brotes epicórmicos. Ensegundo lugar, mediante el rejuvenecimien-to de partes adultas, la iniciación de yemasadventicias y embriones (en este caso se lo-gra un rejuvenecimiento total por el inicio deun nuevo ciclo ontogénico), del injerto deyemas adultas sobre pies juveniles, de trata-mientos con reguladores de crecimiento(como citocininas como el BA), por la podasevera (recepado de árboles adultos) y a tra-vés del cultivo in vitro de meristemas.

Tanto los atributos de supervivencia acampo, como la tasa de crecimiento, elplagiotropismo y la susceptibilidad a enfer-medades de las plantas, tienen una correla-ción directa con la calidad de los vástagosdurante el cultivo in vitro. Un problema cruciala resolver en cada sistema de propagaciónes la calidad diferencial de las raíces de lasplantas regeneradas en relación con aque-llas obtenidas por semillas. Por ejemplo, lasplantas regeneradas de Pinus elliotti suelentener una raíz principal no ramificada y grue-sa. En cambio, las plantas obtenidas a travésde semillas tienen raíces más delgadas y de

mayor crecimiento lateral que permiten com-parativamente un mejor anclaje y una ma-yor resistencia a los vientos.

4 Propagación de especies herbáceas

La micropropagación de especies herbá-ceas está orientada a proveer material librede patógenos, propagar material selecciona-do por su mayor rendimiento o por su ma-yor resistencia a enfermedades y estresesambientales, conservar la diversidad especí-fica en bancos de germoplasma, obtenermaterial para estudios fisiológicos y genéticosy sentar las bases para la aplicación de técni-cas de ingeniería genética.

Existe una gran variedad de protocolos,desarrollados en función de la especie y delos objetivos de la propagación. Existen pro-tocolos generales para monocotiledóneascomo en el caso ciertos cereales (trigo, maíz,cebada, avena, arroz), pasturas (pastobermuda, festuca alta, raigrás, pasto llorón)y hortícolas (cebolla, ajo, puerro); protoco-los generales para dicotiledóneas que inclu-yen especies hortícolas (tomate, papa, pi-miento y zanahoria) y leguminosas forrajeras(alfalfa, maní, trébol blanco) y protocolospara especies modelo como Arabidopsis ytabaco.

En todos los casos, las formas de propa-gación son las mismas. Se emplean vías deregeneración por formación de yemasaxilares, yemas adventicias y embriogénesissomática. En los dos primeros casos, el siste-ma de propagación a través de la organo-génesis directa asegura la estabilidad genéticade las plantas regeneradas y se empleancuando el objetivo es la propagación clonala gran escala. La embriogénesis u organo-génesis indirecta, con formación de callo, seemplea en cambio para generar variabilidaden programas de mejoramiento.

En el caso de ajo y cebolla, por ejemplo,las etapas de la micropropagación incluyentanto la multiplicación de yemas axilares porel cultivo de meristemas, la formación direc-ta de yemas adventicias en explantos obte-nidos a partir de placas basales o umbelasinmaduras y la formación indirecta de yemasadventicias y/o embriones somáticos obte-nidos a partir de callos que provienen de dis-tintos tipos de explantos (meristemas, bro-


tes, placa basal ó raíces). En el caso de alfalfay otras leguminosas como soja y maní, lamicropropagación es llevada a cabo por la víade la embriogénesis somática, donde losembriones se obtienen utilizando tejidos ju-veniles (embriones, cotiledones y pecíolos)como explantos. En algunos casos como pas-to llorón (Eragrostis curvula) es posible laregeneración de plantas mediante embriogé-nesis, organogénesis y regeneración directaa partir de los explantos.

5 Lecturas Recomendadas

CASO, O. H. 1992. Juvenilidad, rejuvenecimiento ypropagación vegetativa de las especies leñosas.Agriscientia 9 (1): 5-16.

CHALUPA, V. 1983. Micropropagation of conifer andbrodleaved forest trees. Communicationes InstitutiForestalis Cechosloveniae 13: 7-39.

DEBERGH PC; PE READ, 1993. Micropropagation. EnMicropropagation. Debergh PC y Zimmerman RH eds,Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands:1-13.

EVANS, D.A.; SHARP, W.R.; BRAVO, J.E. 1984. Cell culturemethods for crop improvement. Handbook of Plant CellCulture 2: 47-68.KLOPFENSTEIN, N.B.; KERL, J.G. 1995. The potential ofbiotechnology in temperate agroforestry practices. In:

Agroforestry systems 32. Kluwer Academic Publishers.Netherlands: 29-44.LLOYD, G.; B. MCCOWN. 1981. Commercially feasiblemicropropagation of mountain laurel, Kolmia latifolia,by use of shoot tip culture. Combined ProceedingsInternational Plant Propagator Society 30: 421-427.

MURASHIGE, T.; SKOOG, F. 1962. A revised medium forrapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiol. Plant. 15: 473-497.

PÉRINET, P.; M. LALONDE. 1983. In vitro propagationand nodulation of the actinorhizal host plant Alnusglutinosa (L.) Gaertn. Plant Science Letters 29: 9-17.SCHENK, R.U.; HILDEBRANDT, A.C. 1972. Medium andtechniques for induction and growth of monocoty-ledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can JBot 50:199-204.

THORPE, T.A.; HARRY, I.S.; KUMAR, P.P. 1991. Applicationof micropropagation to forestry. En Micropropagation.Debergh PC y Zimmerman RH eds, Kluwer AcademicPublishers, Dordrecht, The Netherlands: 311-336.

ZIV M, 1993. Vitrification: morphological andphysiological disorders of in vitro plants. EnMicropropagation. Debergh PC y Zimmerman RH eds,Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands:45-92.

Documents

PARTE V Métodos de propagación y conservación de germoplasma