Estrategia para el estudio molecularDeterminacin clnica del pacienteCaracterizacin genticaespontneofamiliar5 ml sangrePurificacin DNAMapeo de familia con marcadores (positional cloning)Secuenciacin de genes candidatos (comp. pacientes vs normales)mutacindiagnstico, portadores, cura, modelos, etc

Purificacin de DNA (clsica)Clula: ncleo y citoplasma (mitocondrias, cloroplasto)Protenas, lpidos, glcidos, cidos nucleicos.Separar todos los contaminantes celulares de cidos nucleicosProteinasas, fenol-cloroformo (lpidos, lipoprotenas, glucolpidos)ClCs/BrEt en ultracentrifugacinConcentracinSol salina: NaCl, AcNH4, AcNaAlcohol [ ] y T (> a -20C)Precipitado fibrilarLavado etOH 70%secado

Kits comerciales para purificar DNA

Anlisis de DNAEstudio de material gentico: microscopa ncleo y cromosomas. Lmite mnimo > 1.5-2 Mb, mas pequeo es imperceptible.Un segmento menor de 1.5-2 Mb hay que detectarlo de otra manera, mtodos fsico-qumicosMultiplicacin de un segmento pequeo por millones de veces: PCR o clonacin molecular.Utilizacin de sondas marcadas: Southern, Northern blot, FISH.

Electroforesis Separacin de molculas por carga elctricacidos nucleicos ms o menos uniforme en carga (negativa)cidos nucleicos separados por tamao+-Condiciones

Nativas (no denaturantes)Denaturantes (se rompe estructura secundaria y terciaria)Protenas SDSDNA formamida, rea

Electroforesis: Separacin de segmentos de DNA por carga y tamao)1 2 3 4 5 6 7 8Microsatlite en 8 personas

Primero, la fusin separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100C)Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva cadena con la DNA polimerasaAl mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay un rexceso de Primer 1Ahora tenemos dos copias de la molcula originalReaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperaturaSi repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias

Reaccin en cadena de la polimerasa - PCRMltiples ciclos darn un incremento exponencial en el nmero de copias

Polymerase chain reaction (PCR)Duplicacin in vitro de un segmento de genoma (100-1,000 bp) para hacerlo visible.Segmento amplificado: AMPLICNFotocopia especficamente un solo prrafo dentro de todo la enciclopedia.Generalmente una pequea porcin de una mezcla compleja: ejm. un exn dentro del genoma DNA de una especie en otra: infecciones en esputo, carga viral en plasma, etc.Mutaciones, Polimorfismos: RFLPs, AFLPs, RAPDs, microsatlites, mtDNA, ribotipos, etc.Exponencial 2n

Que necesitamos para el PCR?Informacin de secuenciaPrimers oligonucletidos: especificidadDNA: plantillaNucleotidos: dNTPsTermociclador: mquina que cambia de temperaturas cclicamente para microtubosHeat-stable DNA polymeraseTaq polymerasa (Thermus aquaticus, Pfu, Pfg, etc)Buffer (pH)Mg++

Hay 7 componentes esenciales en el proceso standard de PCRADN polimerasa termoestableOligonucleotidos iniciadores (primers)Desoxiribonucletidos trifosfatados (dNTPs)Cationes divalentesBuffer (para mantener el pH)ADN molde (Templado)

Los ciclos del PCRDenaturacin inicial3035 ciclos:denaturacin (95C), 30 seg.Hibridacin (annealing) (5560C), 30 seg.extensin (72C), 15 seg - 5 min.Extensin final

PCR92-95C denat.50-65C hibrid.72C polimeriz.Mquina:Termociclador

PCR (continuacin)1 ciclo 212 ciclos 223 ciclos 23

30 ciclos 230

Antes de Taq polimerasa3 baos mara: denaturacin, hibridacin y extensin. DNA Polimerasa E. coli (37C) tenan que ponerse en cada ciclo y elevaba los productos inespecficos.Termocicladores introducidos en 1986. Taq (Thermus aquaticus) DNA polymerase descrito en 1988.

ADN polimerasas termoestablesLlevan a cabo la sntesis de ADN dependiente del templado.Estabilidad Taq: 9 min at 97C, Pwo >2 hr a 100CFidelidad Taq: baja, Pfu: altaAlgunas presentan actividad transferasa terminal en el extremo 3, ej. Taq agrega una A al exremo 3, especialmente si en el extremo hay una C. Pwo y Tli generan extremos romosCantidad usada = 5 x 1012 moleculas (1.5 unidades)La mas comunmente usada = Taq ADN polimerasaTaq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus littoralis

PrimerSegmento de DNA sinttico entre 15 a 30 nucletidos. Compra por internet. Generalmente 1 cada lado.Secuencia especfica (generalmente nica en genoma)En concentraciones molares millones de veces mas que plantilla.Programas para clculo de temperatura de hibridacin segn tamao y cantidad de G+C/A+T

Tm = 4(G + C) + 2(A + T)C

Aproximadamente 5 grados menos que el menor Tm del par de primers Mejor si termina en G CEvitar secuencias repetidas (alu, microsatlites, famila de genes, etc)Primer3 program en la pgina del Whitehead Institute

Primers que forman DmerosUn primer puede formar un dmero consigo mismo o con el otro primer.

5-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3 |||||||||| 3-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5

Contribuye a la formacin de DNA inespecfico

Oligonucletidos iniciadores (primers)Se conoce su secuenciaEs el factor mas importante para la eficiencia y la especificidad del procesoDeben estar presentes en exceso (1013 = 30 cycles, 1 kb)Requieren de un cuidadoso diseoReglas de diseo:(a) longitud = 18-25(b) Contenido de G+C entre 40-60%(c) Evitar las secuencias repetidas

(c) Evitar las secuencias repetidas55335533Dmero de primerPCR3 repetido5-NNNNNNNNNNNNNTATA-35-NNNNNNNNNNNNNTATA-35-NNNNNNNNTATA-3 3-ATATNNNNNNNN-5

(c) Evitar las secuencias repetidas5533no hay extensinPCR5 repetido5-TATANNNNNNNNNNNNN-35-TATANNNNNNNNNNNNN-3 5-TATANNNNNNNN-33-NNNNNNNNATAT-55533

(c) Evitar las secuencias repetidas5533Productos de PCR no deseadosPCRFormacin de horquillas5-NNNNNNNNNNNGCATGC-35-NNNNNNNNNNNNNNNNN-35-NNNNNNNNNNNGCA 3-CGT53

ADN molde (templado)Puede ser ssDNA o dsDNA (simple o doble cadena)ADN circular y cerrado es levemente menos efectivo que el ADN linealUsualmente se utilizan varios miles de copias, ej: 1 g de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de bacteriano o 1 pg of plasmdicoSe puede amplificar a partir de una sola molcula de ADN molde, pero las condiciones deben estar muy optimizadas

El ciclo de PCR Desnaturalizacin - 94-95C por 45 segundos si G+C < 55%Temperatura de hibridizacin (Annealing) debe ser calculada o determinada empricamente para cada par de primersdemasiado alta = poco o nada de productodemasiado baja = annealing no especfico = productos incorrectosExtensin - a la temperatura ptima de la ADN polimerasa utilizadaej.: 72C para Taq

1 min/kb de longitud, dado que la Taq polimeriza 2000 pb/min

solo a partir del 3r ciclo son producidos ADN duplex de la longitud deseada, los cuales a partir de all se tornan en el producto principal

El ciclo de PCR

Nmero de ciclos -- algunos componentes se tornan limitantes despues de30 ciclos (si el nmero inicial = 105 molculas)- se necesitan >25 ciclos para amplificar un gen de copia nica a partir de ADN genmico de mamfero DNA

TermocicladorBloque/racks que cambian de temperaturaVarias marcasVarios formatos y sistemas multi-bloque.Reacciones en tubos o placas de 96-pozos microtitulacin

Cuantos ciclos?30-40 ciclosMs de 35 no mejora.Meseta (plateau):

Reactivos limitadosHibridacin de productosDao de polimerasa

Problema principal: acumulacin de falsos productos

Optimizacin de la reaccin PCRTemperatura de hibridacin de primers.Concentracin de Mg2+.pHTiempo de extensin.Tiempo de denaturacin e hibridacin.Cantidad de DNA plantilla, Taq polimerasa, nucletidos

Fidelidad de la Reaccin PCRTaq DNA polymerase no tiene la actividad 35 proof-reading (chequeo) presente en otras polimerasas. Taq incorpora 1 base errnea en 104.Un segmento de 400 bp target contendr 1 error en 33% de molculas en el ciclo 20.La distribucin del error ser aleatoria.

Tamao del amplicnTamao tpico alrededor de 100-1500 bp.Es posible >25 kb modificando buffers, dNTP, Mg y tiempo de extensin.Polimerasas Lmite terico depende de integridad de la palntilla originaria de DNA > 50 kb.

RT-PCR = PCR con transcriptasa reversaPara amplificar copias de cDNA de RNAEs especialmente til cuando solo se dispone de pequeas cantidades de RNAFrecuentemente usada para amplificar genes especficos (como cDNAs) si algo de su secuencia es conocidaRequiere primer antisense y un DNA polimerasa dependendiente de RNAPuede ser usada para construir bibliotecas de cDNAPrimero se hace un cDNA a partir del templado de ARNLuego se usa un segundo primer (sense) para hacer el duplex de cDNA por PCR

RT-PCRRequiere el conocimiento de la secuencia para disear GSP and GSP1

RT- PCRRNA es muy lbil en la naturaleza. Mayor parte de organismos defensa RNAsa.Preservacin de informacin de RNA: copias en DNACreacin de molculas de DNA a partir de RNA: 1era copia DNA de RNA, luego creacin de 2da hebra por PCR.Copia de mRNA luego de splicing (1.3% del genoma)Copia de otros RNAS: tRNA, rRNA, snRNA.Virus de RNA: VIH, rotavirus, oncovirus, etc.

AAAAATTTTT- Primer 55RT- PCR: 1 Copia cDNA de RNA5AGCTACCTCGATGG - Primer 5mRNA eucariota (cola poliA)Necesita dNTPs y RT (transcriptasa reversa) Las RT son de retrovirus: MMLV (Moloney murine leukemia virus) y AMV (Avian myeloblastosis virus)Cualquier RNA (necesita info de secuencia)

AAAAATTTTT- Primer 55RT- PCR: 1 Copia 1era hebra cDNA de RNA5AGCTACCTCGATGG - Primer 5mRNA eucariota (cola poliA)Cualquier RNA

AAAAATTTTT- Primer 55RT- PCR: Desaparicin de RNA5AGCTACCTCGATGG - Primer 5mRNA eucariota (cola poliA)Cualquier RNARNAasaRNAasa

TTTTT- Primer 5RT- PCR: 1era hebra DNATCGATGG - Primer 5mRNA eucariota (cola poliA)Cualquier RNA

TTTTT- Primer 5RT- PCR: 2da hebra DNATCGATGG - Primer 5Secuencia especfica del gen (previamente conocida)ACTTGA* Primers Aleatorios: hexmeros o nonmeros, etc****Paso siguiente clonacin en plsmido de expresin

TTTTT- Primer 5RT- PCR: 2da hebra DNATCGATGG - Primer 5Secuencia especfica del gen (previamente conocida)ACTTGA* Primers Aleatorios: hexmeros o nonmeros, etc****Paso siguiente clonacin en plsmido de expresin

Variantes de la PCRTouchdown PCRColony PCRMultiplex PCRHot start PCRNested PCRInverse PCRLong PCR

Multiplex PCRDescribe una PCR en la cual hay presentes multiples pares de primers lo que da una serie de productos. Los mismos pueden verse como mltiples bandas en un gel de agarosaMultiplex PCR es frecuentemente usada en diagnstico mdicoAhorra templado, tiempo y gastosRequiere una cuidadosa optimizacin

Multiplex PCRAmplificacin de varios amplicones pueden realizarse simultneamente. Usado en diagnstico: DMD, identificacin

Multiplex con fluorocromos

Nested PCRA veces 1 ciclo de PCR no da un producto nico a partir de un complejo templado, apareciendo un chorreadoSe puede resolver utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco mas internamente que los primerosRealizar un 2 ciclo de PCR usando el producto de la primera (chorreado)Da un producto nico porque solo el fragmento correcto de ADN posee los sitios correctos de hibridizacin para el segundo par de primers

Nested PCR2da PCRChorreado de ADN1era PCRADN especfico

Mutagnesis por PCRIntroduce cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN El mtodo de extensin solapada requiere 2 primers mutagnicos y otros 2Amplifica un fragmento 5 y un fragmento 3 que se solapan. Ambos portan la mutacinUsa los productos en otra reaccin para producir el ADN mutado de longitud completa

Mutagenesis con PCR- extension solapada

XLRP - RPGR exon 2 (G52X)RE: AgeI A CCGGT

Normal: A CCGGTMutante: A CCTGT

MNMutacin detectada por desaparicin de sitio de restriccin AgeI

Ventajas del PCRsRapidez (comparado a cultivos, Southern blot)

Facilidad/simplicidad (kits para agregar DNA)

Sensibilidad (poco DNA, mezclas, DNA antiguo)

Robustez (puede dar gran cantidad a partir de cantidades mnimas.

PCR - DesventajasNecesita previa informacin de secuencia

Tamao de amplificacin Limitado

Cantidades limitadas de producto

Fallas en replicacin

PCR - AplicacionesDeteccin de mutacionesMarcadores genticosDiagnstico de enfermedadesDiagnstico de patgenosIdentificacin de especiesIdentificacin de genesDNA sequencingMutagnesis in-vitro Estudios de expresin de genesMedicine ForenseArqueologa MolecularClonacin de segmentos de DNA