Anlisis gentico de anemia falciforme

CibertorioAnlisis gentico molecular de la anemia falciformep.1CibertorioAnlisis del polimorfismo Diagnsticop.3

Guin de la prctica

Diagnstico gentico molecular del polimorfismo de globina beta S mediante RFLP (Prctica en laboratorio virtual Cibertorio)

Fundamento:

La anemia drepanoctica (anemia de clulas falciformes) se origina por la mutacin de un solo nucletido en el gen de globina beta humana. Esto genera en la poblacin un polimorfismo, definido por la presencia del alelo normal o el mutado, en cada uno de los dos cromosomas 11 homlogos.

Pretendemos estudiar el posible diagnstico gentico de esta enfermedad a travs de un polimorfismo RFLP, es decir, mediante restriccin y electroforesis.

Como material de partida disponemos de muestras de DNA (virtuales) correspondientes a una parte de ese gen, para las dos variantes (normal, AA o WW, y drepanoctica, SS).

Por lo tanto, vamos a estudiar un locus que corresponde a una parte del gen de globina beta y que contiene el punto polimrfico.

Ms informacin (no necesaria para la prctica):Concretamente, las muestras comprenden el exn 1, el intrn A, el exn 2 y parte del intrn B.

Recuerda que el polimorfismo se sita en el exn 1.

Aclaracin de la nomenclatura:A la hemoglobina normal del adulto, 2 2 , se la llama habitualmente hemoglobinaA; de ah el nombre A para el alelo normal de la globina beta aqu estudiado. Tambin se representa como W, de wild type (tipo salvaje o silvestre).

La hemoglobina de las clulas falciformes (sickle cells), 2 S2 , se denomina hemoglobinaS.

A lo largo de la prctica tendrs que conservar informacin para pasarla de una ventana a otra del programa; utiliza para ello el Bloc de Notas de Windows. Conviene que aadas tus propios comentarios para identificar la informacin que vas guardando; puedes imprimirlo al acabar, para llevarte toda la informacin e incluirla en tu cuaderno de prcticas.

Ayuda para copiar y pegar texto: utiliza el men que aparece al pulsar el botn derecho del ratn o, con el teclado, pulsa Ctrl+C para copiar y Ctrl+V para pegar.

Bibliografa:

J. Luque y A. Herrez (2001) Texto Ilustrado de Biologa Molecular e Ingeniera Gentica, pgs. 381-383. Ediciones Harcourt / Elsevier Espaa, Madrid.

Cmo comenzar:

El laboratorio virtual funciona dentro de una pgina web, por lo que debes comenzar abriendo el navegador de internet (Internet Explorer o Firefox).

Una vez que se abra el programa, debes buscar la pgina de Cibertorio:

Puede estar en los Favoritos o Marcadores; si no, visita http://biomodel.uah.es/lab/cibertorio/ Ensayo:diagnstico gentico de drepanocitosis mediante RFLP

Objetivo:

Empleando una enzima de restriccin elegida previamente, que corta de forma diferente los alelos normal y mutado del gen de globina beta, realizar el diagnstico gentico de cuatro pacientes.Materiales virtuales:

Software:

Laboratorio virtual de biologa molecular Cibertorio

Reactivos virtuales:

Enzimas de restriccin (deben comprarse en BobCoTM, como se explica ms adelante)

Grupo de muestras para diagnstico gentico (tambin comprado en BobCoTM), que contiene las siguientes muestras de DNA:

DNA del gen de globina de una persona homocigtica normal (representada como AA o WW).

DNA del gen de globina de una persona homocigtica falciforme (representada como SS).

Cuatro muestras de DNA de pacientes cuyo genotipo se pretende averiguar (designadas Pt1, Pt2, Pt3 y Pt4).

Marcador de masa molecular de DNA (gratuito, de BobCoTM)

Tampn universal de restriccin 10x (gratuito, de BobCoTM)

Agua

Puntas de pipeta amarillas, capacidad de 1 a 100 L

Agarosa

Tampn de electroforesis TBE (Tris/Borato/EDTA)

Bromuro de etidio

Colorante de carga de muestras en el gel (contiene azul de bromofenol, xileno-cianol y glicerol)

Instrumentacin virtual:

Micropipeta variable hasta 100 L

Incubador con regulacin de temperatura BobCo Temp-O-MaticTM Cubeta de electroforesis horizontal en agarosa BobCo Gel-O-MaticTM Fuente de corriente continua BobCo 1000ZXTM (de 10 a 1000V)

Transiluminador ultravioleta (acoplado a la cubeta)

Pantalla y gafas de seguridad protectoras contra UV Procedimiento:

Debes haber realizado previamente la prctica ensayo de enzimas de restriccin. Ahora, utilizando nicamente la enzima adecuada para detectar este polimorfismo (seleccionada en la prctica anterior), realizars el anlisis de cuatro muestras de pacientes a los que hay que diagnosticar si son portadores del alelo causante de la drepanocitosis.

1) Si no lo has hecho ya, sigue las instrucciones de la prctica de ensayo de enzimas para comprar muestras y enzimas en el impreso de pedido en lnea de BobCo, as como para usar el laboratorio virtual.

2) Prepara una tabla con los reactivos y cantidad de cada uno que necesitars para cada tubo: tubo n123456

vol. de agua

vol. de tampn

tipo de muestraSSAAPt1Pt2Pt3Pt4

vol. de muestra22 (L22 (L22 (L22 (L22 (L22 (L

volumen total80 (L80 (L80 (L80 (L80 (L80 (L

Prepara los 6 tubos de ensayo con el contenido indicado en la tabla.

A continuacin, transfiere la mitad del contenido de cada tubo (40 (L) al tubo situado debajo de l (es decir, del tubo 1 al 7, del 2 al 8, etc.). As has creado duplicados de cada tubo, uno quedar como control y al otro aadiremos enzima de restriccin.

A los tubos 7 a 12 aade ahora 1 (L de la enzima de restriccin que seleccionaste en la prctica ensayo de enzimas de restriccin.3) Pon en marcha la reaccin de restriccin pulsando en el botn Comenzar. Transcurrido el tiempo virtual requerido, se ha completado la reaccin.

4) En el men principal de Cibertorio, selecciona el mdulo Laboratorio de electroforesis. Pulsa el botn Autocargar, que har que las 12 muestras preparadas en la digestin anterior se transfieran a los 12 primeros pocillos del gel virtual; en el pocillo n 13 se carga automticamente una mezcla de patrones de tamao (escalera de DNA).

5) Ajusta en la fuente el voltaje a 200 voltios y el tiempo a 2,5 horas virtuales. Conecta la corriente para comenzar la electroforesis. Mientras progresa, puedes encender la luz UV (asegrate de tener puestas tus gafas o careta virtuales de proteccin) y apagar las luces de la habitacin virtual para ver cmo va avanzando el DNA y separndose las bandas.

6) Una vez completada la electroforesis, dibuja un esquema de la posicin de las bandas e interpreta los resultados obtenidos: cul es el genotipo de los cuatro pacientes? Sern portadores o desarrollarn la enfermedad?

22/03/10versin 5