Aplicación de técnicas moleculares para p pel estudio de la biodegradación de

hidrocarburos

Presenta: M. en B. Olivia Tzintzun Camacho

Laboratorio de Residuos Sólidos W-108 y W-103

ÓINTRODUCCIÓN

Sitios contaminados por petróleo

Técnicas de remediación de suelos

Técnicas tradicionales o Técnicas innovadorasTécnicas tradicionales o establecidas

Técnicas innovadoras

Incineración Extracción de vapores del sueloMezclar enterrar y cubrir Aspersión de aireMezclar, enterrar y cubrir Aspersión de aire

Dispersión sobre el terreno Desorción térmicaSolidificación Deshalogenación química

Reuso y Reciclado Enjuague del suelo in situExtracción con solvente

Lavado del sueloBajo costoMedidas Fitocorrectivas

Biorremediación

-Bajo costo

-Degradación del contaminante

No perjudica las-No perjudica las propiedades del suelo1

1. Rahman et al., 2002

Biorremediación

Uso de consorcios microbianos para p

la remediación

Consorcios

Biodegradación de hidrocarburosLa degradación de hidrocarburos puede darse por:

Cultivos mixtosCultivos puros

Biodegradación de hidrocarburosLa degradación de hidrocarburos puede darse por:

Efectos sinérgicos entre las Efectos sinérgicos entre las poblacionespoblaciones

(M k d(M k d t lt l 2008)2008) Cultivos mixtos(Mukred (Mukred et al.et al., 2008), 2008)

La cooperación entre las La cooperación entre las actividades metabólicas de las actividades metabólicas de las

poblacionespoblaciones(Wang (Wang et al.et al., 2006), 2006)

Degradación por cultivos mixtos

La capacidad de degradación de un consorcio microbiano depende

Asociaciones poblacionales que se establecenLos mecanismos

pueden ser complejospueden ser complejos

CapacidadCapacidad metabólica de cada

una de las cepas

Remover metabolitos Degradar compuestos ¿ De dónde se bti l

(Ghazali et al., 2004).

producidos por otras poblaciones

g poxidados parcialmente obtienen los

microorganismos ?

Aislamiento de microorganismos gdegradadores

Pantano contaminado en VeracruzVeracruz

Identificación de microorganismos degradadoresdegradadores

Electroforesis en Gel con Gradiente de Desnaturalización (DGGE)(DGGE)

Técnica de huella, rastreo o t d l l ( l ltrazado molecular (molecular

fingerprinting )

Identificación de microorganismos degradadores

Procedimiento para DGGE

1. Extracción de DNA

Lisis celular (SDS)

Digestión con (RNAasa)

Precipitación de proteínas

Recuperación d DNALavado del de DNA

(isopropanol)

Lavado del DNA (etanol)

Hid t ióHidratación del DNA

(Buffer TE)

Identificación de microorganismos degradadores

Procedimiento para DGGE

2. Amplificación de la región variable V6-V8 del gen 16SrDNA por PCR

Identificación de microorganismos degradadoresReacción en Cadena de la

Polimerasa (PCR)Polimerasa (PCR)

DNA molde

dNTPs

MgCl2Taq polimerasa

Primers

Buffer

Identificación de microorganismos degradadores

3. Visualización de los productos de la región variable V6-V8 del gen 16SrDNA por PCR

PCR ió V6 V8

1 2 3 4 5

PCR región V6- V8 16SrDNA

470 pbpb

Identificación de microorganismos degradadores

4. Preparación del gen de poliacrilamida y desarrollo del DGGEAgentes

desnaturalizantes: urea y formamida

44%

54%

Identificación de microorganismos degradadoresdegradadores

4. Preparación del gen de poliacrilamida y desarrollo del DGGE

Muyzer et al., 1996

Identificación de genes catabólicos

gen gen alkalkBB

Pseudomonas oleovorans:Pseudomonas oleovorans:Peters J, Witholt B. Biochim Biophys

Acta (1994) 1196(2): 145-53.

β-Oxidación (Whyte (Whyte et alet al., 2002)., 2002)

Identificación de genes catabólicos

El plásmido OCTde Pseudomonade Pseudomonaoleovoranscontiene dosoperonesalkBFGHJKL yalkBFGHJKL yalkST.

¿Qué se hace

(van Beilen et al., 1994)

¿Qué se hace experimentalmente?

Identificación de genes catabólicosEtapa °C Tiempo Ciclos

Desnaturalización inicial 94°C 1 min 1

Desnaturalización 94°C 1 min

30Alineamiento 50°C 1 min

Extensión 72°C 2 min

Extensión final 72°C 10 min 1

Identificación de genes catabólicos

Identificación de genes catabólicosS i ióSecuenciación

Identificación de genes catabólicosS i ióSecuenciación

Identificación de genes catabólicosS i ióSecuenciación

Uso de herramientas moleculares para estudiar la biodegradación de hidrocarburos

Identificar cepas bacterianas(DGGE)( )

Dinámica de las poblacionesdurante la degradación dehidrocarburos.

Identificación de genescatabólicos (PCR)

Expresión de los genesExpresión de los genescatabólicos (PCR-TR)

Díaz-Ramírez et al., 2008

Uso de herramientas moleculares para estudiar la biodegradación de hidrocarburos

Expresión de los genescatabólicos (PCR-TR)

Powell et al., 2006

Grupo de trabajo del Laboratorio de Residuos Sólidos