PRACTICA 1

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA: PRINCIPIOS GENERALES

A. UNIDADES Y CANTIDADES UTILIZADAS EN BIOQUÍMICAB. MANEJO DEL MATERIAL DE LABORATORIO C. TOMA DE MUESTRA DE SANGRE

PRELABORATORIO: CONSULTE ACERCA DEL TIPO, FUNCION Y NUMERO DE CELULAS QUE CONSTITUYE EL FLUIDO SANGUINEO.

OBJETIVOS

El estudiante una vez haya revisado el tema sobre los principios básicos en que se fundamenta la Toma de Muestra de Sangre, y habiendo realizado la práctica correspondiente, estará en capacidad de:

1. Recordar el manejo de las unidades utilizadas para la cuantificación de los diferentes parámetros medidos en el laboratorio.

2. Obtener para análisis, en forma adecuada, una muestra de sangre venosa.

3. Establecer las diferencias y las relaciones entre el suero, plasma y la sangre desfibrinada.

4. Conocer el material analítico para darle uso apropiado, lo cual se traducirá en resultados confiables.

A. UNIDADES Y CANTIDADES UTILIZADAS EN BIOQUÍMICA

Las unidades utilizadas en los laboratorios científicos son universales y fueron aprobadas por la Conferencia General de Pesos y Medidas en 1960.

UNIDADES BÁSICAS S.I. (Sistema Internacional) MAS FRECUENTEMENTE UTILIZADAS EN BIOQUÍMICA

CANTIDAD FÍSICA NOMBRE S.I.

Masa Kilogramo KgCantidad de sustancia moles mol sustancia/volumen MOLARIDAD

moles/Litro M

Tiempo Segundo s

Para mayor comodidad en el manejo, se colocan prefijos antes del símbolo de la unidad:

MÚLTIPLOS FRACCIONES

FACTOR PREFIJO SÍMBOLO FACTOR PREFIJO SÍMBOLO

106 Mega M 10-3 Mili m103 Kilo K 10-6 Micro

10-9 Nano n10-12 Pico p

OTRAS UNIDADES UTILIZADAS DIFERENTES AL S.I.

Litro (l): Es más frecuentemente usada que el mm3, aunque esta corresponde al S.I.

1000 litros = 1 m3 = 1 mm3

1 litro = 1 dm3 = 10-3 m3

1 mililitro (ml) = 1 cm3 = 10-6 m3

1 microlitro (l) = 1 mm3 = 10-12 m3

Mol (mol): Unidad básica de cantidad es el mol en el S.I., que expresa la cantidad de sustancia contenida, independiente del volumen.

El término mol se aplica a moléculas, átomos, iones y radicales libres.

Solución molar: 1 mol/l = peso molecular en gramos por litro de solución.

Concentración en términos de masa: En ocasiones se hacen mediciones de sustancias que no tienen una composición definida, como la concentración de proteína o ácido nucleico presente en un extracto; en estos casos la concentración se expresa en términos de peso en unidad de volumen y no enmoles. Lo mismo sucede cuando el peso molecular del compuesto biológicamente activo que queremos medir no está definido, como el caso de la vitamina B12 o de las inmunoglobulinas, entre otros, se expresaría como, g/l, mg/l, g/100 ml; de la misma forma que se hace para muchos compuestos disueltos en suero por ejemplo glucosa, colesterol, proteínas etc.

El término podría ser ambiguo por lo que debe definirse claramente si la relación se da peso a volumen, volumen a volumen o peso a peso.

Por ejemplo: Una solución de ácido acético al 2% podría significar:2 g de ácido acético/100 ml H2O (peso/volumen)2 g de ácido acético/100 g H2O (peso/peso)2 ml de ácido acético/100 ml H2O (vol/vol)

Conversión de Molaridad a moles por ml. En muchas reacciones bioquímicas se necesita conocer el número de moles de una sustancia presente en una muestra, esto puede hacerse fácilmente con la molaridad de la solución y el volumen de la misma.

Se calcula el número de moles en 1 ml mediante factores de conversión.

Solución 1 molar = 1 mol/l =1 mmol/ml =1 mol/l

Existen situaciones especiales para ciertos parámetros como son:- Electrolitos: Las unidades más utilizadas para expresar la concentración de electrolitos son mEq/l o mmol/l.- Enzimas: Debido a que solo es necesario muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada, solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente. Por lo tanto, la presencia de una enzima se demuestra generalmente siguiendo la aparición de un producto o la desaparición de un sustrato. Por lo anterior, la forma de expresar concentraciones de una enzima se hace en términos de Actividad, que se mide en Unidades (U).Unidad de actividad enzimática (U): es la cantidad de enzima que cataliza la conversión de un micromol de sustrato en la unidad de tiempo bajo condiciones definidas.

- Hormonas: Las concentraciones hormonales son tan pequeñas que con frecuencia son expresadas en ng/ml, pg/ml y en ocasiones en Unidades Internacionales.

B. MANEJO DEL MATERIAL DE LABORATORIO

LIMPIEZA: Si se pretende dar datos exactos en el laboratorio, es necesario que el material de vidrio sea lavado escrupulosamente.

Deben evitarse residuos de detergentes porque pueden causar interferencias en los resultados finales en pruebas que involucren Enzimas o Iones, por lo que se recomienda al final del lavado practicarse enjuagues repetidos con agua desionizada.

El material de vidrio corriente puede secarse con calor en horno, pero el material volumétrico, que ha sido graduado con precisión no debe calentarse porque se descalibra su graduación, en lugar debe enjuagarse con volúmenes pequeños de alcohol, éter y por último secarse por una corriente de aire.

TIPOS DE PIPETAS: Las pipetas se clasifican en A o B según su exactitud.Las pipetas de clase A son las más exactas, mientras que las pipetas de clase B son suficientemente satisfactorias para la mayoría de usos.

La calibración de las pipetas se hace pesando el líquido que pueden contener a temperatura determinada.

a) PIPETAS VOLUMÉTRICAS: Están marcadas con una D (Total Dispenser: TD). Se usan para trasladar el contenido, pueden contener un bulbo. La pipeta se enjuaga con la solución que se esté usando, se llena por encima de la marca, se deja deslizar hasta la marca y se

seca la punta con papel filtro. Se deja drenar el contenido de la pipeta en el recipiente apropiado permitiendo que toque las paredes del mismo. Una pequeña porción de líquido queda siempre en el extremo de la pipeta, este volúmen está calculado desde la fabricación y por lo tanto no debe soplarse en el momento de su uso.

b) PIPETAS GRADUADAS: Son tubos de vidrio con diámetro uniforme marcadas a intervalos regulares.

El líquido se mide dejando caer el menisco de una marca a otra. Debe seleccionarse la pipeta de acuerdo al volumen a medir, por ejemplo, para medir 0.9 ml debe usarse una pipeta de 1 ml en lugar de una de 10 ml. Algunas pipetas de estas requieren ser sopladas para lograrse un volumen exacto lo cual se indica con la presencia de doble anillo marcado pintado o esmerilado en el extremo de succión lo quedebe interpretarse como contenido total (Total Container: TC).

El material de laboratorio que es fabricado en Pyrex o Duran puede ser calentado sin embargo, aunque no se rompe con el calor, se descalibra. Por esta razón no deben calentarse material graduado como: las pipetas, los matraces aforados ni las probetas. Esto puede hacerse con Erlenmeyer y Beaker que no están aforados y la medida de su volumen es aproximada.

Es importante tener en cuenta que a mayor diámetro para la medición de un menisco existe mayor posibilidad de error por lo que la Probeta en este aspecto no se considera un material de precisión. Para leer un menisco es importante situar el ojo del observador perpendicular al menisco que se observa y nunca hacerlo en dirección oblícua ya que en esta posición se obtendrá errores por defecto o por exceso. Esto se conoce como Error de Paralaje.

C. TOMA DE MUESTRA DE SANGRE

INTRODUCCION

La sangre es un tejido que circula dentro del sistema virtualmente cerrado de los vasos sanguíneos. Está compuesta por los elementos figurados (eritrocitos, leucocitos, plaquetas), suspendidos en un medio fluido llamadoplasma, el cual está constituido por una complicada mezcla de materiales simples y compuestos, tanto orgánicos como inorgánicos disueltos en agua.

Al extraerse una muestra de sangre (se prefiere venosa) puede ocurrir tres situaciones:

a) Al agregar anticoagulante como oxalato, Citrato, EDTA o Heparina se impedirá la transformación del fibrinógeno en fibrina y de esta forma la muestra no se coagulará.

Al centrifugar se obtendrá un sobrenadante llamado PLASMA que se caracteriza por la presencia de fibrinógeno.

b) Al no agregar anticoagulante a la muestra, en el lapso de 15 a 30 minutos la muestra coagulará espontáneamente por la transformación del Fibrinógeno (proteína soluble), en fibrina (proteína insoluble) formada por fibras que constituyen verdaderas redes conformando el coagulo y cuando esto sucede, después de centrifugar se obtiene un sobrenadante llamado SUERO cuya característica es la ausencia de fibrinógeno.

c) En condiciones normales, en los animales vivos, la fibrina, en caso de requerirse, es destruida por una enzima fibrinolítica llamada Plasmina. In vitro la fibrina puede destruirse y posteriormente removerse por agitación continua con perlas o varillas de vidrio, o con el uso de aplicadores sin algodón; este proceso se denomina como DESFIBRINIZACION.

Para los exámenes de sangre, puede emplearse sangre venosa, arterial o capilar. Estas muestras deben tomarse en las condiciones requeridas para la prueba. Una muestra que se ha tomado en condiciones de ayuno es decir posterior a ausencia de iingesta en un lapso mínimo de 4 horas, se denomina muestra en CONDICIONES BASALES (pre-prandial). Y la muestra extraída posterior a cualquier tipo de ingesta se denomina POSPRANDIAL (pp).

La jeringa y la aguja deben estar esteriles por lo que se prefiere material desechable.

La aguja más apropiada es la de calibre 20 o 21. El tamaño de la jeringa depende de la cantidad de sangre que se desea obtener, siendo las más comunes de 5 y 10 ml.

PROCEDIMIENTO

Se coloca una ligadura o torniquete (tubo de caucho débil) o una faja de tela alrededor del brazo, a unos 5 o 7 cm por encima del codo, por tiempo no prolongado.En el momento de tomar la muestra, el paciente debe mantener cerrado el puño mientras se introduce la aguja. Este procedimiento tiene por objeto aumentar de volumen la vena.

Elija una vena prominente cerca de la superficie de flexión del antebrazo. La limpieza de la piel debe hacerse con algodón humedecido en alcohol de forma circular de adentro hacia fuera, luego deje secar.

Inmovilice la vena con el pulgar e introduzca la aguja, manteniendo hacia arriba el borde biselado. Afloje el torniquete mientras la aguja se halle aún en la vena, así evita los cambios químicos que produce la estasis de la sangre, extraiga el émbolo a una velocidad moderada hasta la cantidad de muestra requerida. Retire la aguja. Con algodón seco haga presión en el sitio de la punción hasta lograr hemostasis local. Descarte todo el material biológico contaminado (jeringa, algodón etc.) en el sitio adecuado.

B. MANEJO DE LA SANGRE

MATERIALES- Algodón, alcohol- Jeringa de 10 ml

- 2 tubos de centrífuga secos- 1 tubo de centrífuga con oxalato de potasio- 1 tubo de vidrio seco- Pipetas Pasteur- Varillas o perlas de vidrio, aplicadores sin algodón- Tapones de caucho

MÉTODO

Teniendo en cuenta las observaciones anteriores:

Obtenga 10 ml de sangre y divida la muestra como se indica a continuación:1. Coloque inmediatamente 5ml de esta sangre en un tubo de centrífuga que contenga 4

gotas de oxalato de potasio. Tape e invierta el tubo varias veces suavemente, centrifugue por 10 minutos y posteriormente, observe el plasma en la parte superior del tubo. Separe este plasma con ayuda de pipeta Pasteur en un tubo seco aparte.

2. Coloque 2 ml de la sangre tomada inicialmente en un tubo de ensayo seco, deje coagular la sangre a temperatura ambiente por 10 minutos, remueva el coagulo con un aplicador y centrifugue por 10 minutos, para obtener el suero, que se observará en la parte superior del tubo.

3. Coloque la sangre restante (3 ml) en un tubo de ensayo seco y desfibrine mediante agitación con una varilla o perlas de vidrio, o con aplicador. Separe los pequeños coágulos.Conserve ésta sangre desfibrinada para la práctica de Análisis Fotométrico.

PRUEBAS A REALIZAR

a) COAGULACION

MATERIALES- 2 tubos de vidrio - Solución Salina al 0.9%- Solución de CaCl2 al 2.5% - Solución de NaCl al 2.5%- Varilla de vidrio o aplicadores - Tapones de caucho

MÉTODO

Diluya en cada uno de dos tubos, 0.25 ml de plasma oxalatado con 6 ml de solución salina al 0.9%. A uno de los tubos agregue 0.25 ml de solución de CaCl2 al 2.5% y al otro, 0.25 ml de solución de NaCl al 2.5%. Mezcle bien con un aplicador y deje en reposo. Observe después de 10 minutos qué pasa en los tubos, y escríbalo en su informe.

b) PERMEABILIDAD DE LOS GLÓBULOS ROJOS

MATERIALES- 8 tubos de vidrio - Agua destilada- Ferricianuro de potasio 2.5% - Hidrosulfito de sodio 2.5%- GoterosMÉTODO

Preparar los siguientes tubos:

TUBOS 1A 1B 1C 2A 2B 2CSangre

Anticoagulada 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas

AguaDestilada (ml)

3 3 3 - - -

NaCl 0.9 % (ml) - - - 3 3 3Ferricianuro de

Potasio 2.5%3 gotas - - 3 gotas - -

Hidrosulfito deSodio 2.5%

- 3 gotas - - 3 gotas -

Centrifugar los controles (tubos C) y observar el resultado.Compare los resultados entre los tubos que contenían agua (1A, 1B, 1C) y los que contenían solución salina (2A, 2B, 2C). Haga un esquema que le permita comparar los resultados obtenidos en los tubos de las series A y B. Escriba y analice las reacciones que se suceden en cada tubo.

Realice su informe en el cuaderno solicitado para ello y de acuerdo con el orden establecido:

1. TITULO2. CONSULTAS DE PRELABORATORIO3. OBJETIVOS4. MATERIALES Y METODOS5. RESULTADOS Y DISCUSION DE RESULTADOS6. CONCLUSIONES7. BIBILIOGRAFIA

Recuerde que los ítems 1 a 4 deben venir resueltos como preinforme.