POST-PRACTICA MÉTODOS Y TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE AGENTES FITOPATÓGENOS (CULTIVO TRAMPA (MANZANA) PARA Phytophthora, siembra de Phytophthora, )

7/23/2019 POST-PRACTICA MTODOS Y TCNICAS DE AISLAMIENTO DE AGENTES FITOPATGENOS (CULTIVO TRAMPA (MANZAN

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GUATEMALA 16 DE SEPTIEMBRE 2011

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALAFACULTAD DE AGRONOMA

POST-PRACTICA MTODOS YTCNICAS DE AISLAMIENTO DE

AGENTES FITOPATGENOS(HONGOS Y CHROMISTAS)LABORATORIO INTRODUCCIN A LA FITOPATOLOGAIng. Agro. GUSTAVO ADOLFO LVAREZ VALENZUELA

Pec Hernndez Marvin MateoCarne: 200915859

Lunes Vespertina.


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FACULTAD DE AGRONOMA

LABORATORIO INTRODUCCIN A LA FITOPATOLOGA 1

NDICE1. INTRODUCCIN ................................................................................................................................... 32. OBJETIVOS ............................................................................................................................................. 33. MARCO TERICO ................................................................................................................................. 4

3.1. Mtodos y tcnicas para el aislamiento de agentes fitopatgenos a partir detejido vegetal ............................................................................................................................................ 4

3.1.1. Preparativos para el aislamiento (Segn Agrios) ................................................................. 43.1.2. Aislamiento de hojas ........... .......... ........... .......... .......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... .... 5

4. MATERIALES Y MTODOS ................................................................................................................ 64.1. Materiales. ...................................................................................................................................... 64.2. Metodologa. .................................................................................................................................. 6

4.2.1.

Procedimiento para efectuar la siembra .................................................................................. 6

4.2.2. Cultivo trampa .................................................................................................................................... 34.2.3. Tcnica de solucin de extracto de suelo ................................................................................. 6

5. RESULTADOS Y DISCUSIN ............................................................................................................. 85.1. Aislamiento de agentes fitopatgenos ................................................................................. 85.2. Cultivo Trampa. ......................................................................................................................... 105.3. Tcnica de solucin de extracto de suelo ......................................................................... 12

5.3.1.1. Observaciones al Microscopio. ......................................................................................... 136. CONCLUSIONES ................................................................................................................................. 157. BIBLIOGRAFA ................................................................................................................................... 168. anexos .................................................................................................................................................. 17

8.1. Qu otras tcnicas de aislamiento se conocen para microorganismos queafectan plantas, ..................................................................................................................................... 17

8.1.1. Aislamiento de hojas ........... .......... ........... .......... .......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... . 178.1.1.1. Induccin al desarrollo micelar ....................................................................................... 17

8.1.1. Aislamiento de tallos, frutos y otros rganos areos de la planta .......... .......... .......... 178.1.1. Cultivo lquido ................................................................................................................................. 178.1.1. Placas de suelo de Warcup ......................................................................................................... 178.1.1. Fraccionamiento de la comunidad de hongos del suelo ................................................. 178.1.1. Filtracin de partculas ................................................................................................................ 18


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8.2. Investigue que tipo de medios selectivos son utilizados para desarrollaralgunos microorganismos (Hongos y bacterias),...................................................................... 188.3. Cmo puede saber que medio utilizar cuando desea aislar un organismopatgeno a plantas (hongos o bacteria)? ..................................................................................... 20

8.3.1. Medios Bsicos ................................................................................................................................ 208.3.2. Medios Enriquecidos..................................................................................................................... 208.3.3. Medios Selectivos ........................................................................................................................... 208.3.4. Medios Diferenciales ..................................................................................................................... 218.3.5. Medios para hongos ...................................................................................................................... 218.3.6. Medio para bacterias .................................................................................................................... 218.3.7. Agar V 8 .............................................................................................................................................. 218.3.8.

Medio YDC (Levadura, Dextrosa, Calcio)............................................................................... 21

NDICE DE FIGURAS

Figura No 1 Preparativos para el aislamiento .................................................................................................. 4Figura No 2 Metodologia de aislamiento de hongos en hojas. ................................................................... 5Figura No 3 Lesiones provocadas por generos del phyllum Oomycota ................................................. 5Figura No 4 Colonizacion por hongos Oomycota ............................................................................................ 5Figura No 5 Mancha negra en Rosa ...................................................................................................................... 8Figura No 6 Organismo aislado de hoja de rosa ........... .......... ........... .......... ........... .......... .......... ........... ......... 8Figura No 7 Espora asexual. bicelular esporas de hongos del anamorfo Marssonina rosae .......... 9Figura No 8 Espora sexual Apotecio, Ascospora y ascas .............................................................................. 9 Figura No 9 Manzana Inocualda con suelo (Magnolia). ........... .......... ........... .......... ........... .......... .......... ... 11Figura No 10 Manzana Inoculada con raiz de Magnolia. ........................................................................... 11Figura No 11 Manzana inocualda con raiz de Magnolia .......... .......... ........... .......... ........... .......... .......... ... 11Figura No 12 Siembra en Medio selectivo PARPBH y siembra se semilla en solucion de suelo delas manzanas que dieron positivo la prueba del cultivo trampa. .......................................................... 12Figura No 13 Semilla en solucion de suelo. .................................................................................................... 12Figura No 14 Semilla en solucion de suelo. .................................................................................................... 13Figura No 15 Montaje del micelio del Oomycota a las 24 horas de la siembra en solucion desuelo ............................................................................................................................................................................... 13Figura No 16 Micelio de Phytophthora ............................................................................................................ 14Figura No 17 Micelio de Phytophthora a las 48 horas despues de la simbra ................. ........... ...... 14
http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074812http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074812http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074813http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074813http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074814http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074814http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074814http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074814http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074815http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074815http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074816http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074816http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074817http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074817http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074818http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074818http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074819http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074819http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074819http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074820http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074820http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074821http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074821http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074822http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074822http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074822http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074823http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074823http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074824http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074824http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074824http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074823http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074822http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074822http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074821http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074820http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074819http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074819http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074818http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074817http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074816http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074815http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074814http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074813http://c/Documents%20and%20Settings/PEC%20HERNADEZ/Escritorio/SEXTO%20SEMESTRE/INTRODUCCION%20%20A%20LA%20FITOPATOLOGIA/REPORTES/POST-PRACTICA%20No%205.docx%23_Toc304074812


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1. INTRODUCCINEn la estructura de los hongos patgenos, las diversas formas que desarrollan: Estructurasvegetativas. Estructuras propagativas. Estructuras reproductivas. Estructuras deconservacin. Todo estos datos entran en juego cuando se quiere clasificar a los diferentesagentes fitopatgenos.

Para que se logre observar las diferentes estructuras que se mencionaron anteriormente esnecesario en algunas ocasiones y en algunos tipos de hongos fitopatgenos en especial que senecesita de poder aislarlos para determinar el agente causal.

El aislamiento consiste en el proceso de separacin de microorganismos a partir de su sustratonatural (plantas, hojas, tubrculos, tallo races o suelo) para hacerlas crecer en un medio decultivo artificial (Por ejemplo medio PDA). El aislamiento y cultivo persigue diversos fines, elms comn en un laboratorio de fitopatologa es para diagnosticar la causa de una enfermedaddesconocida.

El cultivo de microorganismos tiene enormes ventajas que contribuyen al conocimiento de labiologa de estos. Sin embargo, hay que considerar que al cultivar un organismo:

Los hongos pueden o no formar cuerpos fructferos en medios artificiales; estoscuerpos pueden presentar variacin,Existen hongos que no se pueden cultivar (parsitos obligados) y otros que requierenmedios complejos para su desarrollo.

Las tcnicas para aislar hongos son diversas y dependen del hongo a estudiar a continuacin

se presenta una recopilacin de informacin sobre los tipos de tcnicas de aislamiento de losdiversos hongos fitopatgenos que afectan a los cultivos de importancia agrcola.

2. OBJETIVOS

Conocer cuando se utiliza el mtodo de aislamiento como siembra directa. Conocer la tcnica de aislamiento de siembra en solucin de suelo. Conocer las dimensiones utilizadas en la perforacin de la manzana en el la tcnica de

aislamiento conocida como cultivo trampa.

Determinar el tiempo que tarda en reaccionar la manzana verde inoculada con raz deplanta para determinar la presencia de oomycotas.

Determinar el organismo oomycota


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3. MARCO TERICO3.1. Mtodos y tcnicas para el aislamiento de agentes fitopatgenos a partir de

tejido vegetal

La mayora de las enfermedades de las plantas se diagnostican al observarlas a simple vista omediante al microscopio, lo cual hace innecesario el aislamiento del patgeno. Sin embargo,hay muchas enfermedades bacterianas y fungosas en las que es imposible identificar alpatgeno que ya se encuentra mezclado con uno o ms contaminantes, porque an no haproducido sus cuerpos fructferos caractersticos y esporas, debido a que una mismaenfermedad puede deberse ya sea a uno o a varios patgenos morfolgicamente semejantes otal vez a algn factor del ambiente, o bien a que la enfermedad es causada por un nuevopatgeno hasta ese momento desconocido, el cual debe aislarse y estudiarse.

Como es habitual, los patgenos de enfermedades desconocidas deben aislarse de los tejidosenfermos de una planta a fin de que se pueda llevar a cabo un estudio de sus caractersticas,hbitos, etc

3.1.1. Preparativos para el aislamiento (Segn Agrios)Siempre que se desee aislar una bacteria o un hongo patgeno de los tejidos de una plantaenferma, deben llevarse a cabo los siguientes procedimientos preliminares.

Figura No 1 Preparativos para el aislamiento


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3.1.2. Aislamiento de hojasEn caso de que la infeccin de las hojas de una planta avance en forma de tizn o mancha foliarfungosa y en caso de que las esporas del hongo aparezcan sobre su superficie, algunas de esasesporas deben depositarse sobre una caja de Petri que contenga medio de cultivo.

En ocasiones, el aislamiento del patgeno a partir de tizones y manchas foliares bacterianas ofungosas se logra mediante la esterilizacin superficial de la zona infectada con soluciones deCloro o de Rada, separando una pequea porcin del tejido infectado con un escalpelo estril uotro objeto y colocndola en una caja de Petri que contenga un medio nutritivo.Sin embargo, el mtodo ms comn para aislar a los patgenos de las hojas infectadas y deotros rganos de la planta es aquel en el que se seleccionan varios cortes pequeos de 5 a 10mm2 a partir del borde de la lesin infectada, a fin de que contenga tejidos enfermos y tejidosal parecer sanos (figura 2).

Los cortes esterilizados en su superficie durante menos tiempo generalmente contienen alpatgeno y a varios contaminantes, mientras que los que se han esterilizado durante mstiempo no permiten el desarrollo de cualquier tipo de microorganismos debido a que han sidodestruidos por el esterilizante de superficie.

Figura No 2 Metodologia de aislamiento de hongos en hojas.


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4. MATERIALES Y MTODOS4.1. Materiales.

Material vegetal enfermo,Una manzana o tomate verde,Caja con instrumental delaboratorio,Cristalera estril (vidrios de reloj ycajas Petri),Medios de cultivo,Mechero,Alcohol,Hipoclorito de sodio,

Agua destilada y estril,Papel absorbente estril,Asa,Pinzas,Atomizador,Papel absorbente,Film,Marcador indeleble,Microondas,Campana de flujo laminar.

4.2. Metodologa.4.2.1. Procedimiento para efectuar la siembra

Las porciones de tejido vegetal se depositaron en el primer vidrio de reloj(agua estril).

Seguidamente se traslado al vidrio de reloj que contiene alcohol,permanecio durante 30 seg.

Posteriormente se traslado al siguiente vidrio de reloj que contiene aguaestril, para eliminar el exceso de alcohol.

Seguidamente se procedio a pasarlos al siguiente vidrio de reloj conhipoclorito de sodio, permanecio durante a 30 segundos.

Posteriormente se paso sucesivamente en los dos vidrios de reloj quecontienen agua estril.


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Se colocar las porciones de tejido sobre una hoja de papel filtro estril,para quitarles el exceso de agua.

Pasar las porciones de tejido a papel estril con el fin de eliminar elexceso de agua en los tejidos.

Depositar las porciones de tejido en la caja petri o tubo de ensayo dondese har crecer el microorganismo.

Cuidar que el recipiente se encuentre cerca de la llama del mechero,evitar exhalar sobre el medio de cultivo.

Previo a introducir el tejido enfermo, debe flamear la boca del recipientedonde se cultivar el microorganismo.

Las cajas petri debern identificarse con el nombre de la persona y da delaboratorio e incubarse a 28 C durante 8 das.


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4.2.2. Cultivo trampa

Desinfeccin del rea detrabajo

Desinfeccin de Manzana

Desinfeccin del material raz de magnolia

Con un sacabocados a cada fruta se le hacen de 3a 4 perforaciones, (1x1 cm.) y con una

profundidad de 1.5 cm


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Posteriormente incuban en un recipiente cerrado a temperatura ambiente por espacio de 36 a48 horas, luego de las cuales pueden verse las lesiones ocasionadas por Pythium oPhytophthora alrededor de los puntos de inoculacin. En la figura 3 se muestra un proceso de

incubacin a medio ambiente.

Cuando la inoculacin resulta positiva y el agente coloniza dentro de la manzana, puedenobservarse lesiones firmes color marrn rodeando los puntos de inoculacin. En la figura 4 semuestran los sntomas desarrollados y considerados como positivos a la presencia deOomycetos en frutas de manzana inoculadas con un sustrato considerado como sospechoso decontener a alguno de estos patgenos

Llenar agujeros con material raz demagnolia

Llenar agujeros con materialraz de magnolia Sellarlo y

colocarle fecha

Incubarlo a temperaturaambiente


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Figura No 3 Lesiones provocadas por generos del phyllum Oomycota

Figura No 4 Colonizacion por hongos Oomycota

Se procedio al aislamiento in vitro en medio de cultivo selectivo (PARPBH ), para ello secortan las manzanas que presentan sntomas positivos y se procedio a extraer tejido infectadode pulpa en la regin ms externa de la lesin o zona de avance. Se muestra la forma en que esseparada cada una de las lesiones y se procede a observar su consistencia y velocidad deavance.

Simultneamente se procede a cultivar las semillas de la fruta en solucin de suelo para quegenere estructuras reproductivas.


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4.2.3. Tcnica de solucin de extracto de suelo

1 Se peso 50 g de suelo y se mezclo con 500 cc de agua.

2 Se dejo por 24 horas reposando la solucin.

3 Se tomaron 100 cc de la solucin y se aforo a 1000 cc con agua destilada

4 Se esterilizo en autoclave por 20 minutos a 15 psi

5 La solucin se dejo enfriar y est lista para utilizar.

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Para provocar desarrollo de esporangios, se colocaron en una caja de Petri, 10cc de la solucin y se depositaron en ella las semillas con micelio de Pythium yPhytophthora, provenientes de las manzanas inoculadas con suelo o races y quehabian dado positivo.

7

Se identifican las cajas y se dejaron temperatura ambiente . El micelio crece enel trmino de 24-48 horas


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PositivoDesinfeccin rea de trabajo

Solucin de suelo

Preparacin rea de trabajo rea de trabajo

Corte de la manzana

Siembra del Oomycota en medio de cultivoselectivo (PARPBH)

Siembra de Semillas en solucin de suelo

Sellado he identificacion


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5. RESULTADOS Y DISCUSIN5.1. Aislamiento de agentes fitopatgenos

En las hojas se observaron diferentes manchas

grandes de color pardo a negro, tena la forma deestrella. Las hojas se tornan de un color amarillo yposteriormente se caen.

Esta enfermedad debilita a la planta debido a quesu fuente de produccin de nutrientes es afectadon este caso es la hoja

Se tomaron pedazo tanto de la parte sana comoenferma de la hoja afectada como se menciona en

la metodologa.

El hongo inverna en forma de micelio o como ascsporas y conidios en las hojas y tallos de losrosales infectados ambos tipos de esporas producen infecciones primarias de hojas en laprimavera mediante penetracin directa. El micelio se desarrolla en el mesfilo, pero al cabode dos semanas forma acrvulos y conidios en el haz de la hoja (fase sexual).

De los aislamientos realizados no se logr lasiembra correcta solo uno de los cuatro reacciono

al medio empezando a crecer los micelios delhongo, pueden haber varios motivos por loscuales no se logr que los dems pedazos de tejidono hayan crecido en el medio puede que el tejidotomado simplemente no contena al hongo, otra delas causas puede ser que los tejidos se hallancolocado demasiado tiempo en los compuestostanto de alcohol o hipoclorito, esto debido a quecomo se observa en la figura 6 las porciones de

tejidos parecer estar muertas o secas dentro delmedio de cultivo.

Segn varias investigaciones en literatura el agente causal de la enfermedad el cual se aislprobablemente es Diplocarpon rosae que es conocida comnmente como la mancha negra dela rosa.

Figura No 6 Organismo aislado de hoja de rosa

Figura No 5 Mancha negra en Rosa


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Diplocarpon rosae es un hongo que causa la rosa Punto Negro enfermedad. Debido a que fueobservado por personas de varios pases al mismo tiempo (alrededor de 1830), lanomenclatura de los hongos variados con cerca de 25 nombres diferentes. La etapa asexual sesabe ahora que Marssonina rosae , mientras que el estado sexual y ms comn se conoce comoDiplocarpon rosae .

Diplocarpon rosae en temporadas como micelio, ascosporas y conidias en las hojas y tallos. Enla primavera durante condiciones hmedas y hmedas, ascosporas y conidios son llevados porel viento y la lluvia salpica al tejido de la hoja de reciente aparicin. Tras la infeccin, laenfermedad progresa a partir de las hojas ms bajas hacia arriba provocando la defoliacin ymanchas de negro en las hojas. Pertenece al phyllum ascomycota

Este hongo ascomycota en su fase asexual sele conoce como Marssonina rosae y como seobserva en la figura 7, lo que se esperara es

observar las esporas bicelular. Es muycaracterstico en este hongo.

Fuente:http://www.ipmimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5368965

En la fase sexual lo que se observara serauna estructura de resistencia del tipo apotecioque dentro tendra ascosporas y dentro deestas se encontraran ascas, debido a esto esque a este hongo se le clasifica en el phyllum

ascomycota.

Fuente:http://www.ipmimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5390063

Figura No 7 Espora asexual. bicelular esporas de hongos delanamorfo Marssonina rosae

Figura No 8 Espora sexual Apotecio, Ascospora y ascas
http://www.ipmimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5368965http://www.ipmimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5368965http://www.ipmimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5368965http://www.ipmimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5390063http://www.ipmimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5390063http://www.ipmimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5390063http://www.ipmimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5390063http://www.ipmimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5368965


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5.2. Cultivo Trampa.FOTOGRAFA (SIEMBRA DE RAZ DE

MAGNOLIA)FECHA CARACTERSTICAS

30/08/2011

En esta fotografa lo que seobserva es el hongo recin

inoculado por lo que todavano muestra indicios de

presencia del Oomycota.

01/09/2011

A las 48 horas todava lamanzana no mostraba

caractersticas de presenciadel hongo, sin embargo cabedestacar que la consistenciade la manzana ya no era lamisma como se mostraba

inicialmente.

02/09/2011

La manzana que contena lasraces de magnolia que se

sospechaba que estaba

infectada con phytoptora erala que ms indiciosmostraba de la presencia del

Oomycota

05/09/2011

Tanto la manzana quecontena suelo como las que

contenan races, era un

diagnostico positivo de lapresencia del Oomycota.


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La manzana que contena suelo fue la que tardo ms enreaccionar a la presencia del Oomycota esto puede serporque las condiciones ambientales del suelo no eran las

ptimas en el momento de la tomas de la muestra por lo quela cantidad de Oomycotas presentes no era tan alta.

Unas de las manzanas que fue inoculada con races deMagnolia (Magnolia guatemalensis ) esta fue reacciono enmenor tiempo en comparacin con la que fue inoculadacon suelo, esto no da la pauta de que la planta estabainfestada con el Oomycota.

La tercera manzana al igual que la segunda que tambin fueinoculada con races de la planta infestada con el Oomycota,presentaba una diagnostico positivo de la presencia del hongo.

Esto corrobora lo que se intua de debido a que la plantadonde fueron tomadas las muestras presentaba sntomascaractersticos de la presencia del Oomycota.

Figura No 9 Manzana Inocualda consuelo (Magnolia).

Figura No 10 Manzana Inoculada conraiz de Magnolia.

Figura No 11 Manzana inocualdacon raiz de Magnolia


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5.3. Tcnica de solucin de extracto de suelo

Las tres manzanas a las cuales se les practic laprueba del cultivo trampa y dieron positivo tambin

pasaron a la siguiente prueba el cual era ladeterminacin del genero de Oomycota el cual era laque estaba afectando a las plantas.El Oomycota trata de moverse hacia el centro de lamanzana porque tiende a llegar a las semillas estodebido a que las semillas son ricas en energa, porqueestn llenas de reservas para la nueva planta quegerminara por eso el Oomycota busca siempre llegara ella.Por lo que la para la siembra en el medio selectivoPARPBH se toma porciones de la manzana en lazona conocida como zona de avance del hongo que

est cercano donde estn las semillas.

A las 24 horas de la siembra de las semillas ensolucin de suelo la primea en reaccionar fueronlas semillas extradas de la manzana inoculadacon races de la planta infectada, confirmandocon ello que, esta es la que mayor infestacin delOomycota tena.

El micelio del hongo tiene una coloracin blancay crece rpidamente porque las semillas tienen

muchos nutrientes que el Oomycota necesita.La solucin del suelo su funcin es la desimularle al Oomycota que est en el suelo y porlo tanto ataca a la semilla.

Figura No 12 Siembra en Medio selectivoPARPBH y siembra se semilla en solucion desuelo de las manzanas que dieron positivo la

prueba del cultivo trampa.

Figura No 13 Semilla en solucion de suelo.


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A las 24 despus de la siembra de semillasde manzana en solucin de suelo la quemenos reacciono fueron las semillasprevenientes de la manzana la cual fueinoculada con suelo.

Esto porque como se mencionanteriormente, como posible causa que en elsuelo no haya un alta cantidad del Oomycota.

5.3.1.1. Observaciones al Microscopio.

A las 24 horas despus de la siembra el Oomycota solo haba producido hifas y esto hacia queno se pudiera determinar si era phytopthora o no porque no tena caractersticasespecficas por lo que haba que esperar mas tiempo.

Figura No 14 Semilla en solucion de suelo.

Figura No 15 Montaje del micelio del Oomycota a las 24 horas de la siembra en solucion de suelo


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A las 48 horas despus de la siembra en solucin de suelo serealiz nuevamente un montaje sobre el oomycota, pero lo quese encontr es una contaminacin del micelio de este hongo con

otros hongos. Pero despus de una cuidadosa seleccin de laparte que se necesitaba se encontr con el micelio dePhytophthora

En el montaje que se ve en el lado izquierdo de la figura 17 se muestra el micelio dePhytophthora, pero al lado derecho se hace una aceracin de ello y se observa el oogoniocaracterstico de este oomycota, adems de ello se muestra de una osporo que se esperaraque a lo largo del tiempo mostrase este microorganismo.

Por lo que despus de una largo proceso se lleg a determinar que la planta de magnolia siestaba infestada con Phytophthora.

Figura No 16 Micelio dePhytophthora

Figura No 17 Micelio de Phytophthora a las 48 horas despues de la simbra


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6. CONCLUSIONES

En caso de que la infeccin de las hojas de una planta avance en forma de tizn omancha foliar fungosa y en caso de que las esporas del hongo aparezcan sobre susuperficie, algunas de esas esporas deben depositarse sobre una caja de Petri quecontenga medio de cultivo (raspado).

Tcnica de siembra directa de suelo, este mtodo se lleva a cabo introduciendofragmentos del suelo fresco en la superficie de placas con diferentes medios de cultivo,

para posteriormente observar el crecimiento micelial de los hongos presentes en lasmuestras.

El cultivo trampa no es ms que los trozos de tejido se introdujeron en orificios de 5mm de dimetro y 30 mm de profundidad, hechos en frutos maduros de manzana verdeluego se cubrieron con cinta de enmascarar y se dejaron a temperatura ambiente.

El tiempo que tard en reaccionar la manzana a la cual se le inoculo races de plantainfectada con Phytophthora fue de 3 dias.

En el cultivo trampa el organismo que se lleg a determinar es Phytophthora sp.


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7. BIBLIOGRAFA1. AGRIOS, G. 1998. Fitopatologa.5.Edicin.EditorialMcGraw-Hill.Mxico.928p.2. Loredo Vega J. Universidad Autnoma De Sinaloa Unidad Regional Norte Escuela

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5. Universidad de la Repblica, Facultad de Agronoma, Departamento de ProteccinVegetal, Monte Video Uruguay. Practica de hongos. Consultado el 18 de Septiembre2011. Disponible en:http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/hongos.html yhttp://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/clave_bacterias.html

6. Fitopatologa General, Universidad Agraria de Molina, Departamento de fitopatologa.Lima, Per. Consultado el 18 de Septiembre 2011. Disponibleen:http://tarwi.lamolina.edu.pe/~fonz/fitogen/PDF/APUNTES%20DE%20CLASES1.pdf
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8. ANEXOS8.1. Qu otras tcnicas de aislamiento se conocen para microorganismos que

afectan plantas,

8.1.1. Aislamiento de hojasEn caso de que la infeccin de las hojas de una planta avance en forma de tizn o mancha foliarfungosa y en caso de que las esporas del hongo aparezcan sobre su superficie, algunas de esasesporas deben depositarse sobre una caja de Petri que contenga medio de cultivo.

8.1.1.1. Induccin al desarrollo micelarSe recomienda que el hongo crezca y esporule sobre medios de cultivo, recomendable parahongos que crecen en el interior del hospedante y/o que esporulen poco en el tejido, talescomo hongos de la raz. Este mtodo es el ms usado cuando se requiere tener a un hongo en

cultivo puro.

8.1.1. Aislamiento de tallos, frutos y otros rganos areos de la plantaLa mayora de los mtodos que se han descrito para aislar bacterias y hongos patgenos de lashojas, pueden tambin utilizarse para aislar esos mismos patgenos de las infeccionessuperficiales de los tejidos mencionados.

8.1.1. Cultivo lquidoEn esta tcnica se toman 10 g (equivalente peso seco) de suelo fresco y se adiciona aerlenmeyers de 1000 mL con una solucin de agua destilada estril, peptona al 0,1%, Tween80 al 0,5% y Cloramfencol (400ppm) 0,005mg/mL. Se coloca la mezcla en shaker giratoriodurante 48 horas para luego dejarlo en incubacin esttica hasta observar el desarrollo demicelios en el lquido (aproximadamente 1 semana).

8.1.1. Placas de suelo de WarcupFue desarrollado por Warcup en 1950, las placas se preparan dispersando pequeascantidades (0.2-5 mg) de suelo pulverizado en una caja de petri estril, se adiciona agar a lasplacas y se agita lentamente para dispersar las partculas.

8.1.1. Fraccionamiento de la comunidad de hongos del sueloEsta tcnica involucra la preseparacin de propgulos del suelo utilizando centrifugacin porgradiente de densidad antes de la aplicacin en los medios de aislamiento. Se aslanespecficamente, las esporas de diferentes tamaos.


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8.1.1. Filtracin de partculasSe denomina tambin "lavado de suelo" y permite el aislamiento de hongos de fragmentos demicelio sumergidos en el sustrato, reduciendo la recuperacin de colonias de hongosoriginarios de esporas; de igual forma el aislamiento de especies con clamidosporas tambin

es favorecido ya que sus propgulos no son removidos del todo por el lavado.

8.2. Investigue que tipo de medios selectivos son utilizados para desarrollaralgunos microorganismos (Hongos y bacterias),


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8.3. Cmo puede saber que medio utilizar cuando desea aislar un organismopatgeno a plantas (hongos o bacteria)?

Inicialmente con los sntomas y signos que presente el microorganismo o alguno de los cortesrealizados nos dan indicios si es un hongo o una bacteria partiendo de eso despus se puede

seleccionar varios medios para su utilizacin se puede empezar con medios bsicos, ydependiendo la reaccin del microorganismo podemos llegar hasta un medo diferencial paraestar seguros de que el organismo aislado es el requerido

Para estudiar los microorganismos (p. ej.: hongos, bacterias) se necesita como requisito previocultivarlos en condiciones de laboratorio, para lograr esto, es preciso conocer cules son losnutrientes y las condiciones fsicas que requieren. Por medio de estudios se ha logradodeterminar las necesidades nutricionales de hongos y bacterias en forma general. Aunquealgunas especies de estos microorganismos necesitan condiciones ms especficas para poderdesarrollarse.

La preparacin de medios de cultivo es importante para desarrollar microorganismos fuera desu ambiente natural y demostrar sus propiedades en el diagnstico. En fitopatologa se utilizanmuchos medios. Estos medios varan ampliamente, de acuerdo a las necesidades particularesde los microorganismos bajo estudio.

8.3.1. Medios BsicosEstos son los medios ms simples, que slo contienen lo necesario para proporcionar a losmicroorganismos los aminocidos, vitaminas, sales, y pequeas cantidades de carbono,

nitrgeno, hidrgeno y otros elementos. Existen medios de cultivos lquidos y medios decultivo slidos. Los medios de cultivo que no contienen agar o cualquier otro agentesolidificante son medios lquidos. Para el estudio de las caractersticas de las colonias esindispensable el uso de medios slidos. La solidificacin se consigue agregando agar, gelatina,albmina de suero o de huevo.

8.3.2. Medios EnriquecidosLa adicin de componentes como sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas allos medios bsicos, les proporcionan sustancias nutritivas complementarias para que el mediopueda soportar el crecimiento de los organismos exigentes

8.3.3. Medios SelectivosSon usualmente medios de agar bsico o enriquecidos, a los cuales se les han agregado ciertosreactivos que impiden el crecimiento de la mayora de las bacterias, permitiendo por lo tanto,el crecimiento de unas cuantas seleccionadas, en los especmenes que contengan grandesnmero de microorganismos indeseables.


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8.3.4. Medios DiferencialesSon medios bsicos o enriquecidos, a los cuales se les han agregado ciertos reactivos quereaccionarn con algunos tipos especficos de bacterias en cierta forma observables. Porejemplo: cuando se agrega lactosa y rojo neutro al agar nutritivo (medio bsico de cultivo), las

bacterias fermentadoras de lactosa de diferenciarn de las no fermentadoras de lactosa por laformacin de productos finales cidos, demostrables por un cambio de color (rojo en un pHcido) del rojo neutro. Como es natural, al aadir algunas substancias inhibidoras a los mediosdiferenciales, puede hacrseles selectivos as como diferenciales. La mayora de los llamadosmedios diferenciales son de este ltimo tipo.

La bacteria del gnero Xanthomonas y Erwinia presenta una coloracin amarillenta en elmedio diferencial llamado YDC (levadura, dextrosa, calcio).

8.3.5. Medios para hongosA excepcin de algunas especies de hongos, la mayora de los mismos se desarrollan biensobre un medio que contenga Papa, Dextrosa y Agar (PDA).

8.3.6. Medio para bacteriasEl medio para bacterias a utilizar es el conocido como Agar Nutritivo (AN). Se utiliza para elaislamiento de la mayora de las bacterias, como medio en la identificacin.

8.3.7. Agar V 8Este medio es muy til para promover la esporulacin de ciertos hongos y para el desarrollode otros muy exigentes en nutrientes.

El jugo V 8 es un producto que contiene extractos de tomate, zanahoria, apio de vitaminas yminerales.

8.3.8. Medio YDC (Levadura, Dextrosa, Calcio)Se utiliza para la identificacin de las bacterias del gnero Xanthomonas y Erwinia, las cualesdan una coloracin amarillenta en este medio.