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PIPETAS AUTOMÁTICAS
Las pipetas son dispositivos que se caracterizan por
carecer de depósito y que se utilizan para medir o transvasar
pequeños volúmenes de líquido de un recipiente a otro con gran
exactitud. Inicialmente se fabricaron en vidrio pero hoy en día
existen una gran variedad de opciones. Podríamos hacer una
primera división en pipetas de volumen fijo y pipetas de volumen
variable. Las de volumen fijo son más precisas que las de
volumen variable, aunque cuando en un análisis se usa una de
volumen variable habiendo ajustado el volumen requerido y sin
variarlo más, su precisión es comparable a la de una pipeta de
vidrio graduada de clase A.
También podríamos dividirlas en pipetas manuales y
electrónicas, aunque estas últimas son mucho menos abundantes
debido fundamentalmente a su precio mucho más elevado, por lo
que nos centraremos en las manuales. A su vez también
podríamos distinguir entre pipetas monocanal y multicanal.
La pipeta mecánica o de pistón funciona generalmente
transmitiendo la fuerza que un operador, de forma manual, ejerce
sobre un émbolo que se encuentra unido a un pistón mediante un
eje que lo desplaza a lo largo de un cilindro de longitud fija,
forzando un volumen predefinido de líquido fuera de la pipeta.
Las pipetas a pistón son en general de dos tipos como
hemos visto antes: las de volumen fijo, que dispensan un volumen
predeterminado de líquido, el cual es conocido como volumen
nominal (Vn) y las de volumen variable que permiten ajustar el
volumen dispensado dentro de un rango determinado en las
especificaciones de la pipeta. La variación en el volumen se logra
modificando la longitud de la carrera del pistón dentro del émbolo
mediante un micrómetro. En estas de volumen variable el
volumen nominal es el límite superior del rango de volumen de la
pipeta, de acuerdo con las especificaciones dadas por el
fabricante.
Cada uno de los tipos mencionados se pueden
subdividir en dos subtipos: A y B. Las pipetas del subtipo A se
denominan pipetas de desplazamiento por aire o neumáticas,
debido a que existe un volumen de aire entre la cabeza del pistón
y el líquido en el cilindro (este es el tipo más corriente). A las
pipetas del subtipo B se les denomina pipetas de desplazamiento
positivo o de desplazamiento directo porque el pistón se
encuentra en contacto directo con el líquido.
Las pipetas de desplazamiento directo se recomiendan
para líquidos con alta densidad, alta viscosidad o alta presión de
vapor. Presentan el inconveniente de que las puntas a utilizar son
mucho más caras puesto que cada punta lleva su pistón
incorporado (a la manera de una jeringuilla). Es por esta
característica que también evitan contaminaciones cruzadas
provenientes de la pipeta o de aerosoles y muestras. Las pipetas
neumáticas usan puntas mucho más baratas pero no son tan
exactas como las de desplazamiento positivo cuando se trabaja
con volúmenes muy pequeños de líquido debido a la
compresibilidad del aire.
Todas las pipetas de pistón disponen de puntas
desechables para minimizar los riesgos de contaminación. Para
facilitar el uso del tipo de punta adecuado los fabricantes han
adoptado un código de color según el volumen a dispensar y que
en las de uso más general coincide con el color de las puntas
utilizadas.
Instrucciones para el manejo de una pipeta automática
Ajustar el volumen girando la rueda hasta que en la
escala aparezca el volumen deseado.
Colocar una punta de plástico (adecuada) en la punta de la
pipeta haciendo una leve presión para lograr un buen ajuste.
1. Oprimir el botón pulsador con el dedo pulgar,
hasta el primer tope y sin soltarlo introducir
verticalmente la pipeta, hasta que la punta se
sumerja de 2 a 5 mm dentro del líquido.
2. Liberar lentamente la presión sobre el botón.
Después de 2–3 segundos retirar, siempre
verticalmente, la pipeta del líquido deslizando la
punta contra la pared del recipiente.
3. Apoyando la punta contra la pared del recipiente
donde se quiere colocar el líquido, presionar
lentamente el botón pulsador hasta el primer
tope. Después de un segundo, y sin soltar el
botón pulsador, terminar de vaciar la pipeta
presionando hasta el segundo tope.
4. Retirar la pipeta deslizando la punta contra la
pared del recipiente.
RECOMENDACIONES GENERALES AL PIPETEAR
El empleo de una buena técnica al utilizar las pipetas puede
incrementar la exactitud hasta en un 5 %. Hay tanto aspectos
instrumentales y de condiciones ambientales como de técnica de
manejo de la pipeta.
EN LA TÉCNICA EMPLEADA
+ PROFUNDIDAD DE INMERSIÓN DE LA PUNTA
La profundidad de inmersión de la punta es especialmente
importante en el uso de volúmenes pequeños. Si la punta se
sumerge demasiado, se aspirará más líquido debido al aumento de
la presión. Si por el contrario, la punta no se sumerge lo
suficiente, se puede cargar aire con las consiguientes burbujas y
volumen inadecuado. Sumergir la punta a una profundidad
adecuada puede mejorar la precisión hasta un 5%.
+ UNIFORMIDAD AL PIPETEAR
Es fundamental mantener un ritmo, velocidad y técnica
adecuada al mover el émbolo. Una aspiración demasiado rápida e
incontrolada puede llevar a la formación de aerosoles,
salpicaduras y posible contaminación del eje y del pistón,
pudiéndose producir incluso pérdida de volumen de la muestra.
Una velocidad de pipeteo uniforme puede mejorar la precisión
también hasta un 5%.
+ ANGULO DE INMERSION VERTICAL
Se ha de procurar mantener el ángulo de inmersión de la
pipeta lo más cercano a la vertical posible. De otra forma, la
columna vertical de líquido será más pequeña y se aspirará
demasiada muestra. Por el contrario, al dispensar el líquido, la
punta se ha de mantener en un ligero ángulo frente a la pared del
vaso para asegurar un correcto vaciado. Se estima que pipetear de
forma vertical o como máximo dentro de un ángulo menor de 20º
de ésta, puede mejorar la precisión hasta en un 2,5%.
+ TÉCNICA DE DISPENSACIÓN
Para la mayoría de aplicaciones se recomienda dispensar
con el extremo de la punta apoyado contra la pared del recipiente.
Así se reduce o elimina el hecho de que se quede algo de muestra
en el interior de la punta después de acabar la dispensación.
Retirad la pipeta deslizando el extremo de la punta hacia arriba
por la pared lateral para liberar cualquier gotícula restante en el
orificio de la punta. Esta técnica puede mejorar la precisión hasta
en un 1%.
Otra técnica consiste en dosificar directamente en la
superficie del líquido. Es crucial usar una punta de pared fina para
que no quede ninguna gotícula en el interior de la punta. Si se
dispensa directamente dentro del líquido tendremos que sacar la
pipeta manteniéndola en el segundo tope para evitar una toma de
muestra después de la dispensación.
+ ENJUAGE PREVIO DE PUNTAS
Se recomienda enjuagar previamente las puntas como
mínimo dos veces con el líquido a pipetear para compensar la
película de líquido en el interior de la punta. El enjuage previo
también tiene otras ventajas: ayuda a neutralizar los efectos de
capilaridad e iguala la temperatura y humedad del aire del interior
de la pipeta con la temperatura y humedad de la muestra.
Todo esto puede suponer una mejora de hasta el 0,2% de la
precisión.(No es necesaria en pipetas a pistón de desplazamiento
positivo).
OTROS FACTORES QUE TAMBIÉN AFECTAN A LOS
RESULTADOS DEL PIPETEO
+ TRABAJAR SIN CAMBIOS BRUSCOS DE
TEMPERATURA
Procurad pipetear a una temperatura constante. La
temperatura óptima sería: que como veremos después
sería también adecuada para calibrarlas. Debemos evitar
repentinos o grandes cambios de temperatura ya que el aire del
interior de la pipeta no se puede adaptar rápidamente y esto puede
afectar al volumen. Pipetear a una temperatura constante puede
mejorar la precisión hasta en un 5%. Es por este motivo que
cuando pipeteamos durante un largo rato nuestra mano puede
calentar el aire del interior de la pipeta, expandiéndose y pudiendo
reducir la precisión hasta en un 1%. Es por esta razón que se
recomienda no sostener continuamente la pipeta en las manos y
entre ciclos, dejarla en su soporte o en la mesa.
+UTILIZACIÓN DE UNA PIPETA ADECUADA PARA EL
VOLUMEN QUE SE ASPIRA
La aspiración al 50% del volumen nominal de las puntas
consigue mejores resultados. Se recomienda trabajar entre el 35%
y el 100% del volumen máximo de la pipeta. Seguir este consejo
puede hacernos mejorar los resultados hasta en un 1%.
Cometemos mucho mayor error trabajando por debajo del 10%
del volumen nominal de la pipeta que estamos utilizando.
+ AJUSTE CORRECTO DEL MICROMETRO PARA EVITAR
LOS EFECTOS DEBIDOS A LA HOLGURA MECANICA
Cuando cambiemos el volumen de uno superior a otro
inferior simplemente hay que girar la rueda del micrómetro hacia
abajo hasta el volumen deseado. Por el contrario, cuando
incrementamos el volumen a pipetear, hay que subir la rueda
ligeramente por encima del volumen deseado para luego bajarla
hasta el deseado. Esto evitará el juego mecánico de las piezas y
contribuirá a una mejora del 0,5% en la precisión.
+ FACTORES ERGONÓMICOS
Para todos aquellos que pipeteen de forma repetitiva la
mayor parte de la jornada se recomienda usar pipetas
especialmente suaves de accionamiento porque es fundamental
que las manos estén lo más descansadas posibles. Normalmente
cada fabricante importante tiene en su gama algún modelo de este
tipo.
PARTE PRÁCTICA.
Nos centraremos en los dos tipos más comunes de
pipetas que podemos encontrar en los laboratorios, que son
pipetas tipo Gilson o tipo Eppendorf. Cada tipo tiene sus
particularidades, pero el procedimiento de calibración es el mismo
para ambas.
Partes especificadas:
A.- Botón de control
B.- Tuerca de conexión
C.- Junta de teflón
D.- Anillo de goma (O-ring)
E.- Caña
F.- Expulsor de la punta
Como diferencia fundamental las de tipo Gilson tienen el
pistón de acero inoxidable, una junta de teflón (C) y un anillo de
goma (D) que son los que garantizan el sello hermético. En las de
tipo Eppendorf, el émbolo es de un polímero orgánico (Fortron)
altamente resistente al calor, ácidos y bases, envejecimiento y
abrasión, y no lleva ni junta de teflón ni anillo de goma. Es una
ligera capa de silicona de vacío alrededor del émbolo la que
asegura la estanqueidad en este caso.
Para el caso en que pipeteemos ácidos es mejor usar una
de tipo Eppendorf puesto que sólo se nos deteriora con el tiempo
la capa de grasa. En una de tipo Gilson, acaba corroyéndose el
émbolo a pesar de acero (ver foto) con lo que tendremos que
sustituirlo para que la pipeta no gotee. Para evitar en lo posible
este efecto de los ácidos, Gilson ha sacado un kit de protección
anticorrosión para la P 1000 que consiste en una caña especial que
lleva acoplado un filtro antiácidos, siendo éste intercambiable (al
igual que el filtro de protección anti-salpicaduras de las P 5000).
Si no disponemos de este kit especial la casa recomienda una vez
después de haber usado la pipeta con líquidos ácidos o corrosivos
que emitan vapores, desmontar la caña y lavar el pistón, el anillo
de goma y la junta de teflón con agua destilada y una vez
completamente secas montar y comprobar funcionamiento.
Por calibración de pipetas se entiende la comparación entre
el volumen real y el volumen teórico. El volumen real se
determina por vía gravimétrica por lo que necesitaremos agua
destilada o desionizada y una balanza adecuada.
Para realizar la calibración de una pipeta seguiremos las
directrices dadas por la norma ISO 8655 (aparatos volumétricos
operados por pistón). Los premisas pricipales de dicha norma se
centran en 3 puntos fundamentales:
1º.- Condiciones ambientales
2º.- Utilizar una balanza adecuada
3º.-Minimizar el efecto de la evaporación en volúmenes inferiores
a 50 microlitros o tomar medidas adicionales para evitarla.
- CONDICIONES AMBIENTALES
Las calibraciones se deben realizar en una sala sin
corrientes de aire y con una temperatura comprendida entre 20ºC
y 25ºC sin variar más de Cº5,0 mientras dure el ensayo.
Asimismo se necesita una humedad relativa mayor del 50%. Con
anterioridad a la calibración se deberá dejar al menos 2 horas todo
el material a emplear para que alcance un equilibrio térmico con
la temperatura de la sala. Nunca deberá estar expuesto al sol
directamente. Necesitaremos disponer de un termómetro y
también un barómetro si calibramos pipetas de menos de 50 l y
debemos realizar ajustes por el efecto de la evaporación.
- UTILIZAR UNA BALANZA ADECUADA
Para el caso de calibraciones de pipetas de 10 l o
inferiores habrá de emplearse una balanza analítica de 5
decimales. Para pipetas de volúmenes más grandes es suficiente
utilizar una balanza de 4 decimales. Se aconseja el uso de vasos
de vidrio para minimizar los efectos de las cargas electrostáticas,
más importantes cuanto más pequeños son los volúmenes que
estamos midiendo.
- MINIMIZAR EL EFECTO DE LA EVAPORACIÓN
Para volúmenes pequeños (menores de 50 l ) podemos
usar algún recipiente específico de vidrio con tapa o situar un
vaso de precipitados pequeño con 10 ml de agua en el interior de
la balanza para inhibir la evaporación. Es más cómodo emplear el
recipiente especial porque nos simplificará los cálculos después.
Existen marcas que comercializan su propio juego de recipientes
para efectuar las calibraciones de sus distintos modelos.
PROCEDIMIENTO DE CALIBRACIÓN
Abriremos la pipeta para comprobar el estado de la junta
de teflón y el anillo de goma (Gilson). Si éstos presentan juego,
los sustituiremos. También verificaremos que la caña no esté
doblada y en buenas condiciones. En caso contrario, también la
cambiaremos.
Para el caso de las Eppendorf, retiraremos la grasa vieja
del pistón y procederemos a reengrasarlo ligeramente de nuevo
(es importante no poner demasiada).
Tras el enjuage previo de la punta al menos dos veces con
agua destilada, haremos un chequeo rápido con 3 medidas del
volumen nominal que nos darán una primera aproximación del
volumen que dispensa la pipeta. Si éste se desvía bastante del
esperado, procederemos al ajuste del micrómetro con la
herramienta adecuada para cada pipeta (en el caso de Eppendorf
se nos suministra al comprarla pero en Gilson tenemos que
adquirirla) y volveremos a hacer otra tanda de 3 medidas hasta
que éstas ya sean más cercanas a lo esperado. Posteriormente y
después del cambio de punta y enjuages previos de ésta al menos
dos veces, realizaremos ya la calibración propiamente dicha con
tandas de 10 medidas (4 mediciones sería el número mínimo
necesario para calcular la exactitud y precisión de una pipeta) de
las siguientes series de volúmenes:
+ volumen nominal (máximo admitido por la pipeta)
+ volumen inferior (mínimo o 10% del nominal – según
especificaciones del fabricante)
+ volumen medio (del 50% del valor nominal)
Para cada serie de valores obtenidos pasaremos a
calcular el error sistemático que nos dará la Exactitud
(proximidad de la medida a su valor real) y el error aleatorio,
que nos expresará la Precisión (grado de reproducibilidad de las
medidas) de la pipeta.
Exactitud
Es posible tener datos muy consistentes aunque estén
consistentemente equivocados. La inexactitud es la diferencia
numérica entre el valor medio de una serie de medidas y el valor
real. Una elevada exactitud (o pequeña inexactitud) significaría
que existiera poquísima diferencia entre el valor medio y el real.
La exactitud se consigue con una cuidadosa calibración de un
instrumento preciso.
Precisión
La precisión consistiría en la existencia de un buen
grado de reproducibilidad de las medidas realizadas. La precisión
no tiene un valor numérico, se cuantifica por la imprecisión. Así
una alta precisión (o pequeña imprecisión) significaría que
existiese muy poca variación entre medidas repetidas de la misma
muestra. Para conseguir un instrumento preciso se necesita una
buena técnica de manejo.
Exacto Preciso Exacto Impreciso
Preciso Inexacto Impreciso Inexacto
- Cálculo del Error Sistemático ( Exactitud )
Para el caso en que trabajemos con volúmenes inferiores a
50 l deberemos tener en cuenta los efectos de la evaporación
sustituyendo en las anteriores fórmulas Xi por: Xi . Z , donde Z es
un factor de corrección dependiente de la temperatura y la presión
y cuyos valores podemos obtener de la tabla de la siguiente
página ( Equivalencia: 1000 mbar = 100 kPa ).
Para poder comparar adecuadamente con los datos
facilitados por el fabricante debemos expresar los valores
obtenidos en la balanza en microlitros.
- Cálculo del Error Aleatorio ( Precisión )
Comparando los datos obtenidos con los errores
tolerados para las pipetas ensayadas podemos saber si nuestras
pipetas se encuentran dentro de las tolerancias especificadas por
el fabricante en cuanto a Exactitud y Precisión y por tanto siguen
siendo perfectamente utilizables . Lo más conveniente es llevar
una anotación de las calibraciones efectuadas y ponerle algún
adhesivo pequeño a la pipeta que nos indique la fecha de su
última revisión o calibración.
Podemos ajustar una pipeta para un líquido diferente al
agua pero en este caso deja de ser una pipeta de volumen variable
y pasa a ser una de volumen fijo empleado en la calibración y
solamente válida para ese líquido, por lo que si se realiza, hay que
marcar la pipeta convenientemente para que luego no existan
confusiones. Este procedimiento no es válido para líquidos con
presión de vapor elevada por lo que en estos casos, como se ha
indicado previamente, es aconsejable el empleo de una pipeta de
desplazamiento positivo o directo. De todas formas, cuando esto
no sea posible y para minimizar todo lo posible el error cometido
si usamos una pipeta neumática, se recomienda saturar la cámara
de aire de la pipeta aspirando y dispensando repetidamente el
solvente antes de aspirar la muestra y luego operando rápidamente
porque aunque nuestra pipeta habitualmente no gotee con
soluciones acuosas sí que es muy fácil que lo haga si trabajamos
con un líquido de menor densidad que ésta.
Actualmente lo más avanzado en el tema de las
calibraciones es el sistema de identificación por radiofrecuencia
que ha sacado Rainin en que la pipeta lleva un chip con el que se
puede seguir toda la vida de cada pipeta como nº de serie, fecha
de calibración, usuario al que pertenece, para qué se utiliza o
cualquier dato que queramos incluir.
Existen varios fabricantes de balanzas que ofrecen en
sus gamas de balanzas analíticas alguna especialmente adaptada
para la calibración de micropipetas como es el caso de la
mostrada a continuación que sirve para pipetas de hasta 1 µl (tara:
22g, resolución 1 µg), tiene apertura motorizada mediante célula
fotoeléctrica y presenta colector de evaporación integrado y
recipiente para residuos de 10 ml de capacidad para pipetear de
forma rápida y sin interrupciones.