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Patógenos de relevancia en los envíos cuarentenarios de los cítricos.
El control de las cepas resistentes
Nuestro compromiso con la sostenibilidad y con el concepto de Economía Circular.
CITROSOL: Nuestras señas de identidad
Nuestra voluntad de cerrar la brecha entre los resultados de laboratorio, generalmente muy buenos, con los resultados industriales. Para reducir la variabilidad industrial y obtener la máxima eficacia y homogeneidad en nuestros tratamientos, desarrollamos equipos de precisión.
La postcosecha de precisión es nuestra seña de identidad.
Nuestro objetivo es obtener resultados excelentes junto al cliente
Información confidencial. Todos los derechos de PI son propiedad de Productos Citrosol S.A.
Creemos en el I+D+i (Investigación + Desarrollo + Innovación)
El I+D+i está en nuestra sangre, siempre intentamos aportar soluciones de confianza a través del I+D+i:
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EL PODRIDO EN POSTCOSECHA
El podrido es la principal causa de reclamaciones, y de pérdida de ventas y clientes.
5-10% de la
producción se pierde
por patologías
fúngicas postcosecha
El podrido postcosecha en cítricos es
una patología causada por hongos.
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Proceso postcosecha típico en cítricos
+
Inicio esporulación
Incipiente
Micelio blanco
Fruto Esporulado
Totalmente esporulado -
Dificultad
de
detección
Recolección Drencher
Desverdizado
(4-8 días/20ºC)
Volcador
Tratamiento en línea
Transporte
Destino
Confección
Podrido %
Destrío
TRIA
Almacenamiento Frigorífico (TºC frío)
% Podrido
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El podrido que encontramos en el volcador
Tiempo desde la inoculación(1)
Nivel de desarrollo del podrido
Nivel de detección
48 horas Maceración
Lesión: 6 mm Muy difícil
3 días Micelio blanco Lesión: 1-3 cm
Difícil
4 días Inicio esporulación
Lesión: 4-8 cm Fácil
5 días Fruto esporulado
Lesión: 5-8 cm Fácil
7-8 días Completamente
esporulado Muy fácil
Con independencia del tipo de podrido podemos encontrar en el volcador distintos niveles de desarrollo del podrido
(1) TºC de desverdizado ≈ 20ºC Información confidencial. Todos los derechos de PI son propiedad de Productos Citrosol S.A.
No todos los frutos heridos pudren al mismo tiempo
Los frutos al igual que los hongos son organismos vivos.
Nivel de inóculo depositado sobre la herida.
Tamaño y profundidad de la herida.
“EFICACIA” y homogeneidad del tratamiento.
4 días desde inoc.
7-8 días desde inoc.
5 días desde inoc.
3 días desde inoc.
48 horas desde inoc.
Niveles de desarrollo del podrido en fruta (‘mal’) tratada con IMZ en drencher:
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PODRIDO Conclusiones
La mejor estrategia para que no ocurra podrido en postcosecha es:
EVITAR EL PODRIDO EN EL VOLCADOR
El mayor esfuerzo para evitar podridos en destino debe
realizarse en el 1er tratamiento, inmediatamente después
de la recolección, tratamiento que se realiza en drencher
o en la línea de precalibrado.
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96,9
3.1
Campaña 2017-2018
Penicillium spp: P. citrinum, P. solitum, P. brevicompactum, P. ulaiense Otros hongos: Botrytis cinerea, Alternaria sp., Rhizopus sp., Cladosporium sp., Geotrichum sp.,
97,3
2.9
Campaña 2015-2016
P. digitatum
P. italicum
Penicillium spp
Otros Hongosn= 209
95,1
4.9
Campaña 2016-2017
n= 346 n= 685
Patógenos causantes de podrido en cítricos: Datos de Citrosol
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Patógenos causantes de podrido en el ALMACENAMIENTO/TRANSPORTE FRIGORIFICO
Las bajas temperaturas reducen la germinación de esporas y el crecimiento de
patógenos, aunque a 0ºC todavía puede observarse crecimiento significativo de algunos
patógenos.
PATÓGENO Penicillium digitatum
Penicillium italicum
Geotrichum sp. Botrytis cinerea
Tª mínima de crecimiento
6-7°C Hasta 0°C 10°C 0-5°C
PATÓGENO Alternaria sp. Cladosporium sp. Rhizopus sp. Colletotrichum
sp.
Tª mínima de crecimiento
0-10°C Hasta 0°C 10°C 5-10°C
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Los patógenos fúngicos más importantes durante el almacenamiento
y/o transporte frigorífico son: Penicillium italicum, Alternaria sp.,
Botrytis sp. y Cladosporium sp.
Posibles causas del fracaso en la frigoconservación y transporte frigorífico
1. Mala aplicación del tratamiento, que aumenta la variabilidad de los resultados en el control del podrido.
2. Transmisión de la infección durante la conservación/transporte frigorífico.
3. Aparición de cepas de hongos resistentes a los fungicidas.
4. Mal manejo del frio que puede dar lugar a que la temperatura dentro de la cámara/contenedor no sea la deseada. Riesgo de Chilling injury.
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Podredumbre azul (blue mold)
Las infecciones se producen exclusivamente a través de heridas, microheridas o roturas de la cutícula → Se produce cuando las esporas llegan a la herida, o, en menor medida, por contacto entre fruta infectada y fruta dañada
La infección por contacto entre fruta es mucho más habitual que en P. digitatum
P. italicum es capaz de crecer a temperaturas bajas. Al crecer más rápidamente que P. digitatum por debajo de los 10ºC, la podredumbre azul puede problemas importantes cuando la fruta se almacena durante largos periodos a Tª bajas y durante el transporte. Puede crecer hasta los 0ºC
Producida por Penicillium italicum
Inicio de la infección Infección por la zona estilar Desarrollo de la parte
esporígena de color azul
La parte central está rodeada de una banda muy estrecha de micelio blanco, limitado por una banda ancha de tejido blando y acuoso
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Transmisión por contacto
+IMZ
+PCL
P. italicum, y otros patógenos, pueden extenderse en infecciones secundarias por contacto, sin necesidad de herida.
P. italicum se extiende por contacto a frutos sanos con mucha mayor frecuencia que P. digitatum.
Esto puede causar importantes problemas durante el almacenamiento, dando lugar a la formación de nidos de varios frutos podridos.
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Importancia comercial
P. digitatum es, con diferencia, el principal hongo causante de la podredumbre en cítricos, sobre todo al principio y mitad de la campaña → Incidencia del 60-80% del total de los podridos
La podredumbre verde generalmente produce mayores pérdidas durante la comercialización ya que es predominante a temperatura ambiente
P. italicum es el segundo hongo en importancia en podrido de cítricos → Incidencia del 20-30% del total de los podridos
Supone un problema mayor en frigoconservación o durante el transporte frigorífico y en partidas con frutos mal seleccionados (piel envejecida, con heridas y fisuras, etc.)
La incidencia de estos dos patógenos de herida es muy alta, ya que se reproducen rápidamente y sus esporas se dispersan con mucha facilidad: ALTA ESPECIALIZACIÓN EN CÍTRICOS
La fuente de inóculo en el campo, en el almacén y en los cajones es continua → NECESIDAD CRÍTICA DE MEDIDAS DE LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN
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Podredumbre gris (Gray mold)
Producida por Botrytis cinerea (Sin: Sclerotinia fuckeliana)
Las infecciones pueden originarse en el campo, y permanecer latentes hasta el almacenamiento, en tránsito o en el mercado.
En cajas se puede transmitir por contacto, formando nidos
El hongo se desarrolla a Tª de 15-20ºC y HR alta, pero puede crecer, más lentamente, hasta 0-5ºC.
4) Ataque completo con fructificación; con HR y Tª alta
2) Ablandamiento y crecimiento miceliar
(color marrón)
3) Desarrollo de esporas
1) Desarrollo inicial, en áreas debilitadas: área oscura, circular
y firme
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FUNGICIDA Penicillium sp. Control de la esporulación
Control Penicillium IMZ-R
Botrytis sp.
IMAZALIL +++ +++ 0 +
PIRIMETANIL +++ + +++ ++
ORTOFENILFENOL ++ - ++ 0
FLUDIOXONIL ++ + ++ ++
PROCLORAZ +++ ++ 0 +
TIABENDAZOL ++ + + ++
PROPICONAZOL +++ + 0 ++
EFICACIA: 0 = Nula + = Moderada ++ = Buena +++ = Excelente
Fuentes: G.E. Brown. 1988. Decay control/Fungicide applications; Smilanick et al., 2006. Postharvest Citrus Diseases and their control; J.E. Adaskaveg. 2014. Management of postharvest fungal decay in California citrus production. Datos internos Productos Citrosol S.A.
Fungicidas para el control de patógenos en frigoconservación
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Mancha marrón por Cladosporium sp.
Las esporas del hongo, transportadas por el viento en condiciones ambientales secas, penetran a través de zonas de la corteza debilitadas. Estas esporas germinan en condiciones de almacenamiento con humedades altas.
Afecta principalmente a las zonas peduncular y estilar, y únicamente a la corteza del fruto
Puede crecer a Tº próximas a 0ºC
Es una podredumbre seca, firme y flexible. Las zonas atacadas se oscurecen rápidamente y hay crecimiento miceliar de color verde-grisáceo
Si los frutos están muy maduros, puede penetrar en los tejidos del pedúnculo y provocar una podredumbre seca del eje central.
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Envíos frigoríficos a
China y a EEUU
CAMPAÑA 2017-2018
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Japón, 2006. Satsuma
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Mandarinas;
W. Murcott
Nadorcott
Tango
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Identificación molecular de los aislados
El género Cladosporium comprende unas 300
especies.
El género se divide en 3 complejos de
especies;
- Complejo C. cladosporioides
- Complejo C. herbarum
- Complejo C. sphaerospermum
Taxonomía molecular del género Cladosporium basado en distintos genes
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Cladosporium ramotenellum
Identificación en el laboratorio:
Aspecto Macroscópico: En PDA, crece como una colonia de aspecto algodonoso de color verde-gris, y color verde-negro por el reverso.
Aspecto Microscópico: Los conidióforos se forman en las hifas, lateralmente o terminalmente.
Las esporas son abundantes de color marrón o marrón pálido, de forma ovalada o limoniforme.
Presentan, en uno o en los dos extremos, pequeñas protuberancias que son las marcas de las inserciones en la cadena.
Pertenece al complejo herbarum.
Esta especie se aisló por primera vez en 2007 en una muestra de agua hipersalina en Eslovenia.
No se había descrito en cítricos previamente.
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Estudios moleculares recientes han mostrado que esta especie es un hongo saprófito muy común, encontrándose en diferentes sustratos y hospedadores y con una amplia distribución geográfica.
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Microorganismo Saprófito:
microorganismo que vive sobre materia orgánica en descomposición
Tipos de microorganismos patógenos:
• Patógeno primario: Capaz de vencer los mecanismos de defensa del hospedador sano y producir enfermedad
• Patógeno oportunista: Microorganismo normalmente no patógeno y que solo produce una infección cuando las defensas del hospedador están disminuidas o debilitadas (Ej. daños en la corteza) → Cladosporium sp.
Tratamientos fungicidas
Sensibilidad in vitro de Cladosporium ramotenellum a fungicidas postcosecha
Control – sin fungicida
Ortofenilfenol Tiabendazol
Imazalil Pirimetanil
El Ortofenilfenol es eficaz in vitro frente a esta especie de
Cladosporium
* Las dosis de fungicida empleadas fueron en todos los casos 400ppm
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Recomendaciones
La infección por Cladosporium sp. se produce cuando la fruta presenta
alteraciones de la corteza, debidas principalmente a daño por frío.
Se ha demostrado que la fruta recolectada de forma tardía es más susceptible a
sufrir daño por frío:
Hay que tener en cuenta que la
fruta recolectada al final de la campaña tiene más riesgos de sufrir daño por frio durante el
transporte frigorífico, y por tanto incrementa el riesgo de infección por Cladosporium sp.
Purvis AC, Kawada K & Grierson W (1979)
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Reservorios de contaminación:
Cámaras de desverdizado/conservación
Volcador y línea
CAJONES DE CAMPO: importante reservorio de inóculo y cepas Resistentes
Recomendaciones
Reforzar los protocolos de Limpieza y Desinfección durante toda la campaña tanto
en las líneas como en las cámaras, pero especialmente ANTES de empezar a
trabajar con variedades susceptibles.
Limpieza y desinfección de las jabas de campo, para evitar la transmisión de
Cladosporium del campo al almacén, y viceversa → Utilizar el drencher con
Citrocide Plus para la limpieza de cajones
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Recomendaciones
Reforzar la dosis de Citrocide en el lavado de la fruta (Sistema Citrocide online)
Reforzar el tratamiento drencher con Ortofenilfenol (Ortosol 6500 a 1200 ppm) y
Citrocide Plus, ya que son eficaces in vitro frente a Cladosporium ramotenellum.
Reforzar el tratamiento en cera con Ortofenilfenol (Ortosol 6500 a 3575 ppm). Se
ha comprobado que este fungicida es eficaz para el tratamiento del moho
peduncular causado por Cladosporium sp., por lo que podría ayudar a controlar la
infección por C. ramotenellum.
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El control de cepas
resistentes
RESISTENCIAS A LOS FUNGICIDAS POSTCOSECHA
pérdida de sensibilidad de poblaciones de hongos a la acción de los fungicidas
RESISTENCIAS
CLASES Insensibilidad natural Por ej.: Geotrichum al PCL; Alternaria al PPZ
Insensibilidad ADQUIRIDA
IMZ-Sensible IMZ-Resistente IMZ-Resistente
Adaptación genética
Mutaciones simples
(individuos)
Incremento de subpoblaciones
Resistentes
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MECANISMOS DE RESISTENCIAS
1. Reducción de la concentración intracelular del compuesto tóxico (transportadores).
2. Alteraciones en la diana de unión que provoca la reducción de la afinidad al compuesto fungicida (mutaciones puntuales).
3. Compensación de los efectos tóxicos del fungicida por alteraciones de la ruta biosintética o la ruta metabólica (rutas metabólicas alternativas).
4. Sobreexpresión de la diana de unión que ejerce un efecto de titulación del compuesto.
En un único paso: por ejemplo TBZ-R
NO se incrementa con el tiempo (ON-OFF).
Multigénica: por ejemplo IMZ-R
SÍ se incrementa con el tiempo (diferentes grados de R).
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FACTORES DE APARICIÓN DE RESISTENCIAS
1. Tipo de fungicida: Los fungicidas con mecanismo de acción específico es más fácil que den lugar a la aparición de resistencias por mutación y posterior selección del hongo que los de acción multisitio.
2. Tipo de hongo: Ocurre con mayor frecuencia en hongos como Penicillium spp de gran capacidad de esporulación.
3. El hecho que los almacenes sean recintos cerrados hace más fácil la aparición de resistencias por la acumulación y permanencia del inóculo.
4. Tratamientos aplicados inadecuadamente: bajas dosis, malas aplicaciones, acumulación inóculo en el caldo drencher y malas prácticas de desinfección.
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Resistencia cruzada: Grupos de fungicidas según su modo de acción
Inhibición de la síntesis de
ergosterol en la membrana
Imazalil
Procloraz
Propiconazol
Miclobutanil
Inhibición del ensamblaje de ß-tubulin en la division celular
Tiabendazol
Metil-tiofanato
Carbendazima
Inhibición de la biosíntesis de
metioninia
Pirimetanil
Acción multi-sitio
Orto-fenilfenol
La Resistencia cruzada ocurre cuando el uso de un fungicida produce el desarrollo de resistencias a otro fungicida con su mismo modo de acción
Para evitar problemas de resistencia cruzada NO hay que usar fungicidas con el mismo modo de acción
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Resistencia cruzada
Ensayos de eficacia con cepas de P. digitatum resistentes a IMZ
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Retraso Permisible en cepas IMZ-R
(Foster, Kanetis & Adaskaveg 2007)
Tiempo retraso permisible (h)
P. digitatum IMZ-S
P. digitatum IMZ-R
En cepas de P. digitatum
resistentes a IMZ, se reduce significativamente
el tiempo de retraso
permisible
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1
EL ORIGEN DE LAS RESISTENCIAS EN Penicillium sp.
En campo, las cepas
son mayoritariamente
SENSIBLES (S) a
fungicidas
ALMACEN
Aparecen algunas cepas Resistentes (R) a fungicidas por:
Acumulación y permanencia del inóculo en los cajones y el almacén (recinto cerrado)
Tratamientos aplicados inadecuadamente: bajas dosis, malas aplicaciones, acumulación inóculo en el caldo drencher y malas prácticas de desinfección
2 Si NO hay buenos protocolos
de Limpieza y Desinfección en el almacén, las cepas R se
convierten en las cepas DOMINANTES
4
↑ Penicillium sp. - S
↓ Penicillium sp. - R
Situación inicial en el almacén
3 Los fungicidas eliminan las cepas Sensibles
pero no eliminan las cepas Resistentes
FUNGICIDAS
↑ Penicillium sp. - R ↓ Penicillium sp. - S
Situación final en el almacén
Si NO hay L+D, las cepas R se acumulan en los cajones, y pueden
llegar a campo
5
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ES CRUCIAL CONTROLAR LA APARICIÓN DE RESISTENCIAS
Es necesario identificar correctamente la existencia o no de aislados Resistentes con el fin de aplicar el tratamiento más adecuado y eficaz, y evitar así agravar el problema.
Programa de monitorización de resistencias en CITROSOL:
- Realizamos muestreos en los almacenes de nuestros clientes; Son muestreos programados y sistemáticos, y adicionalmente cuando hay problemas de podrido
- Evaluamos la resistencia a fungicidas en los aislados de P. digitatum y P. italicum
- Nos permite anticiparnos al problema y ‘cortar’ las resistencias de forma temprana
0100
200300400500
600700800
13-14 14-15 15-16 16-17 17-18
70
221 203
329
687
Nº de muestras analizadas
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Técnicas moleculares
1. Extracción del DNA de la muestra: Desde esporas o desde fruta con podrido incipiente
2. PCR (Reacción en cadena de la polimerasa): Amplificación del gen marcador
3. Electroforesis del DNA: Para separar el DNA por tamaño y visualizar el resultado
M1: P. digitatum
M2: P. italicum
M3: Están presentes los dos
M4: No hay P. digitatum ni
P. italicum en la muestra
P. digitatum
P. italicum
M1 M2 M3 M4
PCR-múltiple para la identificación simultánea de P. digitatum y P. italicum
Utilizamos técnicas de biología molecular y técnicas de microbiología clásica
1º. Identificación del patógeno causante del podrido
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También utilizamos técnicas de biología molecular y técnicas de microbiología clásica
• Mediante técnicas moleculares evaluamos la resistencia a IMZ de los aislados de P. digitatum
• Mediante técnicas de microbiología evaluamos:
- La resistencia de P. digitatum a otros fungicidas
- La resistencia de P. italicum a IMZ y a otros fungicidas
2º. Determinación de la resistencia a fungicidas
Resistencia a imazalil en P. digitatum
El imazalil, como el procloraz y el propiconazol, pertenece al grupo de fungicidas inhibidores de la desmetilación (DMI)
Modo de acción; actúan sobre la enzima citocromo P450 esterol 14-α-desmetilasa, enzima que forma parte de la vía de síntesis del ergosterol.
El ergosterol un componente esencial de las membranas celulares fúngicas. La ausencia de ergosterol en las membranas de las células animales (tienen colesterol) hacen que sea una excelente diana para fungicidas.
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Genes CYP51A y CYP51B: Codifican la enzima citocromo P450 esterol 14-α-desmetilasa (P45014αdm).
3 tipos de cepas IMZ-resistentes según la mutación que presentan:
• R1 → Sobreexpresión del gen CYP51A debido a la inserción extra de 4 repeticiones en tándem de un activador transcripcional de 126pb en la región del promotor del gen CYP51A[1]
• R2 → Incremento de la expresión del gen CYP51A debido a la inserción de una secuencia de 199pb dentro del activador transcripcional de 126pb [2]
• R3 → Sobreexpresión de CYP51B debido a la inserción de una secuencia de 199pb en la región del promotor del gen CYP51B [3]
[1] Hamamoto H, et al. Appl Environ Microbiol. 2000. 66: 3421-26
[2] Ghosoph JM, et al. Postharvest Biol Technol. 2007. 44: 9–18
[3] Sun X, et al. Appl Microbiol Biotechnol. 2011. 91:1107–19
Cepa IMZ-R2
Cepa IMZ-R1
Cepa sensible
Cepa IMZ-R3
Bases genéticas de la resistencia a IMZ en P. digitatum
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Detección en el laboratorio
Usan dos parejas de cebadores en la misma reacción
- CYP51A1/CYP51A2 → amplifica la región del promotor del gen CYP51A; detecta los genotipos R1 y R2
- B1/B2 → amplifica la región del promotor del gen CYP51B; detecta el genotipo R3
Resultado:
Cepas sensibles: 401pb (CYP51B) y 506pb (CYP51A)
Cepas IMZ-R1: 401pb y 1010pb
Cepas IMZ-R2: 401pb y 705pb
Cepas IMZ-R3: 506pb y 600pb
Sun et al., desarrollan una PCR-múltiple para la detección simultánea de las tres mutaciones que confieren resistencia a IMZ:
El tiempo necesario para la identificación del patógeno y
la evaluación de la resistencia a IMZ se reduce a 1-2 días.
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Para determinar la resistencia a pirimetanil y a otros fungicidas en P. digitatum
Para determinar las resistencias a fungicidas en P. italicum
Técnicas microbiológicas para la evaluación de resistencias
Se utilizan placas con medio de cultivo fortificadas con distintas concentraciones del fungicida a evaluar. Tras la incubación de los aislados a testar a 22ºC, durante 5-6 días, Se calcula el porcentaje de inhibición del crecimiento radial, comparando el diámetro de crecimiento del hongo en la placa de medio control sin fortificar y en la placa de medio fortificado a una determinada concentración
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Nuevo protocolo de resistencias a fungicidas
Mismo principio que el método clásico; Cálculo del % inhibición del crecimiento del hongo, comparando su crecimiento en medio control y en medio con fungicida
UTILIZAMOS PLACAS MULTIPOCILLOS
medio 1 2 5 control ppm ppm ppm
IMZ
PYR
IMZ + PYR
Cepa sensible
IMZ
PYR
IMZ + PYR
medio 1 2 5 control ppm ppm ppm
Cepa resistente a un fungicida
Cepa resistente a dos fungicidas
IMZ
PYR
IMZ + PYR
medio 1 2 5 control ppm ppm ppm
Somos capaces de procesar más muestras y en menos tiempo
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BIBLIOGRAFÍA
Bautista-Baños S. (Editor). Postharvest Decay. Control Strategies. 2014. San Diego, California. Elsevier, Inc
Wardowski WF, Miller WM, Hall J, Grierson W. Fresh Citrus Fruits: 2nd Edition. 2006. Longboat Key, Florida. Florida Science Source, Inc.
Tuset JJ (Editor). Podredumbres de los frutos cítricos. 1987. Valencia, España. Generalitat Valenciana, Conselleria d’Agricultura i Pesca
Roger Amat S. Defectos y alteraciones de los frutos cítricos en su comercialización. 1991. Valencia, España
Frisvad JC & Samson RA. Polyphasic taxonomy of Penicillium subgenus Penicillium. A guide to identification of food and air-borne terverticillate Penicillia and their mycotoxins. Studies in Mycology. 49: 1-174
Brown GE. Decay control/fungicides applications. In: Bronw GE (Ed.) Fresh citrus quality short course proceedings. Fort Pierce: AREC, 1988. p.1-24.
Adaskaveg JE. 2014. Management of postharvest fungal decay in California citrus production.
http://www.frac.info/home
Hamamoto H, et al. Tandem repeat of a transcriptional enhancer upstream of the sterol 14α-demethylase gene (CYP51) in Penicillium digitatum. Appl Environ Microbiol. 2000. 66: 3421-26
Ghosoph JM, et al. Imazalil resistance linked to a unique insertion sequence in the PdCYP51 promoter region of Penicillium digitatum. Postharvest Biol Technol. 2007. 44: 9–18
Sun X, et al. PdCYP51B, a new putative sterol 14α-demethylase gene of Penicillium digitatum involved in resistance to imazalil and other fungicides inhibiting ergosterol synthesis. Appl Microbiol Biotechnol. 2011. 91:1107–19
Bensch K, et al. The Genus Cladosporium. 2012. Studies in Mycology 72: 1–401
Bensch K, et al. Cladosporium species in indoor environments. 2018. Studies in Mycology 89: 177–301
Samson RA. New insights into the biodiversity and ecology of the indoor mycobiota. 2014
Imágenes:
Productos Citrosol S.A.; http://microbialfoods.org/geotrichum-candidum-mold-transition;
http://www.tecnicoagricola.es; http://thunderhouse4-yuri.blogspot.com.es/
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Muchas gracias por su atención
¿Preguntas?
Penicillium digitatum
Alta especialización en la infección de cítricos
Es un hongo mesófilo; puede crecer desde 6–7ºC hasta 30-35ºC, siendo 22-25ºC su Tª óptima
Identificación en el laboratorio:
P. digitatum es una especie única dentro del género Penicillium
Aspecto Macroscópico: Colonias de crecimiento rápido en PDA.
De color verde-oliváceo en el anverso, e incoloras o de color amarillo-cremoso en el reverso
Aspecto Microscópico: Se diferencia del resto de Penicillium sp., ya que presenta una ramificación de conidióforos diferente; son cortos, biverticilados y asimétricos.
Las esporas son grandes, de elipsoidales a cilíndricas o globosas
Penicillium italicum
Alta especialización en la infección de cítricos, como P. digitatum
Es también un hongo mesófilo, pero es capaz de crecer a Tª bajas (hasta 0ºC)
Identificación en el laboratorio:
Aspecto Macroscópico: Colonias de crecimiento rápido en PDA.
De color azul en el anverso, desde marrón-amarillento a naranja o marrón-rojizo en el reverso (dependiendo del medio de cultivo). Las colonias pueden parecer granulosas debido a la presencia de manojos de conidioforos.
Aspecto Microscópico: Los conidióforos son rectos, dispuestos en pequeños manojos. Los penicilos (pinceles), son habitualmente asimétricos y portadores de 1 a 3 brazos simples o ramificados
Las esporas, al igual que P. digitatum, son desde elipsoidales a cilíndricas o globosas
2. Podredumbre por Alternaria (Black rot, Black spot)
Producida por Alternaria alternata y Alternaria citri
Las esporas llegan a las flores y al fruto en el campo y, en condiciones de HR alta y Tª suave, germinan y penetran en el interior de los frutos a través de la zona estilar y peduncular. Pero también pueden penetrar a través de heridas o lenticelas
En campo puede producir la caída prematura de los frutos jóvenes infectados
En el almacenamiento a Tª baja, en la fruta infectada se produce una decoloración de la piel que cambia a marrón
En mandarinas (Satsuma) se pueden ver amplias zonas que toman coloración negra debido a formación de masas de micelio debajo de la epidermis sin causar rotura
1. Manchas iniciales; podredumbre firme. Pueden aparecer en la zona peduncular o estilar, o manchas por toda la superficie
2. Amplias zonas con coloración negra
3. A Tº de 18-20ºC y HR alta se desarrolla un micelio negro-olivaceo
Importancia comercial
La podredumbre por Alternaria sp. puede alcanzar el 8-16% del total, aunque en
la conservación frigorífica y para partidas de frutos recogidos tarde, se pueden
alcanzar tasas de podridos del 25-30% a los dos meses de almacenaje
Está muy presente en estratos vegetales y las esporas, muy abundantes, son
transportadas por el viento hasta el fruto. Las condiciones secas incrementan la
incidencia
Suele infectar solo a frutos jóvenes, poco lignificados, o a frutos muy maduros.
Cuando la infección se produce a través de la zona estilar, suele permanece latente
en el interior de los tejidos hasta el almacenamiento
Alternaria sp.
Distribución mundial y amplio rango de hospedadores
La diferenciación entre A. alternata y A. citri es compleja: Algunos consideran que son la misma especie (A. alternata pv citri)
Identificación en el laboratorio (Alternaria sp.):
Aspecto Macroscópico: colonias no compactas pero densas. Al principio blanquecinas, que pasan a marrón oliváceo o grisáceo, que llega a ser negro
Aspecto Microscópico: Los conidióforos son erectos y septados y pueden ser simples o ramificados, y de color marrón oliváceo.
Las esporas son muy características:
• Forma variable pero abundan las claviformes, oviodes y elipsoidales
• Color desde marrón claro a marrón-oliváceo
• Cuando son maduras presentan varios tabiques transversales y varios longitudinales u oblicuos
Botrytis cinerea
Distribución mundial
Tiene un amplio rango de hospedadores
Identificación en el laboratorio:
Aspecto Macroscópico: El micelio es de color grisáceo o verde-gris
Aspecto Microscópico: Produce un micelio ramificado y septado, que al principio es hialino, pero rápidamente adquieren coloración marrón.
Los conidióforos tienen un largo pie que en su parte superior porta las ramificaciones que terminan en células redondeadas.
Las esporas son elipsoidales, hialinas o ligeramente coloreados
3. Podredumbre amarga (Sour rot)
Producida por Geotrichum candidum var. citri-aurantii
Las infecciones por este hongo se originan a través de heridas producidas por insectos o heridas mecánicas durante el manejo postcosecha.
Generalmente no infecta a través de heridas pequeñas o superficiales
Se suele producir en fruta madura con defectos y almacenada durante algún tiempo
En atmósfera húmeda y con Tª superiores a 10-12ºC, aparece micelio blanquecino
Causa una podredumbre amarga o ácida de consistencia blanda, que se transforma rápidamente en acuosa y con un fuerte olor. Porciones de esta fruta gotean en las frutas inferiores o se dispersan por insectos, propagando la enfermedad.
Geotrichum candidum
Distribución mundial
Se encuentra en el suelo, de forma saprófita, desde donde puede llegar a la fruta
Identificación en el laboratorio:
Aspecto Macroscópico: Colonias de crecimiento relativamente rápido a 22-25ºC, y de color blanquecino-cremoso y de aspecto aterciopelado o mate.
Aspecto Microscópico: Produce un micelio hialino (transparente), con hifas septadas, y portador de cadenas de conidios. Estas cadenas de se fragmentan en células individuales (esporas) de tamaño variable.
Las esporas pueden ser cilíndricas o con forma de barril y son portadoras de gotas de grasa
Importancia comercial
El hongo necesita temperaturas relativamente altas para infectar; Tª menores de 10ºC inhiben casi completamente el desarrollo del hongo.
El drencher siempre es el principal foco de contaminación y el origen de casi todos los
problemas de podrido que este hongo origina en postcosecha. Puede supone un problema en frigoconservación durante largos periodos y en partidas con
frutos mal seleccionados (piel envejecida, con heridas y fisuras, etc.)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Penicilliumdigitatum
Penicilliumitalicum
Alternaria spp. Botrytiscinerea
Geotrichumcandidum
Rhizopusstolonifer
% In
cid
enci
a
INCIDENCIA:
020406080
100
13-14 14-15 15-16 16-17
% G
eotr
ich
um
sp
p.
Muestras de podrido en fruta
0.0
1.0
2.0
3.0
13-14 14-15 15-16 16-17
% G
eotr
ich
um
sp
p.
0
20
40
60
80
100
Peru España Egipto Sudáfrica % G
eotr
ich
um
sp
p.
Aislamientos en Drencher – 16/17
0
0.5
1
1.5
2
2.5
Peru España Egipto Sudáfrica%
Ge
otr
ich
um
sp
p.
Aislamientos en caldos Drencher - 16/17
Datos de Citrosol
CYP51 (ERG11): Codifica para la enzima citocromo P450 esterol 14-α-desmetilasa (P45014αDM)
• Comparan el gen CYP51 de 3 cepas sensibles y 3 cepas resistentes a IMZ:
• Ven que hay diferencias en la región del promotor:
- Las cepas Resistentes: 5 copias de una secuencia de 126pb, repetidas en tándem
- Las cepas Sensibles: una sola copia
El mayor número de copias de la secuencia de 126pb hace que el gen se transcriba más (100X)
la secuencia sería un potenciador de la transcripción
Sensibles
Resistentes
Genotipo R1
Información confidencial. Todos los derechos de PI son titularidad exclusiva de Productos Citrosol S.A.
Bases genéticas de la resistencia a IMZ
• Estudian también la región del promotor de CYP51
• Secuencian este gen en un número mucho mayor de
cepas sensibles y resistentes: encuentran un inserto
de 199pb en el promotor del gen de cepas
resistentes
El inserto de 199pb provoca un aumento en la transcripción del gen (10X)
el inserto sería también un potenciador de la transcripción
Genotipo R2
Sensibles
Resistentes
Información confidencial. Todos los derechos de PI son titularidad exclusiva de Productos Citrosol S.A.
Genotipo R3
• Estudian 2 genes homólogos a CYP51; CYP51B y CYP51C
• No encuentran cambios en CYP51C
• Encuentran, en cepas resistentes, un inserto de 199 pb
en la región del promotor del gen CYP51B
El inserto también provoca un aumento en la transcripción del gen (7-14X)
el inserto sería un potenciador de la transcripción del gen CYP51B
Sensibles
Resistentes
Información confidencial. Todos los derechos de PI son titularidad exclusiva de Productos Citrosol S.A.
Somos capaces de procesar más muestras y en menos tiempo
VENTAJAS:
- Utilizamos menos material; Ahorro económico, y la preparación y manipulación del material es más sencilla
- Reducción del espacio necesario para la incubación de las placas
- Reducción del tiempo de incubación: de 6 días a 4 días
% Inhibición crecimiento radial
= (Crec. radial, mm) control – (Crec. radial, mm) X ppm
(Crec. radial, mm) control X 100
Resultado INTERPRETACIÓN GLOBAL
Sensible a 1 ppm SENSIBLE (S) Resistente a 1 ppm LIGERA RESISTENCIA (LR) Resistente a 2 ppm RESISTENCIA (R) Resistente a 5 ppm ALTA RESISTENCIA (AR)
- Si el % de inhibición del crecimiento es mayor al 50%, se considera que el hongo es SENSIBLE a esa concentración de fungicida. - Si el % de inhibición del crecimiento es menor del 50%, se considerará RESISTENTE a esa concentración de fungicida.
El % de inhibición del crecimiento radial se calcula según la siguiente fórmula:
Finalmente, el resultado global de la resistencia se estima de la siguiente forma: