Practica 2: Electroforesis de cidos nucleicos en geles de
agarosaIntroduccinEn biologa molecular se utiliza una serie de
mtodos para el estudio de macromolculas, una de ellas es la
electroforesis. La mayora de las molculas est cargada
elctricamente, por lo que se movilizan en un campo elctrico; de
acuerdo a su peso molecular y estructura.
El sentido del movimiento en un campo elctrico depende del signo
de la carga; pero la velocidad de desplazamiento es proporcional a
la magnitud de carga total de la molcula, del potencial, intensidad
de corriente elctrica y de la fuerza de friccin (dependiente de la
concentracin del gel a usarse).
El tipo de electroforesis ms usado para la identificacin y
caracterizacin de cidos nuclecos se desarrolla en geles de agarosa.
Este procedimiento permite separar molculas de DNA y RNA de acuerdo
a su peso molecular, influidos por la concentracin de agarosa,
intensidad de corriente elctrica y la presencia de sales.
El poder de resolucin de los geles de agarosa depende de su
concentracin que tiene, siendo esta una relacin inversa al tamao de
los poros del gel, por ejemplo, geles de 2% de agarosa por
electroforesis hacen migrar molculas dplex de 500 pb. y para
fragmentos grandes se utilizan concentraciones menores.
La visualizacin, se consigue por incidencia de luz ultravioleta
de 300 nm de longitud de onda, que permite la fluorescencia del
GelRed que se incorpora en las molculas de cidos nucleicos durante
el revelado del gel.
Procedimiento1. Preparacin del gel
Preparar un volumen adecuado (por calentamiento moderado) de
solucin de 0.8% agarosa en buffer de corrida TBE 0.5 X, dejar
enfriar el gel por unos minutos y agregar GelRed a una concentracin
final de 0.5 ug/ml; mezclar y verter en molde previamente
acondicionado. Una vez gelificada la agarosa, depositarla en una
cubeta electrofortica y agregar buffer de corrida TBE 0.5 X hasta
cubrir totalmente el gel.2. Tratamiento de la muestra de DNA En un
pedazo de parafilm o plstico limpio, mezclar 10 l de la muestra de
DNA resuspendida con 2 l de buffer cargado 6X.
Depositar con cuidado con una micropipeta las muestra en cada
bolsillo del gel de agarosa.
Paralelamente depositar 5l de marcador de peso molecular.
Aplicar 5 V/cm (en nuestro caso 100 V) y dejar correr por 40-60
minutos.
3. Revelado del gel Colocar el gel en un transiluminador de luz
ultravioleta (usar lentes protectores).
Fotografiar el gel y evaluar sus resultados.
ReactivosBuffer TBE 0.5x.
Buffer de cargado 6x
GelRed 5ug/ml.
Marcador de peso molecular
Muestra de DNA
Calibracin de la electroforesis para el clculo del tamao de los
fragmentos de DNA.-Las molculas lineales de DNA doble migran en la
electroforesis a una velocidad inversamente proporcional a su tamao
(dentro del intervalo de resolucin del gel empleado). Esto permite
estimar la longitud de los fragmentos estudiados.
Se aplica en uno de los pocillos del gel una mezcla de
fragmentos de DNA de tamao conocido denominados patrones,
marcadores de peso molecular o escalera de DNA (DNA ladder). Tras
su separacin en la electroforesis, se revelan y se representa para
todas las bandas el logaritmo del tamao (longitud en pares de
bases) frente al logaritmo de la movilidad (distancia de avance).
Sobre la recta ajustada se interpolan las distancias de avance de
las muestras problema, calculando as su tamao en
pb.Cuestionario
1. Qu tipo de electroforesis existen?
2. En base a qu la electroforesis de agarosa separa molculas?3.
Explicar la migracin de acuerdo con la carga
