Dispersión de Luz a Bajos Ángulos en Redes de Microtúbulos Ma. Guadalupe González-Asevedo 1 , Abraham de la Cruz-Martínez 1 , Luis F. Rojas 2 and Miguel Ángel Ojeda-López 1 1 Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, México, 2 Departamento de Física, CINVESTAV Resumen Se estudió la cinética de la formación de agregados paralelos de microfilamentos biológicos cargados, llamados microtúbulos (MTs), utilizando dispersión de luz a bajos ángulos y microscopía óptica de contraste por interferencia diferencial. En vitro, en presencia de cationes multivalentes, los MTs se agregan paralelamente formando redes de manojos, como función de la concentración del catión. Los resultados de dispersión sugieren una semejanza entre la estructura de los agregados de MTs y la de los polímeros sintéticos más pequeños. Figura 1. a) Estructura tridimensional de los MTs, b) estructura de tubulina a) b) Figure 4. a) Trancisión monitoreada con SALS de MTs dispersos y manojos de MTs. b) Intensidad contra concentración. Figura 2. a) esquema experimental b) foto de la dispersión de manojos de MTs en la CCD AGRADECIMIENTOS Agradecemos al Dr. J.L. Arauz-Lara por amablemente mostrar facilidades para realizar estos experimentos. También agradecemos CONACyT-Mexico su financiamiento a través de la beca de maestría. Este proyecto fue apoyado por CONACyT en el proyecto “Microestructura y Materiales Suaves” Ref. U47611-F, y de PIFI-2007. INTRODUCCIÓN Los Microtúbulos (MTs) son biofilamentos macromoleculares semirígidos, poseen la morfología de un cilindro hueco, con un diámetro de tan solo 25nm y longitudes que van desde unas cuantas micras a decenas de micras. Se forma a partir de la unión de miles de dímeros de una proteína conocida como tubulina (del orden de 1500 dímeros/micra), a través de un complejo proceso bioquímico denominado polimerización (Figura 1). La proteína tubulina es sintetizada por la mayoría de las células eucariotas y es particularmente abundante en las células del sistema nervioso, de donde se extrae para experimentos in vitro. En condiciones fisiológicas (en medio acuoso, pH~7 y T~37) la tubulina adquiere carga eléctrica negativa, así los MTs pueden ser considerados como macroiones negativos; partiendo de la estructura de aminoácidos de la tubulina, la carga superficial en un MT se estima del orden de -50e/nm 2 . Los MTs, son componentes esenciales del citoesqueleto celular, una red intrincada de microfilamentos que da soporte mecánico a las células entre otras funciones. Además los MTs participan en la división celular y en procesos de transporte de neuronas. En casi rodas estas funciones los MTs conforman arreglos supramoleculares asociándose con MAPs (Microtubule Associated Proteins) y con otros microfilamentos. Se conocen varios tipos de MAPs las cuales se adhieren a los MTs mediante interacciones electrostáticas atractivas entre el dominio (una secuencia en la proteína) y la pared proteica del MT. Experimentalmente los MTs son condensados añadiendo cationes multivalentes como espermidina +3 , espermina +4 . Nuestro propósito en este trabajo ha sido la transición de MTs sueltos a su estado de agregación usando dispersión estática de luz a bajos ángulos. En trabajos de dispersión de rayos-X a bajo ángulo se observo esta transición y se demostró que los MTs se empaquetan de manera hexagonal (Ref 1). Sin embargo, como la dispersión de luz envuelve longitudes de onda más grandes, se puede obtener información estructural a escalas de longitud más grandes, lo cual es importante para entender las redes de MTs y sus los agregados. MATERIALES Los MTs fueron polimerizados de la proteina tubulina (www.cytoskeleton.com) y estabilizados con 20M de taxol, al final de este proceso cierto porcentaje de tubulina permanece sin polimerizar. La proteina sin polimerizar es separada de la soluición de MTs centrifugando. A lo largo de los experimetos, la concentración de MTs fue fijada a 0.5mg/ml. cation-MT. Para inducir la agregación de MTs a manojo, un catión trivalenete (espermidina) fue añadido en pasos a partir de una solución altamente concentrada. Para el microscopio óptico, una pequeña cantidad de la muestra fue tomada y sellada dentro de un celda hecha con un porta objetos y un cubreobjeto, y analizada por microscopía óptica DIC, usando un objetivo de 60X-2X de inmersión en aceite acoplado a una video-cámara enaltecida de alta resolución (DAGE). Para SALS, la solución fue puesta dentro de una celda de cuarzo circular de 1cm de alto y de diametro y dispersada inmediatamente. RESULTADOS En la figura 3 imágenes representativas del microscopio óptico DIC de MTs sueltos (3a) y manojos de catión-MT (3b) son mostrados para ilustración. La transición de MTs sueltos a manojos toma lugar a una concentración critica de catión (espermidina 3+) en la solución. El punto critico a lo largo de la transición puede ser observada en experimentos de SALS. Por ejemplo, la figura 4a muestra la intensidad integrada I(q) para varias concentraciones (0-30 mM). La doble flecha vertical denota donde el punto critico aparece, al rededor de la concentración de 12-14mM de espermidina. Encontramos estos valores muy consistentes con las imágenes de las muestras tomadas con microscopía. En los datos de SALS se nota el salto en la intensidad, particularmente a pequeños valores de q, y un ligero cambio en la pendiente. Para un rodillo rígido o un cilindro el desarrollo teórico de I(q) en la aproximación de Rayleigh-Gans predice una pendiente de 1/q mientras que para un polímero parecido a un gusano la aproximación de Debye da una caída de 1/q 2 (Ref. 2). En nuestro caso vemos que los MTs siguen la última dependencia 1/q 2 cercana a la forma 1/q aun en el caso de MTs desagregados. Así, nuestros datos de SALS sugieren un paralelismo con la estructura de un polímero a escalas molecular de biopolímeros macroscópicos tal como MTs. En la figura 4b se puede apreciar el cambio de intensidad para distintos qs cuando los MTs están dispersos con respecto a los MTs agregados (entre C z = 12mM y 14mM). DESARR0LOLLO EXPERIMENTAL En un experimento de dispersión de luz un rayo de luz o radiación incidente golpea una muestra y es dispersado por su estructura microscópica. En experimentos de dispersión de estática de luz la intensidad de la luz dispersada es medida como una función del vector de dispersión, q, el cual esta relacionado con el ángulo de dispersión, θ, por la ecuación, Donde n es el índice de refracción del medio y λ i la longitud de onda de la luz incidente. El vector q esta relacionado a escalas de longitud por d ~ 1/q. En nuestro experimento λ i = 0.6328μm, así de la ec. (1) exploramos escalas de longitud del orden de 1-50 μm, valores de θ<15º son medidos. Para tal propósito un dispositivo fue montado en el la boratorio del Dr. Arauz-Lara (IF-UASLP) (fig. 3). Brevemente, consiste de una luz láser, un objectivo para colectar la luz, un “pinhole”, una lente para hacer los rayos de kuz paralelo, un diafragma para controlar el tamaño del rayo, un espejo para desviar el rayo 90º, el soporte de la muestra, la lente L 1 para colectar la luz dispersada, un “beam stop” es colocado en el foco de la lente L 1 para bloquear el rayo principal al detector, con la finalidad de obtener información a pequeños qs, la lente L 2 enfoca el rayo dispersado dentro de la cámara CCD de la cual la imagen de la luz dispersada es capturada en la computadora (Fig. 2a). Los “Pinholes” y las partículas de latex de tamaño conocido fueron usadas para calibrar el instrumento (datos no mostrados). Debido al limite de rango dinámico de la cámara CCD, los datos para los MTs fueron colectados en tres exposiciones, incrementando el tiempo de exposición, y las regiones no saturadas fueron reescalada y ensambladas dentro de una grafica de intensidad contra q. Por ejemplola Fig. 2b muestra la dispersión de una muestra donde la región central (q pequeño) esta saturada, esto fue hecho con el fin de conseguir suficiente señal en otras regiones (q más grande). Figura 3. a) Foto de los MTs individuales, b) manojos de MTs, usando microscopía óptica (DIC). (1) . 2 sin n 4π θ λ = q i 0.1 1 0.1 1 10 100 ~ 1 /q 6 m M 8 m M 10 m M 12 m M 14 m M 16 m M 30 m M 1/q I(q ) [u .a .] q[ m -1 ] ~ 1 /q 2 Las siguientes graficas muestran el comportamiento desglosado de los MTS y los manojos a concentraciones distintas y se puede apreciar que las tres se ajustan al régimen de Guinier y como se aproximan a 1/q 2 como ya se menciono arriba. a) b ) a) b) a) a ) b) b) 5 10 15 20 25 30 1 10 100 q = 0.11344 (56 m) q = 0 .7 4 9 3 7 (8 .4 m) q = 1 .4 3 6 8 6 (4 .4 m) I(q ) [u .a ] C z [mM] 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 -2 -1 0 1 2 3 4 f(x) = l(q ) [0 m M] f(x) = e xp (3 .3 8 -3 0 .1 1 x) f(x) = 0 .6 /x ln (f(x)) x = q 2 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 -2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 f(x) = l(q ) [1 4 m M] f(x) = e xp (3 .7 4 - 1 0 .8 9 x) f(x) = 2 .8 /x ln (f(x)) x = q 2 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 f(x) = I(q ) [3 0 m M] f(x) = e xp (4 .9 1 -1 4 .6 5 x) f(x) = 5 .5 /x ln ( f(x)) x = q 2 REFERENCIAS 1.- Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Vol. 101, P. 16099 (2004). 2.- Neutrons, X-Rays and Light Scattering Methods Applied to Soft Condensed Matter, North Holland Delta Series, Elsevier Science 2002, Edited by P. Linder and Th. Zemb.
Dispersin de Luz a Bajos ngulos en Redes de MicrotbulosMa.
Guadalupe Gonzlez-Asevedo1, Abraham de la Cruz-Martnez1, Luis F.
Rojas2 and Miguel ngel Ojeda-Lpez11Instituto de Fsica, Universidad
Autnoma de San Luis Potos, Mxico, 2Departamento de Fsica, CINVESTAV
Resumen Se estudi la cintica de la formacin de agregados paralelos
de microfilamentos biolgicos cargados, llamados microtbulos (MTs),
utilizando dispersin de luz a bajos ngulos y microscopa ptica de
contraste por interferencia diferencial. En vitro, en presencia de
cationes multivalentes, los MTs se agregan paralelamente formando
redes de manojos, como funcin de la concentracin del catin. Los
resultados de dispersin sugieren una semejanza entre la estructura
de los agregados de MTs y la de los polmeros sintticos ms
pequeos.Figura 1. a) Estructura tridimensional de los MTs, b)
estructura de tubulina a) b) Figure 4. a) Trancisin monitoreada con
SALS de MTs dispersos y manojos de MTs. b) Intensidad contra
concentracin. Figura 2. a) esquema experimental b) foto de la
dispersin de manojos de MTs en la CCD AGRADECIMIENTOSAgradecemos al
Dr. J.L. Arauz-Lara por amablemente mostrar facilidades para
realizar estos experimentos. Tambin agradecemos CONACyT-Mexico su
financiamiento a travs de la beca de maestra. Este proyecto fue
apoyado por CONACyT en el proyecto Microestructura y Materiales
Suaves Ref. U47611-F, y de PIFI-2007. INTRODUCCIN
Los Microtbulos (MTs) son biofilamentos macromoleculares
semirgidos, poseen la morfologa de un cilindro hueco, con un
dimetro de tan solo 25nm y longitudes que van desde unas cuantas
micras a decenas de micras. Se forma a partir de la unin de miles
de dmeros de una protena conocida como tubulina (del orden de 1500
dmeros/micra), a travs de un complejo proceso bioqumico denominado
polimerizacin (Figura 1). La protena tubulina es sintetizada por la
mayora de las clulas eucariotas y es particularmente abundante en
las clulas del sistema nervioso, de donde se extrae para
experimentos in vitro. En condiciones fisiolgicas (en medio acuoso,
pH~7 y T~37) la tubulina adquiere carga elctrica negativa, as los
MTs pueden ser considerados como macroiones negativos; partiendo de
la estructura de aminocidos de la tubulina, la carga superficial en
un MT se estima del orden de -50e/nm2 . Los MTs, son componentes
esenciales del citoesqueleto celular, una red intrincada de
microfilamentos que da soporte mecnico a las clulas entre otras
funciones. Adems los MTs participan en la divisin celular y en
procesos de transporte de neuronas. En casi rodas estas funciones
los MTs conforman arreglos supramoleculares asocindose con MAPs
(Microtubule Associated Proteins) y con otros microfilamentos. Se
conocen varios tipos de MAPs las cuales se adhieren a los MTs
mediante interacciones electrostticas atractivas entre el dominio
(una secuencia en la protena) y la pared proteica del MT.
Experimentalmente los MTs son condensados aadiendo cationes
multivalentes como espermidina +3, espermina +4. Nuestro propsito
en este trabajo ha sido la transicin de MTs sueltos a su estado de
agregacin usando dispersin esttica de luz a bajos ngulos. En
trabajos de dispersin de rayos-X a bajo ngulo se observo esta
transicin y se demostr que los MTs se empaquetan de manera
hexagonal (Ref 1). Sin embargo, como la dispersin de luz envuelve
longitudes de onda ms grandes, se puede obtener informacin
estructural a escalas de longitud ms grandes, lo cual es importante
para entender las redes de MTs y sus los agregados.MATERIALES
Los MTs fueron polimerizados de la proteina tubulina
(www.cytoskeleton.com) y estabilizados con 20M de taxol, al final
de este proceso cierto porcentaje de tubulina permanece sin
polimerizar. La proteina sin polimerizar es separada de la soluicin
de MTs centrifugando. A lo largo de los experimetos, la
concentracin de MTs fue fijada a 0.5mg/ml. cation-MT. Para inducir
la agregacin de MTs a manojo, un catin trivalenete (espermidina)
fue aadido en pasos a partir de una solucin altamente concentrada.
Para el microscopio ptico, una pequea cantidad de la muestra fue
tomada y sellada dentro de un celda hecha con un porta objetos y un
cubreobjeto, y analizada por microscopa ptica DIC, usando un
objetivo de 60X-2X de inmersin en aceite acoplado a una video-cmara
enaltecida de alta resolucin (DAGE). Para SALS, la solucin fue
puesta dentro de una celda de cuarzo circular de 1cm de alto y de
diametro y dispersada inmediatamente.RESULTADOSEn la figura 3
imgenes representativas del microscopio ptico DIC de MTs sueltos
(3a) y manojos de catin-MT (3b) son mostrados para ilustracin. La
transicin de MTs sueltos a manojos toma lugar a una concentracin
critica de catin (espermidina 3+) en la solucin. El punto critico a
lo largo de la transicin puede ser observada en experimentos de
SALS. Por ejemplo, la figura 4a muestra la intensidad integrada
I(q) para varias concentraciones (0-30 mM). La doble flecha
vertical denota donde el punto critico aparece, al rededor de la
concentracin de 12-14mM de espermidina. Encontramos estos valores
muy consistentes con las imgenes de las muestras tomadas con
microscopa. En los datos de SALS se nota el salto en la intensidad,
particularmente a pequeos valores de q, y un ligero cambio en la
pendiente. Para un rodillo rgido o un cilindro el desarrollo terico
de I(q) en la aproximacin de Rayleigh-Gans predice una pendiente de
1/q mientras que para un polmero parecido a un gusano la
aproximacin de Debye da una cada de 1/q2 (Ref. 2). En nuestro caso
vemos que los MTs siguen la ltima dependencia 1/q2 cercana a la
forma 1/q aun en el caso de MTs desagregados. As, nuestros datos de
SALS sugieren un paralelismo con la estructura de un polmero a
escalas molecular de biopolmeros macroscpicos tal como MTs. En la
figura 4b se puede apreciar el cambio de intensidad para distintos
qs cuando los MTs estn dispersos con respecto a los MTs agregados
(entre Cz = 12mM y 14mM).DESARR0LOLLO EXPERIMENTAL
En un experimento de dispersin de luz un rayo de luz o radiacin
incidente golpea una muestra y es dispersado por su estructura
microscpica. En experimentos de dispersin de esttica de luz la
intensidad de la luz dispersada es medida como una funcin del
vector de dispersin, q, el cual esta relacionado con el ngulo de
dispersin, , por la ecuacin,Donde n es el ndice de refraccin del
medio y i la longitud de onda de la luz incidente. El vector q esta
relacionado a escalas de longitud por d ~ 1/q. En nuestro
experimento i = 0.6328m, as de la ec. (1) exploramos escalas de
longitud del orden de 1-50 m, valores de
