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PASANTÍA EN EL LABORATORIO DE PROTEÓMICA EN EL ÁREA
INSTRUMENTAL EN ESPECTROMETRÍA DE MASAS Y SÍNTESIS DE
PÉPTIDOS
LORENA REYES HEREDIA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR LICENCIATURA EN QUÌMICA
BOGOTÁ D.C
2015
2
IMPLEMENTACIÓN DE UNA PASANTÍA EN EL ÁREA DE PROTEÓMICA E
INGENIERÍA DE PÉPTIDOS
LORENA REYES HEREDIA
Proyecto de grado para optar al título de Licenciada en Química
Director
JULIO CESAR CALVO MOZO, QCO., DR. SC
Evaluador
ADIS AYALA, LIC. QUIM., M. BIOQUIM., DR. BIOTEC.
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR LICENCIATURA EN QUIMICA
BOGOTÁ D.C
2015
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RESUMEN
El desarrollo de la presente pasantía permite profundizar en la temática de la
Investigación Científica, la cual procura dar solución a diversos problemas en el campo de
la salud que aquejan a la sociedad actual. Teniendo en cuenta el enfoque de dicha pasantía
en el área de Proteómica e Ingeniería de Péptidos e influenciados de acuerdo a la
formación como docentes investigadores, se evidencia la importancia de implementar un
adecuado reconocimiento de las bases teóricas de la Síntesis Peptídica y de las aplicaciones
de la Espectrometría de Masas y de los protocolos para el correcto uso y empleo de los
equipos TETRAS PEPTIDE SINTETIZER y nanoUPLC Q-Tof .Además de ello, el manejo
de dichos equipos en la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, se encuentra
limitado debido a la ausencia de procedimientos operativos estándar (POE), los cuales
brindan beneficios como facilitar el acceso a investigadores interesados en su uso; de tal
manera, que con la realización de los mismos sean desarrollados y representen una
contribución como producto final al Grupo de Investigación.
INTRODUCCIÓN
Para situar la presente propuesta de trabajo de grado, planteamos la relación de la
realidad tecnológica del entorno Químico del mundo actual y sus tendencias, con la Misión
y la Visión de la Licenciatura en Química.
El Proyecto Curricular de Licenciatura en Química ha definido su Misión como
“Formar integralmente docentes – investigadores con actitudes de liderazgo y
competitividad que les permitan generar procesos de búsqueda constante de soluciones a
problemas inherentes a la disciplina de la Química, sus métodos y su enseñanza,
enmarcados dentro del concepto de equidad social”. Así mismo en su Visión, aunque sin
una meta temporal definida, la Licenciatura en Química pretende “Formar docentes
reflexivos y críticos de la realidad del país, capaces de generar aportes transformadores del
entorno. Mujeres y hombres libres, éticos, autónomos y creativos que decidan y justifiquen
su decisión; cuyo quehacer docente sea un verdadero compromiso profesional, laboral,
familiar y sociocultural”.
En años recientes, la biotecnología y la investigación en salud y en campos que
ataquen la crisis alimentaria ha suscitado un mayor interés a nivel mundial y el país no
puede desvincularse de esta tendencia. Por esta razón ha aumentado el interés por las
innovaciones y los avances tecnológicos. La investigación y la innovación han sido y serán
cada vez más importantes para encontrar soluciones a amenazas para la seguridad humana,
para aliviar la pobreza, acelerar el desarrollo y contribuir a la equidad social.
En este sentido, identificada la necesidad de formar recursos humanos para la
investigación que respondan a las necesidades de nuestro país, debemos preguntarnos en
qué somos ricos y, nos asalta una respuesta conocida desde nuestra infancia: “la
biodiversidad y riqueza natural”. Nuestro Proyecto Curricular y, en general la Facultad de
Ciencias y Educación, pretende formar Docentes-Investigadores, y una vía lógica para
fortalecer este perfil es el desarrollo de Trabajos de Grado en la Modalidad de
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Investigación; sin embargo, a veces hay limitaciones económicas y de tiempo que impiden
cumplir los objetivos planteados, generando problemas al estudiante y al tutor.
Una vía alterna es el Trabajo de grado en la Modalidad Pasantía en un Grupo de
Investigación, muy común en los países desarrollados para la formación de recurso humano
(researchfellowship, postdoctoral fellowship, etc), pero sin la obligatoriedad de la
producción científica, aunque su misma dinámica conlleva a esta.
1. PLANTEAMIENTO
1.1 PROBLEMA
Debido a la ausencia de Procedimientos Operativos Estándar (POE) para el correcto
manejo de los equipos con los que cuenta el Laboratorio de Proteómica e Ingeniería de
Péptidos de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, sede de Laboratorios
Macarena B; es necesario llevar a cabo el desarrollo de dichos procedimientos específicos,
de tal manera que sea una contribución para la Institución, no solo para beneficiar el
correcto desempeño y eficacia en el manejo de la maquinaria, sino además para la solicitud
de futuras certificaciones necesarias para el laboratorio.
1.2. JUSTIFICACIÓN
Las pasantías permiten poner en práctica todos los conocimientos teóricos-prácticos
adquiridos a lo largo de la carrera, lo que le hace que ésta sea fundamental para el
desarrollo profesional del estudiante, además permite conocer cómo se desarrolla la vida en
el área práctica, así como también para el aprendizaje de técnicas nuevas y actualizadas en
el área biotecnológica.
1.2.1. INTERÉS ACADÉMICO PARA EL APRENDIZAJE DEL ESTUDIANTE:
Especialización en diferentes áreas correspondientes a la carrera como el manejo de
los equipos y software empleados en la síntesis de péptidos. En la actualidad es muy
importante tener conocimiento como profesional de todas las ramas que tiene esta carrera
para tener un espectro más amplio de las aplicaciones del conocimiento adquirido durante
el proceso académico que desembocara en la búsqueda de empleo.
1.2.3. INTERÉS Y APORTE PARA LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO
JOSÉ DE CALDAS GRUPO DE INVESTIGACION PROTEOMA:
Las diferentes labores de las pasantes permiten dar solución a algunos problemas
del laboratorio, además de contribuir con Procedimientos Operativos Estándar (POE) del
nanoUPLC Q-Tof, que permitirán a la certificación en procesos biotecnológicos.
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1.3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.3.1. Conceptos generales
1.3.1.1. Aminoácidos
Son unidades monoméricas que conforman las proteínas, las cuales son polímeros
de elevado peso molecular. Estas unidades monoméricas se unen entre sí mediante un
enlace amida, o enlace peptídico. Son insolubles en disolventes no polares, pero sí lo son en
agua. Existen 20 tipos diferentes de aminoácidos, los cuales, estructuralmente llevan unido
un grupo carboxílico (-COOH) y un grupo amino (-NH2) al mismo átomo de carbono
tetraédrico (denominado carbono α) al cual, a su vez, se encuentra unido un átomo de
hidrógeno y una cadena lateral (R) (Lira Navarrete, 2007)
1.3.1.2. Enlace peptídico
Es una reacción de unión que se lleva a cabo entre dos aminoácidos que se da entre
el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino del otro, de tal manera que se forma
una amida mediante la pérdida de una molécula de agua (Lira Navarrete, 2007).
1.3.2. Definición de Proteómica
Es la nueva etapa en la Investigación biológica, que caracteriza la expresión de las
proteínas codificadas por un genoma y el establecimiento de sus propiedades funcionales y
estructurales (Mojica, Sánchez, & Bobadilla, S.A).
El proteoma (Término que fue acuñado en el año 1995 por Wasinger) de una célula
o de sus orgánulos permite obtener información sobre el conjunto de proteínas que se
expresan en dicha célula u orgánulo de acuerdo a unas condiciones fisiológicas que lo
caractericen en un momento determinado. El estudio comparativo del proteoma en distintos
estados patológicos, con sus estados saludables, permite la identificación de cambios
moleculares que pueden ser los causantes de dichos procesos patológicos. Así la
combinación de los aportes de la genómica y la proteómica, permiten el avance en la
industria farmacológica, minimizando los efectos secundarios (Cristobo Luaces, 2008).
1.3.3. Síntesis peptídica
La síntesis peptídica se podría definir como la formación química repetida de enlaces amida
con el fin de conectar funciones amina y carboxilos de L-α-aminoácidos adyacentes. De
acuerdo a ello, los L-α-aminoácidos cuentan con al menos dos funciones, lo cual requiere
que el enlace peptídico tenga lugar por las funciones deseadas, las demás deben encontrarse
"protegidas". De esta manera, la formación de enlaces amida, requiere la eliminación de
uno de los grupos protectores que bloquean la función para dar paso a la formación del
enlace peptídico. Además de ello, si se tiene en cuenta la función de las cadenas laterales de
los aminoácidos, se debe disponer de métodos realmente efectivos para llevar a cabo la
reacción de formación del enlace peptídico en la síntesis, la cual debe encontrarse
influenciada por una correcta manipulación de los grupos protectores (Andreu & Rivas,
1997). La síntesis peptídica se lleva a cabo en el Equipo TETRAS, presente en el laboratorio
de Proteómica e Ingeniería de Péptidos de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas
(ver Figura 1).
6
Figura 1. Equipo TETRAS. Síntesis de Péptidos con el que cuenta el Laboratorio de
Proteómica e Ingeniería de Péptidos. Universidad Distrital Francisco José de Caldas.
1.3.3.1. Grupos protectores
En la síntesis de péptidos, en indispensable contar con ciertos reactivos que por su
especificidad molecular, impedirán que el proceso de como resultado polimerizaciones o
contaminantes, que serán finalmente interferentes para la elucidación.
1.3.3.1.1. t-Butoxicarbonil (Boc)
Es uno de los grupos protectores que se emplea con gran frecuencia (ver Figura 2).
Figura 2. Grupo protector Boc, tomado de “Síntesis de péptidos” de E. Lira Navarrete,
2007, p. 7.
La forma común de desproteger el aminoácido Boc, es mediante una dilución con
ácido trifluoroacético (TFA) a temperatura ambiente (Lira Navarrete, 2007).
1.3.3.1.2. Fluorenil-9-metoxicarbonil (Fmoc)
Los aminoácidos Fmoc (ver Figura 3), se obtienen a partir de su respectivo cloruro
de acilo o alternativamente utilizando un éter de succinimida. Éste es muy estable en
presencia de ácidos, pero puede ser removido en condiciones básicas, empleando 20% de
piperidina en dimetilformamida (DMF) a temperatura ambiente.
CH3
O
CH3
CH3 O
O O
CH3
CH3 CH3
7
Figura 3. Grupo protector de los aminoácidos Fmoc, tomado de “Síntesis de péptidos” de
E. Lira Navarrete, 2007, p. 8.
1.3.3.2. Síntesis de péptidos en fase sólida
1.3.3.2.1. Técnica de Merrifield
Bruce Merrifield empleó en el área de la síntesis de péptidos una técnica que consistía en
ensamblar en un soporte líquido insoluble el residuo C-terminal del péptido a sintetizar, con
lo cual la cadena de aminoácidos iría creciendo anclada al soporte sólido mediante una
estrategia de elongación gradual. Posteriormente, el producto es desprendido del soporte, y
su purificación y caracterización se llevan a cabo en solución. Aunque las reacciones se
llevan a cabo en solventes orgánicos, el nombre de síntesis de péptidos en fase sólida, fue
dado por el hecho de que el péptido va creciendo anclado a un soporte (Figura 4) (Lira
Navarrete, 2007).
Figura 4. Proceso de la síntesis de péptidos en fase sólida, tomado de “Síntesis de
péptidos” de E. Lira Navarrete, 2007, p. 28.
ONH2
O
R
R
Cl
+Et3NH+
NH
O-
O
BOC R1
R
O
NH
CH2
R1
BOC
R
O
NH3
+
CH2
R1
NH
NH2
OH
OR1
O
R2
SnCl4
ClCH2OCH
3
FUNCIONALIZAR
ANCLAR
TFA DESPROTEGER
N N
HF ROMPER
PURIFICAR
R3N NEUTRALIZAR
R
O
NH2
CH2
R1
+NHBOC
OH
O
R2
R
O
NH
CH2
R1
NH O
R2
BOC
ACOPLAR
8
1.3.4. Métodos de purificación de los péptidos
1.3.4.1. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Esta técnica es útil para la determinación para la purificación y caracterización
de los péptidos, es capaz de separar el péptido de interés, de una mezcla formada durante
la SPPS, incluso si el péptido esperado se encuentra contaminado con otras
formaciones dadas por el mismo proceso. Las principales técnicas HPLC empleadas
para la separación de estas moléculas son:
1.3.4.1.1. Cromatografía por exclusión de tamaño
Este tipo de cromatografía se conoce como filtración en gel, aunque no es una técnica
efectiva para separar péptidos contaminantes del péptido de interés, a menos que haya una
diferencia importante en el tamaño. Pese a ser menos efectiva de las cromatografías
utilizadas, puede ser implementada en las primeras etapas del proceso de purificación
cuando se hace necesario deshacerse de reactivos como grupos protectores y reactivos de
acople.
1.3.4.1.2. Cromatografía de intercambio iónico
Es muy útil para separar mezclas de péptidos, particularmente cuando especies
cargadas han sido removidas de la secuencia esperada. Puede ser capaz de separar
especies que se diferencien por solo una carga neta. Para purificación de péptidos es
usualmente utilizada una columna de intercambio catiónico.
1.3.4.1.3. Cromatografía en fase reversa
Es el más utilizado para separar péptidos debido a que es generalmente superior a los otros
dos en velocidad y eficiencia. Ofrece un amplio rango de manipulación de
las características de la fase móvil y estacionaria para mejorar las separaciones peptídicas.
En primera medida la variación de los grupos funcionales de la fase estacionaria ya que los
ligandos funcionales que usualmente se encuentran en la fase estacionaria de RP-HPLC
con cadenas hidrocarbonadas de 8 o 18 carbonos; sin embargo, algunos contaminantes
como grupos protectores, agentes acoplantes no son exitosamente separados. Péptidos muy
hidrofóbicos también presentan problemas para purificarse, ya que las interacciones con
los compuestos acoplados a la fase estacionaria son muy fuertes. Para solucionar ambos
problemas mencionados, se ha optado por sustituir los hidrocarburos de 8 átomos
de carbono por cianopropil, el cual ha resultado muy eficiente para la purificación de los
casos expuestos.
Por otro lado el efecto de las sales en la fase móvil debido a la adición de sales a la fase
móvil, generalmente de 50 a 100 mM, en un rango de pH aproximado de 4-7, es
tradicionalmente utilizado para suprimir las interacciones de grupos silanol libres con
solutos positivamente cargados.
9
Finalmente el efecto de la elevación de la temperatura en la purificación pues los
tiempos de retención del péptido en la columna cromatográfica decrecen cuando se
incrementa la temperatura, mejorando la resolución del péptido. Aumentar la temperatura
previene posibles agregados del péptido y lo hace más soluble, lo que facilita su elución,
especialmente si el péptido a purificar es altamente hidrofóbica. Una desventaja del
incremento de la temperatura es que reduce el tiempo de vida de la columna.
Combinaciones entre las cromatografías antes descritas, pueden ofrecer una
purificación más eficiente. (MANT Colin T, 2007)
Figura 5. Equipo de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC Merck Hitachi), con
el que cuenta el Laboratorio de Proteómica e Ingeniería de Péptidos. Universidad Distrital
Francisco José de Caldas.
1.3.5. Espectrometría de masas
La espectrometría de masas es una herramienta muy apreciada para el análisis de péptidos sintéticos, dada su sensibilidad, velocidad y alto grado de especificidad molecular. Un espectrómetro de masas está formado por tres partes: La fuente de iones, el analizador y el detector. Las muestras a analizar son introducidas en la fuente de iones donde los componentes de la muestra son convertidos en iones en fase gaseosa. Estos iones son transferidos al analizador donde son acelerados y separados según su relación m/z utilizando diferentes principios físicos. Los analizadores se clasifican en 4 grupos de sectores (eléctricos y/o magnéticos) de cuádruplo (Q), de tiempo de vuelo (TOF) y de atrapamiento de iones (analizadores de resonancia ciclotrónica (ICR) y trampas iónicas (IT)) (Kicman AT, 2007) (figura 6).
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Las técnicas de ionización utilizadas para el análisis de péptidos son el bombardeo rápido
de átomos (FAB por sus siglas en inglés), electrospray (ESI) y desorción/ionización
mediante láser asistida por matriz (MALDI).
1.3.5.1. FAB
Primera técnica de ionización utilizada para la caracterización de péptidos sintéticos. La
muestra es ionizada debido al impacto que recibe por un rápido haz de partículas de xenón.
La elección de la matriz es determinante para el evento de ionización, toda vez que sirve
de mediador de la transferencia de energía hacia el analito y reduce el daño por radiación
que sufriría irremediablemente el analito en ausencia de la matriz, las matrices
comúnmente utilizadas en FAB para el análisis de péptidos sintéticos son glicerol,
tioglicerol y alcohol nitrobencílico.
1.3.5.2. ESI
Para la óptima producción de iones mediantes esta técnica, se induce a la formación
de gotas al hacer pasar las moléculas en solución por una boquilla en presencia de un
campo eléctrico. Dado que el analito se encuentra disuelto en una sustancia muy volátil,
los iones se forman cuando el solvente se ha evaporado. Ha sido particularmente utilizada
para caracterizar bibliotecas de péptidos.
1.3.5.3. MALDI
En esta técnica de ionización, los analìtos son cocristalizados, por lo general, con
una matriz aromática. Los iones se forman al irradiar un láser de nitrógeno de 337 nm
sobre la muestra. La matriz actúa como intermediaria para transferir energía del láser al
analito, además juega un papel fundamental en ceder protones al mismo. Las
matrices más utilizadas son la matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico, para péptidos
pequeños y para péptidos más grandes la matriz de ácido 2-(4-hidroxifenilazol) benzoico.
Todas estas técnicas de ionización son utilizadas para determinar el peso molecular del
péptido sintetizado con gran precisión. Es recomendable determinar el peso molecular del
producto antes de la purificación, de esta manera, es posible conocer el estado de
pureza del producto, si no existen mezclas de péptidos truncados contaminantes, o si la
desprotección del péptido ha sido satisfactoria (analizando el producto final, o
monitoreando etapas intermedias de la síntesis). En caso contrario, este análisis previo
por espectrometría de masas, puede dar información para volver a sintetizar el
péptido, cambiando las condiciones de desprotección y/o acoplamiento. Para tener una
mejor caracterización del péptido sintetizado, una vez determinado el peso molecular
del producto en crudo, se purifica y se vuelve a determinarse el peso molecular.
Además, gracias a la espectrometría de masas se puede monitorear la ciclación de los
péptidos por un puente disulfuro, pues es factible observar la pérdida de dos unidades de
masa debido a la formación de este tipo de enlace. También es posible establecer la
secuencia del péptido sintetizado, esto se lleva a cabo mediante la espectrometría de
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masas en tándem, en donde un ión producido previamente por una de las técnicas
antes mencionadas, es disociado por colisiones con un gas. Los iones fragmentados son
obtenidos a partir del rompimiento de los enlaces de la cadena peptídica, generando
iones con el N-terminal y con el C-terminal, y a partir de una serie completa de los iones
fragmentados la secuencia de aminoácidos puede ser deducida. (MOORE W.T, 1997)
Figura 6. Equipo de Espectrometría de Masas (Nano UPLC-Q-Tof), con el que cuenta el
Laboratorio de Proteómica e Ingeniería de Péptidos. Universidad Distrital Francisco José de
Caldas.
1.3.5.1. Shotgun proteomics
Es el uso de técnicas para la identificación de proteínas en mezclas complejas usando una
combinación de cromatografía liquida de alta resolución y espectrometría de masas. El
enfoque de este estudio es evaluar cada parte de la proteína, desde sus partes
fundamentales, tomando la muestra, cortándola por proteólisis con alguna enzima de
reconocimiento de aminoácidos específicos (tripsina) y finalmente realizando un análisis de
la mezcla de péptidos usando espectrometría de masas, que implica romper en fragmentos
más pequeños el péptido para poder realizar con éxito la medición. (Marcott E. 2007)
1.3.6. Programa de cálculo de la estructura de proteínas I-TASSER
La predicción, o el cálculo de la estructura de una proteína, es la predicción de su forma
secundaria o terciaria a partir de su estructura primaria, I-TASSER es una herramienta
bioinformática que permite predecir la información estructural de una secuencia proteínica
dada, en alta calidad y en formato 3D además de la función biológica haciendo la
deducción a partir de la secuencia de sus aminoácidos.
12
1.3.6.1. Como predice la estructura y función
En primera medida cuando se introduce la secuencia de la proteína, el servidor intenta
hacer una comparación con respecto a pliegues similares o estructuras supersecundarias, de
la base de datos, con un servicio llamado LOMETS.
Los LOMETS (local Meta-Threading-Server) son un método (meta-servidor) instalado de
manera local para la predicción de la estructura de la proteína. Genera estos modelos de
clasificación a partir de 9 programas de roscado. Las restricciones espaciales se combinan
teniendo en cuenta el consenso de las 20 mejores alineaciones de roscado. (S. Wu, Y.
Zhang 2007).
En la segunda etapa los fragmentos continuos sacados de las plantillas de AP se vuelven a
montar en los modelos de larga duración por réplica de intercambio de simulaciones de
Monte Carlo con las regiones no alineados de roscado (bucles principalmente) construidos
por modelización ab initio. En los casos en que hay una plantilla adecuada se identifica por
LOMETS, I-TASSER construirá el conjunto de estructuras de modelización ab initio. Los
estados de baja energía libre se identifican por SPICKER a través de la agrupación de los
señuelos de simulación.
SPIKER es un algoritmo de agrupamiento para identificar los modelos de un grupo de
proteínas señuelo, es decir que tiene por objeto la selección del mejor pliegue de baja
energía libre de la agrupación de señuelos generada por I-TASSER. (Y Zhang, J Skolnick
2004).
En el tercer paso, la simulación del fragmento del montaje se realiza de nuevo a partir de
los centroides del racimo de Spicker, donde los LOMETS y las estructuras de AP por TM-
ALIGN se utilizan para guiar las simulaciones. El propósito de la segunda interacción es
eliminar el choque estérico, así como refinar la topología global de los centroides del
racimo. Los señuelos generados en los segundos simulaciones se agrupan a continuación, y
las estructuras de energía más baja son seleccionadas. Los modelos finales se obtienen por
REMO que construye los detalles atómicos de los señuelos I-TASSER seleccionados a
través de la optimización de la red de enlaces de hidrógeno.
Figura 7. Protocolo del servidor I-TASSER para la predicción estructural de una proteína
(Y Zhang 2008)
13
Para la predicción biológica, el programa toma los modelos 3D y los compara con 3
bibliotecas independientes, en donde las proteínas están clasificadas como: (EC) enzima
conocida, (GO) vocabulario y sitios de unión al ligando. Los resultados finales de las
predicciones de la función se deducen del consenso de los principales modelos estructurales
con las puntuaciones de la función calculados en base a la puntuación de confianza de los
modelos estructurales I-TASSER, la similitud estructural entre el modelo y las plantillas
evaluadas por TM-score , y la secuencia identidad en las regiones estructuralmente
alineadas.
TM-SCORE es una forma de medir la similitud estructural de dos modelos de proteínas.
También mide la similitud del pliegue global y es menos sensible a las variaciones de
estructura locales. Este parámetro muestra valores de 0 a 1, en donde 1 indica la
combinación perfecta entre dos estructuras, mientras que las que se encuentra por debajo de
0,17 indican que no existe una relación entre la proteínas elegidas al azar. (Y. Zhang, J.
Skolnick 2004).
1.4 OBJETIVOS
1.4.1. General
Aplicar protocolos para la síntesis automatizada de péptidos y la identificación de
proteínas por espectrometría de masas.
1.4.2. Específicos
Reconocer las bases Teóricas de la Síntesis Peptídica y protocolos estandarizados para el
correcto uso del equipo TETRAS PETIDE SINTESIZER.
Realizar un debido entrenamiento en el manejo del equipo TETRAS de síntesis automática
de péptidos.
Reconocer las bases teóricas y la aplicación de la Espectrometría de masas en Proteómica.
Realizar un debido entrenamiento en el manejo del sistema nanoUPLC Q-Tof y su
aplicación en la identificación de proteínas para desarrollar una cartilla (POE) del equipo.
Llevar a cabo cálculo de estructura de proteínas.
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2. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
2.1. MATERIALES O RECURSOS
2.1.1. Equipos.
Balanza analítica (1).
Lector de ELISA (1).
HPLC Merck-Hitachi (1).
Programas para análisis de estructura de proteínas (1).
Liofilizador (1).
Sintetizador de péptidos TETRAS de AdvanceChemtech-Creosalus (1).
Sistema nanoUPLC Q-Tof MS de Waters (1).
2.1.2. Reactivos.
Fmoc-AA-OH
Reactivos de Acople (DIC, HDBT, TBTU, etc.)
Reactivos de acción solvente (DMF, piperidina)
Resina (HMBA)
2.2. UBICACIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO
2.2.1. Universidad Distrital Francisco José de Caldas Área de laboratorios.
Los laboratorios de Biología y Química son una dependencia adscrita a la Facultad
de Ciencias y Educación, lo cual se reglamenta por el Acuerdo 001 de Abril de 1997. Estos
laboratorios se encuentran ubicados en el ala occidental del Edificio de Laboratorios de
Biología y Química, Macarena B.
Los Laboratorios de Biología surgen del seno del programa de Licenciatura en
Biología en 1973, dentro de una amplia dinámica organizacional tanto administrativa como
académica, respondiendo a las exigencias sociales y educativas del país. Una de estas
exigencias ha sido el proceso de Acreditación previa en el segundo semestre de 2000.
Mediante el acuerdo 001 de Abril 04 de 1997 se reglamentan los laboratorios de la Facultad
de Ciencias y Educación de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, donde se
define que es un laboratorio, adscripción, personal de laboratorios, funciones del personal
de laboratorios, usuarios, etc. (Universidad Distrital, 2009).
2.3. PROCEDIMIENTOS
La pasantía se desarrolló en sesiones de tipo teórico y práctico:
15
2.3.1 Fase No 1. Teoría de la Síntesis de Péptidos y las aplicaciones en salud y otros
campos.
Las sesiones teóricas se llevaron a cabo por el profesor Julio Cesar Calvo, utilizando la
revisión bibliográfica de la síntesis de péptidos, y artículos relacionados con el trabajo del
grupo de investigación, en donde se hace énfasis en la creación de péptidos para la acción
inmunológica contra virus que atacan especies de arroz de gran importancia para la
asociación arrocera quien investiga de manera conjunta estos procesos biológicos con el fin
de mitigar problemáticas de los cultivos.
Además se desarrolló un estudio detallado del manual de funcionamiento del equipo, en
donde se trabajó de manera puntual en el método de calibración, partes fundamentales del
equipo, grupos protectores, tipos de aminoácidos, y el software de operaciones, que es el
que permite ajustar y evaluar los procesos.
2.3.2 Fase No 2. Entrenamiento en el manejo del equipo TETRAS de síntesis
automática de péptidos.
Se realizaron varias sesiones prácticas en donde se hizo de manera real un péptido lineal
con la secuencia SPLIHKEIKKRTK que corresponde a la proteína de dominio FHA que
tiene 277 residuos con la siguiente secuencia
“MSPEIALNTGQTTSILSPLIHKEIKKRTKKARHCISLPLLSSEHKSQTQMEAAVATPSLFSSPTPR
RPSSCLSLPPPCSSSYASNGAKLQQPRLQFVSQLTSRNSNGSGRRSISILSLRCSSSGTDSASSSATSE
RWVLEPAGDGDWRHIGYRVARPGGFQIASEAAVTVGRVPEQADIVLSVATAVSGTHARLEKKEG
SLLVTDLESTNGTYINERRLSPGFPTPIDPGSLLIFGDIHLAMFRVSKMVVDVPSDASGAEQEAAE
TAQVSAAAQQTN” de la especie de hoja blanca de arroz de “orysa sativa” trabajada por la
profesora Nubia adscrita al proyecto de la federación arrocera. Este se realizó por la forma
química Fmoc como se describe a continuación:
Inicialmente se prepararon los aminoácidos en solución diluyéndolos en los mismos
solventes con los que se trabaja la resina que corresponde a la dimetil formamida o dimetil
acetamina. Se pesó la cantidad de resina (RINK) y luego dentro del sintetizador se hincha
con DMF durante 15 minutos en tres ciclos. Siguiendo con el proceso se realiza el primer
lavado con DMF en 10 ciclos de 2 ml por 10 minutos.
Se ejecuta la desprotección inicial inyectando 2 ml de piperidina en DMF en 1 ciclo de 2ml
por 20 minutos. Luego se hace una purga corta inyectando 2 ml de piperidina 25% en DMF
en 1 ciclo por 20 min. Luego un lavado pre acople: en donde se inyecta 2ml de DMF por
10 ciclos de 2 min, seguida de una purga corta. Para el acople del aminoácido: se toma 1ml
del aminoácido 0,3M con los reactivos de acople correspondientes a 1ml de DIPEA 0,5M
y 1ml de HBTU o TBTU 0,25M durante 60 min en 1 ciclo, después se hace una purga
corta. Posteriormente se hace el Lavado interacople con 2 ml de DMF por 5 ciclos de 2
min. Se Repite el acople: 1ml del aminoácido 0,3M con los reactivos correspondientes a 1
ml de DIPEA 0,5M y 1ml de HBTU o TBTU 0,25M durante 60 min en 1 ciclo. Luego se
realiza un lavado post-acople con 2ml de DMF por 10 ciclos de 2 min. Finalmente se hace
el lavado final que implica un lavado de desprotección aquí se inyecta 2 ml de PIP en DMF
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por 3 ciclos de 2 min, finalmente se Inyecta 2 ml metanol para secar la resina por 3 ciclos
de 2 min. Para el clivaje se toma el protocolo dependiendo la secuencia de aminoácidos
(figura 8).
2.3.2.1. Protocolo de clivaje
Se manejó el siguiente protocolo de clivaje propio para la secuencia de aminoácidos
trabajado.
Figura 8. Protocolo de clivaje en la síntesis de péptidos
2.3.3 Fase No 3. Desarrollo de las bases teóricas de Espectrometría de masas y
Desarrollo de las bases teóricas de Proteómica.
Las bases teóricas se obtuvieron a partir del estudio de los diferentes trabajos que realizo el
grupo de investigación, además de ponencias a cargo del director del grupo Julio Cesar
Calvo. Para el reconocimiento del equipo en primera medida se desarrolló un estudio
detallado del manual del equipo, para explorar las generalidades de su funcionamiento,
luego se estudió en más profundidad el capítulo 8 del manual titulado Protein Lynx Global
Server (PLGS) para calcular los datos de la muestra, sus respectivos espectros y realizar
una comparación con la base de datos incorporada en el nanoUPLC Q-Tof.
¿Tiene el
péptido un
grupo Fmo en
el N-terminal?
Eliminar el grupo
Fmoc N-terminal
¿El péptido
contiene Arg
(Mtr) o un Tpr
protegida?
¿El péptido
contiene Cys
(Trt) o Met?
El péptido
contiene> 2
residuos de Arg
(MTR)
Clivaje:
95% TFA: 2,5% AGUA:
2,5% TIS
Clivaje:
94,5% TFA: 2,5% AGUA
Clivaje:
1M TMSBr/Tioanisol in
TFA con m-cresol/EDTA
Clivaje:
81,5%TFA: 5% TIOANISOL: 5%
FENOL: 5% AGUA: 2,5% EDTA 1%
TIS
SI
SI
SI
SI
NO
NO NO
NO
17
2.3.4 Fase No 4. Entrenamiento en el manejo del sistema nanoUPLC Q-Tof y su
aplicación en la identificación de proteínas.
Es importante resaltar que una de las limitaciones del trabajo fue la inhabilitación del
sistema de refrigeración con el cual opera correctamente el aparato, por lo que solo se
trabajó en el conocimiento real del software del equipo, con muestras pasadas con
anterioridad de la misma especie sintetizada previamente en el TETRAS.
De acuerdo a lo anterior lo inicial fue realizar una búsqueda de las bases de datos que se
encontraban en la siguiente dirección My computer/C/PLGS 2,4/Demodbs/sprot.fas_def/,
y de las que posiblemente estaban en óptimas condiciones para la operación. Luego se
realizó la búsqueda de los datos tomados de la especie de hoja blanca (oryza sativa) para
organizar todo el conjunto en una carpeta definida en el siguiente enlace My
computer/D/RHBVrice.PRO/Data/ que sirva para posteriores trabajos. Una vez
establecidas con claridad las ubicaciones de los datos y las bases, se empezó con el trabajo
en el software del equipo que se conoce como PROTEIN LYNX GLOBAL SERVER.
Aquí se inició abriendo el comando de Project Manager el primer pluging que se debe
configurar. Luego se creó un proyecto, y se especificó el sitio donde se guardaran los datos
dándole click al comando automation setup, en este punto se coloca la ubicación de las
carpetas que previamente se habían reconocido. Luego de esto se crea el método para el pre
procesamiento de los datos en otro pluging llamado Data Preparación aquí se especifica el
método a realizar en nuestro caso Electrospray MSE, y las condiciones bajo las cuales se
trabaja, que están dadas por el equipo, calibradas por default. Finalmente se guardan los
cambios. Otro de los plugings utilizados corresponde al Data Bank Admintool, aquí se
especifica la base de datos con la cual se trabajara y la ubicación de la misma, también se
realiza un proceso de randomizacion, necesario para que el software reconozca
correctamente la base de datos de interés. El último pluging corresponde a Workflow
Designer, en este se crea el trabajo a realizar con las especificaciones dadas por el equipo
que fueron seleccionadas por default, en este paso es fundamental incluir la base de datos
randomizada, con la cual se trabajaran todas las muestras, se guardan cambios y se finaliza
esa sección.
Después de este trabajo previo al análisis de datos, se dispone a crear un microttrite, es
decir, el conjunto de espacios en donde se deben introducir los datos de las muestras. De
manera continua se ponen los parámetros establecidos con anterioridad a cada muestra y se
coloca en marcha el software, después de un tiempo determinado este arroja los resultados,
dados por el número de proteínas, y los péptidos que la componen, los espectros de masas y
los datos de cada uno de los péptidos encontrados en comparación con las bases de datos.
De lo anterior se realizó un procedimiento operativo estándar POE que describe
detalladamente esta operación, y el cual será el sustento del futuro funcionamiento del
equipo.
18
2.3.4 Fase No 5.Teoría y entrenamiento en el programa I-TASSER para el cálculo de
estructuras de proteínas.
Se trabajó a partir del servidor I-TASSER evaluando el comportamiento de una proteína de
arroz de la cual se conocía el péptido lineal de secuencia SPLIHKEIKKRTK, se introdujo
la secuencia en la base de datos BLAST para determinar a qué proteína correspondía,
luego se introdujo en el servidor para la correcta predicción de la estructura.
3. RESULTADOS Y DISCUSION
3.1. Manejo del equipo TETRAS de síntesis automática de péptidos
Se realizó de forma correcta el péptido lineal según el protocolo del sintetizador TETRAS
conociendo el fundamento teórico del proceso y determinando la importancia de cada
compuesto en el adecuado procedimiento, aquí es clave resaltar que los aminoácidos deben
estar a una concentración de 0.3M para garantizar el éxito del acople de los mismos a la
resina, ya que es así como el equipo avala ese proceso, también deben estar disueltos en un
solvente apròtico, ya que estos permiten que la molécula se solvate con cargas positivas sin
interaccionar fuertemente creando puentes de hidrógeno.
Además se conoció el funcionamiento del software del equipo desde el cual se realiza toda
la síntesis. Es de suma importancia aclarar que para determinar si se sintetizo el péptido de
interés deben realizarse pruebas como identificación por espectrometría de masas o por
HPLC (figura 9).
19
Figura 9. Protocolo de manejo del equipo TETRAS PEPTIDE SINTETIZER.
3.2. Manejo del sistema nanoUPLC Q-Tof y su aplicación en la identificación de
proteínas.
Se determinó el funcionamiento del software protein lynx global server para el
procesamiento de los datos de una muestra de la especie orysa sativa corrida previamente,
de aquí se realizó el POE “procedimiento operativo estándar” (anexo 1) en donde se
evidencia el paso a paso del proceso. Es de gran importancia resaltar que para la proteína
analizada cMT1_RAT de peso 6001 Da se encontraron 8 péptidos con sus respectivas
secuencias presentes en la parte izquierda como se muestra en la figura 10.
20
Figura 10. Datos obtenidos para la muestra cMT1_RAT.
También es necesario entender el funcionamiento bajo el cual opera el equipo que hace
referencia a la shotgun proteòmica, para la interpretación de los fragmentos B y Y que
proporciona el espectro.
El equipo hace toda la secuenciación de la proteína desde el extracto en bruto, lo que
dificulta su análisis y como la masa de un péptido no es única, es decir dos péptidos con el
mismo aminoácido compartirán la misma masa, es necesaria la información sobre la
secuencia del mismo. Por lo tanto, el péptido es aislado en el espectrómetro de masas, por
lo general por colisión con moléculas de gas inerte (argón), para romperlo en fragmentos
más pequeños. Las relaciones de masa/ carga de los fragmentos se miden y la resultante
proporciona una huella dactilar referente a su secuencia peptídica especifica. Las rupturas
se hacen al azar bajo la lógica de fraccionar los aminoácidos adyacentes creando una
escalera de secuenciación en donde los péptidos difieren en tamaño por eliminación
sucesiva. Dependiendo de la forma en que se dé el rompimiento en el péptido se considera
que es Y o B ya que si la ruptura es entre el carbono del carbonilo y el nitrógeno de la
amida produce fragmentos de serie Y-B la diferencia es que uno queda con el carbono
terminal y el otro con la amina terminal. (Figura 10) (Marcott E. 2007)
Figura 11. Fragmentos correspondientes a series Y y B (Marcott E. 2007).
Lo anterior se puede evidenciar en el espectro de masas en donde se muestran 3 fragmentos
de serie Y y 4 de serie B.
21
Figura 12. Espectro de masas de la muestra cMT1_RAT.
3.3. Manejo del programa I-TASSER para el cálculo de estructuras de proteínas.
Inicialmente se determinó la secuencia de la proteína de interés, a partir del péptido
obtenido con el programa BLAST, este encuentra las regiones de similitud local entre las
secuencias, comparando nucleótidos o secuencias de proteínas en las bases de datos
(Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng
Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman 1997). A partir de esto se estableció que la
proteína correspondía al dominio FHA, que se encuentra en la especie orysa sativa
japonesa. Este dominio está asociado a una proteína de la cual se ha demostrado que
reconoce epítopos de fosfoferrina. Está presente en una amplia gama de proteínas en células
eucariotas, tales como quinasas, fosfatasas, factores de transcripción, proteínas de unión a
ARN, y las enzimas metabólicas. También se encuentra en un número de proteínas
bacterianas. Lo anterior sugiere que el conjunto de FHA es una medida fosfo-dependiente
para complejos de proteínas como mecanismo de regulación antigua y generalizada.
(Durocher D, Jackson SP 2002)
Figura 13. Datos arrojados por la base de datos BLAST de la proteína correspondiente al
péptido de interés
La secuencia fue enviada a I-TASSER donde se obtuvieron 5 posibles modelos
correspondientes a la proteína en del dominio FHA. En concordancia con el c-score, que es
22
un valor confidencial que estima la calidad de los modelos predichos en I-TASSER, se
eligió la mejor estructura, correspondiente al valor más cercano a 2 para este parámetro,
esto ya que el valor se calcula a partir de los parámetros de convergencia de las
simulaciones típicamente en el rango de (-5 a 2), donde el valor mas alto de c-score
significa un modelo con alta confiabilidad ( J Yang, R Yan, A Roy, D Xu, J Poisson, Y
Zhang 2015). En este caso el modelo tomado arrojo un valor de c-score de -3.49 que en
comparación con los demás es el más cercano al dato ideal.
Figura 13. Modelo del dominio FHA con c-score de -3,46 valor más cercano al dato de
confiabilidad.
3.3.1. Determinación de sitios de unión al ligando
Los sitios de unión al ligando, forman interacciones que pueden modular la actividad
biológica de la proteína, en muchos casos los ligando se pueden fiar en más de un sitio
sobre la proteína. En el caso del dominio FHA se determinaron los siguientes sitios de
unión a ligando como se muestra en la figura 14.
Figura 14. Proteína expresando los sitios de unión al ligando.
Aquí se evidencian 5 sitios claves de unión al ligando correspondientes a 2 péptidos, el
primero un mediador de proteínas de ADN, y puesto de control de daño 1, este es un
ligando péptido de (MET, GLU, ASP, THR, GLN, ALA, ILE, ASP). El segundo la serina /
treonina-proteína quinasa RAD53, que es un péptido ligando de (ASN, ILE, THR, GLN,
PRO, THR, GLN, GLN, SER, THR). El WO4 es un sitio de unión al ligando de E3-
proteína ubiquitina ligasa CHFR llamado tugstato. El carbamoil-fosfato sintetasa cadena
23
grande ADP y GLN carbamoil-fosfato sintetasa cadena grande L-glutamina. Cada ligando
está ubicado en distintas zonas de la proteína como se muestra en la tabla 1. (Jianyi Yang,
Ambrish Roy y Yang Zhang. 2013) (Figura 14).
Tabla 1. Resultados arrojados por el servidor I-TASSER para los posibles sitios de unión al
ligando
Rango C-score Cluster
tamaño
AP
Hit
Lig
Nombre
Descargar
Complejo Ligando vinculante Residuos del sitio
1 0.21 13 3unnA PÉPTIDO Rep , Mult 172.173.185.186.187.188.189.209.210
2 0.05 3 2jqiA PÉPTIDO N / A 172.185.186.187.188.189.209.210.250.251
3 0.05 3 1lgpA WO4 Rep , Mult 172.173.188.189.209
4 0.05 3 1a9xG ADP Rep , Mult 167.180.181.213.225.232.242
5 0.03 2 1jdbH GLN Rep , Mult 170203
3.3.2. Determinación de sitios activos
El sitio activo es una zona de reconocimiento para los sustratos, que posibilita la
interacción y catálisis con la enzima. La figura 15 muestra los sitios activos para la
proteína de estudio.
Figura 15. Sitios activos de la proteína dominio FHA
En este caso el servidor, arrojo 5 sitios activos correspondientes a las enzimas: 3aboA,
etanolamina amoniaco-liasa, 1aorB aldehído ferroxina oxidorreductasa, 1e6yA metil
coenzima M reductasa subunidad alfa, 3fn9c putativos beta-galactosidasa y 1e1yA
glucógeno fosforilasa, algunos datos relevantes, se observan en la siguiente tabla.
Tabla 2. Resultados arrojados por el servidor I-TASSER para los posibles sitios activos.
Rango CPuntuacion CE
AP
Hit TM-score RMSD
un IDEN
un Cov Número CE Residuos del sitio activo
1 0,065 3aboA 0,400 5.99 0,036 0,675 4.3.1.7 170
2 0,064 1aorB 0,306 6.18 0,034 0,527 1.2.7.5 179
3 0,064 1e6yA 0,329 6.45 0,040 0,581 2.8.4.1 205
4 0,064 3fn9C 0,405 6.49 0,028 0,726 3.2.1.23 N / A
5 0,064 1e1yA 0,392 6.28 0,050 0,671 2.4.1.1 N / A
24
Tanto los sitios de unión al ligando como los sitios activos en la proteína, son de alta
importancia para determinar la actividad biológica y establecer su uso específico. Además
que las bases de datos aplicadas, que sugieren una comparación proteínica, corresponden a
datos globales de gran cantidad de especies, y no solo de la especie en cuestión.
4. CONCLUSIONES
Durante el proceso se realizó de forma correcta, la síntesis del péptido proporcionado,
teniendo en cuenta el entrenamiento teórico y práctico para desarrollarlo, logrando
determinar algunos datos importantes del mismo por medio de la elucidación en el
espectrómetro de masas de acuerdo con corridas anteriores, registradas en el equipo. Se
pudo calcular la estructura, sitios activos y uniones al ligando para la proteína estudiada, a
partir de su péptido o unidad elemental, y desde aquí se consiguió establecer algunos datos
relevantes que mostraran su actividad biológica para futuros estudios en la especie oryza
sativa. Además este trabajo puede proporcionar herramientas para posteriores estudios, ya
que el POE de funcionamiento garantiza la adecuada intervención de quien tenga la
necesidad de manejarlo.
25
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marinas en productos de la pesca y la acuicultura. Santiago de Compostela: Editorial
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Jianyi Yang, Ambrish Roy y Yang Zhang. BioLiP: una base de datos comisariada semi-manual de
las interacciones proteína-ligando biológicamente relevantes , Nucleic Acids Research, 41:
D1096-D1103 (2013).
27
ANEXO A
POE (Procedimiento Operativo Estandar del sistema de identificación proteínica
equipo nanoUPLC-Qtof)
28
29
30
31
32
33
30
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
ANEXO A Cronograma
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ACTIVIDADES INDICADOR (ES) DE
CUMPLIMIENTO RESPONSABLE (S) FECHA
INICIO FECHA
TERMINACIÓN
Objetivo 1. Reconocer las bases Teóricas de la Síntesis Peptídica y protocolos estandarizados para el correcto uso del equipo TETRAS PETIDE SINTESIZER.
1. Indagar acerca de los procesos químicos que se dan en la síntesis de Péptidos.
Reporte y puesta en práctica de protocolos de manejo y funcionamiento del Sintetizador.
IVON LORENA REYES HEREDIA
Cód. 20101150045
Agosto/2014
Noviembre /2014
2. Aplicar los Protocolos que se usan en la síntesis automatizada de Péptidos en el equipo TETRAS PETIDE SINTESIZER. .
Objetivo 2. Realizar un debido entrenamiento en el manejo del equipo TETRAS de síntesis automática de péptidos.
1. Indagar acerca de los procesos funcionales y protocolarios del equipo. 2. Implementar el uso del equipo TETRAS, teniendo en cuenta los comandos y protocolo del equipo.
Reporte acerca del aprendizaje en el manejo y dominio del equipo TETRAS.
IVON LORENA REYES HEREDIA
Cód. 20101150045
Septiembre 2014
Noviembre 2014
96
Objetivo 3. Identificar algunas aplicaciones de la síntesis peptídica en salud y otros campos.
1. Realizar una síntesis peptídica de una especie de hoja blanca de arroz oryza sativa.
Péptidos correctamente sintetizados, aplicando los protocolos del TETRAS PETIDE SINTESIZER.
IVON LORENA REYES HEREDIA
Cód. 20101150045
Febrero 2015
Mayo 2015
Objetivo 4. Reconocer las bases teóricas y la aplicación de la Espectrometría de masas en Proteómica.
Realizar el análisis de los resultados proteomicos de al menos un spot de la electroforesis bidimensional del trabajo de investigación “Aproximación Proteómica al estudio de la respuesta a la infección por el virus de la hoja blanca en dos variedades en Oryza sativa” de la Profesora Nubia F. Barrera, Lic.Quim., M.Bioquim., c. Dr.Biotec .
Capacidad de interpretación de resultados proteomicos a partir de espectrometría de masas.
IVON LORENA REYES HEREDIA
Cód. 20101150045
febrero 2015 Mayo 2015
Objetivo 5. Realizar un debido entrenamiento en el manejo del sistema nanoUPLC Q-Tof y su aplicación en la identificación de proteínas.
De acuerdo a los protocolos establecidos, desarrollar un POE (Procedimiento operativo estándar) para el manejo del sistema para la identificación proteínica en el equipo nanoUPLC Q-Tof.
Demostración práctica del manejo básico del equipo sistema nano UPLC Q-Tof
IVON LORENA REYES HEREDIA
Cód. 20101150045
Abril 2015 Mayo 2015
Objetivo 6. Llevar a cabo cálculo de estructura de proteínas.
Calcular la estructura de Proteínas haciendo uso del servidor I-TASSER.
Informe de análisis y resultados de proteínas suministradas por la profesora
IVON LORENA REYES HEREDIA
Cód. 20101150045
Abril 2015 Mayo 2015
97
