TCNICAS DE CLONACIN IN VITRO PARA CONFERAS

Y LATIFOLIADAS

Grupo de plantas genticamente idnticas,

obtenidas todas ellas por propagacin vegetativa

de un individuo seleccionado.

El concepto de CLON

Grupo de clulas o de organismos genticamente

idnticos, originados a partir de una nica clula u

organismo por reproduccin asexual, por divisin

artificial de estados embrionarios iniciales o por

transplante nuclear.

Clonacin molecular: insercin de un segmento de ADN ajeno,

de una determinada longitud, dentro de un vector que se replica

en un husped especfico.

Clonacin celular: proceso de multiplicacin de clulas

genticamente idnticas, a partir de una sola de ellas.

Clonacin de genes: tcnica que consiste en multiplicar un

fragmento de ADN recombinante en una clula-husped

(generalmente una bacteria o una levadura) y aislar luego las

copias de ADN as obtenidas.

El concepto de CLONACION

Clonacin individual: proceso de multiplicacin o

masificacin de un genotipo completo mediante tcnicas

que utilicen todo o parte de una planta (clulas, tejidos,

rganos).

Cloning

BEARS - PANDAS

CATS COWS DEER EXTINCT SPECIES GOATS HORSES HUMANS INSECTS MICE - RATS MULES PIGS SHEEP TREES

WHAT IS CLONING?

POR QU CLONAR, SI LOS ARBOLES SE REPRODUCEN FCILMENTE POR SEMILLAS?

Y ADEMS, LOS GENETISTAS Y BIOTECNLOGOS COBRAN CARO !

PORQUE HAY RIESGOS...

CONCLUSION?

Embriognesis

somtica

Cultivo in vitro

Macropropagacin Micropropagacin

Cuttings

Acodos

Injertos

Hijuelos, etc.

PROPAGACIN DE LEOSAS

Sexual Asexual

Semilla

Artificial

- Cruzamiento libre

- Cruzamiento controlado

Semilla

Mejorada

PLANTAS ARBOLES DE MAXIMA PRODUCTIVIDAD

ENTONCES? :

CLONACIN DE INDIVIDUOS SELECTOS

Cuttings

Acodos

Injertos

Hijuelos, etc.

TCNICAS MACRO TISULARES:

TCNICAS MICRO TISULARES:

Micropropagacin de porciones de tallos, hojas, races, etc.

Cultivo de meristemos.

Cultivo de polen (andrognesis)

Cultivo de protoplastos

Cultivos celulares en suspensin

Bioreactores

Hibridacin, Fusin de protoplastos

Cultivo de tejidos vegetales Cultivo in vitro:

Micropropagacin de porciones de tallos, hojas, races, etc.

Cultivo de meristemos.

Cultivo de polen (andrognesis)

Cultivo de protoplastos

Cultivos celulares en suspensin

Bioreactores

Hibridacin, Fusin de protoplastos

Cultivo de meristemos

Microinjertos

Propagacin clonal y

saneamiento del material

vegetal (i.e.: eliminacin de

virus).

Cultivo de pices caulinares

Cultivo de yemas axilares

Morfognesis directa

Semilla artificial

Reproduccin vegetativa.

Cultivo de anteras y esporas

Cultivo de vulos

Cultivo de embriones haploides

Obtencin de lneas puras

(mtodo haplo-diploide).

EJEMPLOS?

Transformacin gentica

- T.G. va Agrobacterium

- T.G. Biolistic, electroporacin,

transformacin de protoplastos,

microinjeccin, etc.).

Transferencia de genes

(Variacin intraespecfica e

interespecfica)

Fusin de protoplastos:

- Hibridacin somtica

- Hibridacin gametosomtica

Cultivo de embriones zigticos

Aprovechamiento de la variacin

interespecfica.

Seleccin celular

Seleccin somaclonal

Aprovechamiento de la variacin

somaclonal (variacin

intraespecfica)

BIOTECNOLOGA FORESTAL v/s MEJORA

GEN LOCI GENOMA SER VIVO

MEJORADOR DE

PLANTAS

Muchos rboles,

familias, sitios,

tiempo, objetivos

de produccin.

Seleccin:

mejor grupo de

rboles

BIOTECNOLOGO

Selecciona

para un rasgo

dado, el gen

ms

adecuado

+

Aade genes

en distintos

loci para

objetivos

determinados

Seleccin:

mejor

genotipo

ALTERNATIVAS PARA EL BIOTECNOLOGO?

ESCASAS !

HIBRIDACION VIA CRUZAS

O BIEN

PROPAGACIN

VEGETATIVA O

ASEXUAL

GRADO DE

DETERMINACIN

CELULAR

ESTADO

FISIOLGICO DEL

MATERIAL BASE

TOTIPOTENCIA CELULAR

CAPACIDAD MORFOGNICA

EXPRESIN DE LA TOTIPOTENCIA

ORGANOGNESIS EMBRIOGNESIS SOMTICA

DIRECTA DIRECTA INDIRECTA INDIRECTA

Propagacin vegetativa va cultivo in vitro

Organognesis

Embriognesis

Somtica

Conduce a la diferenciacin de meristemos caulinares y/o radiculares que originan tallos o races adventicias, respectivamente.

Formacin de

Conduce a la formacin de embriones somticos siguiendo las fases del embrin cigtico (globular, corazn, torpedo, cotiledonar) aunque sin fecundacin.

Establecimiento

Proliferacin

Elongacin

Enraizamiento

Aclimatacin

ETAPAS ORGANOGNESIS

CAULOGNESIS

RIZOGNESIS

VENTAJAS

ORGANOGNESIS

PLANTAS LIBRES

DE PATGENOS PRODUCCIN RPIDA.

PLANTAS HOMOGNEAS, VIGOR

PRODUCCIN

TODO EL AO ALTAS TASAS DE PROLIFERACIN

RPIDAS GANANCIAS PRODUCTIVAS

PRODUCCIN DE MADERA MS HOMOGNEA

ARCHIVO GENTICO

Organognesis a partir de embriones (P. radiata)

Organognesis a partir de embriones (P. radiata)

Hasbn, R. 2004

Organognesis a partir de embriones (C. sativa)

Organognesis de tejido adulto (E. nitens)

Organognesis de tejido adulto (Q. saponaria)

Organognesis de tejido adulto (Q. saponaria)

Establecer metodologas de cultivo in vitro de material adulto evaluando tipo de tejido a introducir

(yemas y hojas) y respuesta de induccin morfognica

(organognesis y/o embriognesis somtica).

EXPERIENCIA DE CLONACION DE RAUI ADULTO

SECUENCIA OPERACIONAL. Base Copa

100 um

Formacin de zonas

meristemticas y

origen multicelular de

los brotes

adventicios.

Material adulto de N. alpina

- Existe conexin con el tejido

materno (callo).

- En un punto indiferenciado

comienza el ordenamiento del

tejido vascular con la evidente

presencia de elementos

conductores en los nuevos

brotes.

EMBRIOGNESIS SOMTICA

Multiproceso a travs del cual clulas vegetales somticas indiferenciadas originan embriones normales sin conexin vascular al tejido de origen.

MEDIO CULTIVO

AMBIENTE

TIPO EXPLANTO

FACTORES QUE AFECTAN LA INDUCCIN Y GENERACIN DE EMBRIONES SOMTICOS

EMBRIOGNESIS SOMTICA

VENTAJAS

Sistema de propagacin masiva.

Clonacin genotipos selectos.

Generacin de ambos polos de desarrollo (raz y tallo).

Automatizacin del proceso mediante cultivo lquido.

Criopreservacin de los e.Ss.

Semilla artificial (facilidad de manejo).

Regeneracin de plantas transformadas genticamente.

EMBRIOGNESIS SOMTICA

LIMITACIONES

Difcil induccin desde tejido adulto.

Efecto del genotipo.

Afinamiento protocolos de cultivo.

Germinacin asincrnica.

Embriones somticos con anormalidades.

Variaciones somaclonales.

INDUCCIN EMBRIOGNICA

REQUERIMIENTOS

CLULAS COMPETENTES

AMBIENTE ADECUADO

ESTMULO (ESTRS)

ES INDIRECTA REDETERMINACIN DE CLULAS DIFERENCIADAS

ES DIRECTA CLULAS PROEMBRIOGNICAS

ORIGEN UNI O MULTI CELULAR?

EXPRESIN EMBRIONARIA

* ORGANIZACIN ESPACIAL

* GENERACIN DE DIVERSIDAD CELULAR

AUTONOMA (RESPECTO AL TEJIDO MADRE)

BIPOLARIDAD

APARICIN DE BANDAS PROCAMBIALES

MADURACIN EMBRIONARIA

* EXPANSIN CELULAR

* ACUMULACIN SUSTANCIAS DE RESERVA

PROCESO ANLOGO A EMBRIOGNESIS CIGTICA

REPRESIN DE LA GERMINACIN

TOLERANCIA A LA DESHIDRATACIN

EN OCASIONES SON NECESARIOS TRATAMIENTOS

POSTMADURACIN

ESTRS

OSMTICO

pH FOTOPERODO

ETILENO

ABA

MADURACIN

E. S.

GERMINACIN Y CONVERSIN

DESARROLLO DE LA RAZ Y BROTE CAULINAR

GENERALMENTE OCURRE SIN REGULADORES DE CRECIMIENTO

SE DEBE TENER PRESENTE SEMEJANZA AL PROCESO NATURAL

EL CRECIMIENTO DE PLNTULAS DERIVADAS DE E.S. SE ENCUENTRA

BAJO LA INFLUENCIA ACUMULATIVA DE UNA SERIE DE TRATAMIENTOS

PREVIOS

REQUISITOS PARA

CONVERSIN A

PLANTA...

MORFOLOGA NORMAL ?

SUFICIENTE ACUMULACIN DE

SUSTANCIAS DE RESERVA

TOLERANCIA A LA

DESHIDRATACIN

MEDIO CULTIVO

AMBIENTE

TIPO EXPLANTO

FACTORES QUE AFECTAN LA INDUCCIN Y GENERACIN DE EMBRIONES SOMTICOS

Volumen del recipiente, medio lquido/slido, pH, ventilacin recipientes, etc.

Temperaturas, HR, fotoperiodo, etc.

EMBRIOGNESIS SOMTICA

Directa

Indirecta

Recurrente

ESTUDIO DE CASO:

EMBRIOGENESIS SOMTICA RECURRENTE

EN RAUL

(Nothofagus alpina)

MARCO DE REFERENCIA DE LA INVESTIGACION

EMBRIOGNESIS

SOMTICA

RECURRENTE

CARACTERIZACIN

MOLECULAR LNEAS

CALLOGNICAS

CARACTERIZACIN

PROCESO

EMBRIOGNICO

CARACTERIZACIN

MOLECULAR LNEAS

EMBRIOGNICAS

PROTOCOLO

EMBRIOGNESIS

SOMTICA

Categora 1 Categora 2 Categora 3

Tercera Semana

En Presencia de Hormonas

En Ausencia de Hormonas

Encapsulado de embriones somticos

Resultados

Germinacin y conversin a planta de un embrin

cigtico encapsulado en alginato de sodio al 3%.