Upload
hugo-jimenez
View
650
Download
2
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Presentacion resumida de la tecnica de PCR como diagnostico en el laboratorio de ciencias de la salud, QFB UNAM
Citation preview
PCRFundamentos y aplicaciones
Virología Médica
Víctor Hugo Jiménez Mendoza
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
1985 - Mullis & Falloona
Amplificación enzimática de un fragmento de DNA
(simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)
Síntesis de ácidos nucleicos: generalidades
La hebra nueva de DNA o RNA se sintetiza en dirección 5’ 3’
Las RNA polimerasas pueden iniciar la síntesis de una cadena nueva utilizando una hebra molde
Las DNA polimerasas además de la hebra molde, necesitan un iniciador (primer o cebador de extensión)
La Transcriptasa Reversa es una DNA polimerasa RNA-dependiente.
Cadena líder (Leading Strand)
Primer (riboNTPs)
Fragmento de Okasaki
Cadena rezagada (Lagging Strand)
Basta un primer
LA SINTESIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS ES SIEMPRE DE 5´ 3´.
Eventos en la Replicación del DNA:
• Apertura de las cadenas (orígen de replicación)
• Colocación de los iniciadores (primers de RNA) ( La cadena líder utilizará un solo iniciador mientras que las cadenas rezagadas utilizarán varios iniciadores de RNA.)
• Síntesis de cadenas de DNA (partiendo de los iniciadores)
• Eliminación de los iniciadores de RNA.
• Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA ligasa)
ELEMENTOS QUE SE REQUIEREN EN LA SINTESIS DEL DNA POR PCR
Hebra Templado
· Iniciador (cebador, primer): secuencia corta de nucleótidos complementaria a la hebra templado. La enzima DNA polimerasa sólo puede iniciar la síntesis de una cadena de DNA a partir de un 3’OH libre.
dNTPs : desoxirribonucleótidos tri-fosfatados
DNA Polimerasa
PCRMelting
94 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
5’3’
3’5’DNA de cadena doble
PCRMelting
94 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
3’5’
5’3’
CalorDNA de cadena simple
PCRMelting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
3’5’
5’3’5’
5’
Melting94 oC
Hibridaciónde primers
PCRMelting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
30 ciclos
3’5’
5’3’
Calor
Calor
5’
5’
5’
PCRMelting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’5’
5’3’5’
5’
5’
5’
5’
5’
PCRMelting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’5’
5’3’ 5’
5’5’
5’
5’
5’
Calor
Calor
PCRMelting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’5’
5’3’ 5’
5’5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
Fragmentos de tamaño definido
PCRMelting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’5’
5’3’ 5’
5’5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
El numero de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR.
0# ciclos
Numero de copias1
3
8
2
4
1
2
4
16
5
32
6
64
VENTAJAS DE PCR SOBRE
OTRAS TECNICAS
ALTA SENSIBILIDAD
ALTA ESPECIFICIDAD
RAPIDEZ
DESVENTAJA:
PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA templado específico o productos amplificados previamente)
Detección de cantidades mínimas (diagnóstico temprano en pacientes asintomáticos)
Monitoreo de terapia (por ej. disminución de carga viral)
Evaluación de terapia - pronostico de recaída
Detección de cepas resistentes a antibióticos
Detección temprana de Citomegalovirus y otros patógenos en pacientes con trasplante de órganos (por inmunosupresión y mayor riesgo a infecciones latentes)
MUESTRAS QUE PUEDEN PATOGENOS QUE PUEDEN SER SER EVALUADAS POR PCR DETECTADOS POR PCR
•Sangre - Bacterias
•Mucosa - Hongos
•Tejido - Parásitos
•Orina - Virus
•Heces - Mutaciones en Genes
•Líquido cefalorraquídeo - Ausencia /Deleción de genes
Bibliografía Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis
KB, et al.(1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487–491
Griffiths, J.F. A. et al. (2002). Genética. McGraw-Hill Interamericana.
Coleman, WB y Tsongalis, GJ (2006). Molecular Diagnostics: For the Clinical Laboratorian. Humana Press
Butler, JM (2005). Forensic DNA Typing: Biology, Technology, and Genetics of STR. Academic Press pgs 63-84
Gracias