Viernes 20 de Mayo de 2011

PCR (Polymerase Chain Reaction)

DAVID ANDRÉS HERNÁNDEZ COLONIALEIDY JOHANNA OSORIO CASTAÑO

MEDICINA 4-A

Índice1- Historia

2- ¿Qué es el PCR?

3- Tipos de PCR

4- Reactivos para el PCR

5- Pasos para el PCR

6- Electroforesis y Análisis

7- Usos y aplicaciones

8- Ventajas y desventajas

Historia • La técnica del PCR fue diseñada por el bioquímico estadounidense Kary Banks Mullis en 1985.

• Esta técnica lo llevo a ganar el premio Nobel de Química en 1993.

¿Qué es el PCR?• Es la amplificación de un segmento especifico de DNA in vitro por medio de la polimerización en cadena de DNA utilizando un termociclador.

• El propósito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA.

Tipos de PCRPCR anidada

PCR in situ

PCR múltiplex

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)

Reactivos necesarios para el PCRo coctel de PCR

Amortiguador (Buffer)

MgCl2: Es un cofactor para la función de la polimerasa

dNTP’s (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP. La concentración de dNTPS, es proporcional al tamaño del fragmento que se desea amplificar.

Cebadores “primers”: Son secuencias cortas de nucleótidos 20-24 nucleótidos de longitud, complementarias a una región del DNA que se quiere amplificar.

DNA molde

Polimerasa: Se utiliza la polimerasa de la bacteria “Thermus aquaticus” conocida como Taq pol

Termociclador

Pasos para el PCREl proceso del PCR incluye 3 pasos básicos

que se repiten 25 veces o más (hasta 35 ciclos):

1. Desnaturalización

2. Apareamiento o Alineamiento

3. Polimerización o Extensión

1- DesnaturalizaciónConsiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla. -Típicamente se usa una temperatura de 95˚C - 97˚C, por 15 a 40 segundos

2- Apareamiento o Alineamiento

Los cebadores “primers” previamente diseñados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura -ej: 55˚C por 30 segundos-

3. Polimerización o ExtensiónUna Polimerasa de DNA extiende los “primers”, en el espacio comprendido entre ambos “primers”, y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’, rectificando el DNA de 3’a 5’. De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde. Se efectúa a 70˚C por 1½ minutos.

AMPLIFICIÓN EXPONENCIAL:

Electroforesis:Es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico.

• Generalmente se utiliza gel de agarosa cuando se analizan nucleótidos o ácidos nucleícos.

•Al gel se le añade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta.

•Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lámpara de luz UV, y se verán las bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores de peso molecular.

Análisis de la muestra

La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electroforético.

Usos y aplicaciones-Tras la amplificación del DNA resulta mucho mas fácil:

• Identificar la presencia de virus o bacterias.

• Analizar el ADN de cualquier organismo vivo o muerto. (análisis de fósiles).

• Investigación forense.

• Pruebas de paternidad.

Ventajas del PCR:A partir de una muestra pequeña de ADN se puede

obtener una cantidad considerable para el estudio que

se vaya a realizar.

El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y

análisis.

Se puede amplificar ADN de cualquier organismo

vivo o muerto.

Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense,

diagnósticos, análisis prenatales, etc.

Desventajas del PCR:Se puede reproducir solamente partes del genoma en

donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de

20 – 40 pb.

Se necesitan “primers” específicos que sean

complementarios al fragmento que se desea sintetizar.

La polimerización puede tener errores al sintetizar el

ADN

Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del

mismo investigador o de cualquier otro)

GRACIAS!!!http://www.youtube.com/watch?v=Kuy4PDb6bdU