TRONCO COMUN DIVISIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD.

MODULO: ENERGIA Y CONSUMO DE SUSTANCIAS FUNDAMENTALES.

PRACTICA No. 3

HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN POR AMILASA VEGETAL

OBJETIVO: Determinar la presencia de enzimas hidrolíticas durante la germinación por el método colorimétrico tomado como factor el tiempo de actividad enzimática. GENERALIDADES: Investigación bibliográfica por parte de los estudiantes sobre cinética enzimática de amilasa y factores que afectan la germinación. MATERIAL POR EQUIPO:

11 Tubos de ensaye (16 x 150) 1 Gradilla

4 Pipetas graduadas de 1 ml (plástico) 1 Pipeta de 5 o 10 ml 1 Vaso de Precipitado de 250 ml

1 Mechero 1 Soporte Universal con anillo

1 Embudo de plástico 1 Mortero de porcelana con pistilo

1 Vaso de precipitado1 Pipeta de 1 ml.

REACTIVOS:

Solución de glucosa al 1% Agua destilada Acido 3,5-Dinitrosalicilico (DNS) en frasco ambar.

1

Solución de Yodo (I2Kl en una solución de HCl 0.05 N) en frasco ambar. Solución de CaCl2 20 mM-NaCl 200 Mm Solución de Almidón al 0.2

PARATOS POR GRUPO:

Solución Buffer pH 5

A

1 Balanza Granataria 2 Espectrofotómetros 8 Celdas

OS ALUMNOS DEBEN TRAER POR EQUIPO:

seolus vulgaris) de 7-8 días de

limpiar

ETODO:

r de 10 a 12 semillas germinadas de maíz o fríjol de 7 a 8 días de

mente y

Tubo Almidón 0.2% en buffer pH 5.0 Solución CaCl-NaCl

L 0-12 Semillas de maíz (Zea mays) ó Frijol (Pha1

germinación. 1 plumón indeleble. Jabón y franela paraHielo

res de gasa 3 SobMasking tape Ligas. M

1. Pesagerminación para la obtención de la amilasa.

2. Moler las semillas en un mortero usando 3 ml de agua destilada por cada gramo de tejido.

3. Filtrar la molienda con ayuda del embudo y de dos capas de gasa. 4. Mantener el filtrado en un tubo de ensaye. Permitir que se sedi

mantenerlo en un baño de hielo. 5. Diluya el filtrado 1:10 con solución amortiguadora de acetato pH 5.0, seguir

manteniendo en frio. 6. Prepare la mezcla de reacción en dos tubos de ensaye (13 x 150 mm) de la

siguiente manera:

A Y B 4 ml 4 ml

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La parte de la práctica se realizará entre dos equipos, un equipo trabajará el ensayo A y otro equipo trabajará el ensayo B.

ENSAYO A

1. Prepare 10 tubos de ensaye (13 x 150) agregando a cada uno 1 ml de la

2. r 3 ml de agua destilada, este servirá para calibrar el

3. po 0) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos;

4. a cada tubo 2 ml de agua destilada y agitar.

cción, y correlacione

solución de yodo. A un tubo agregaespectrofotómetro al 100% de transmitancia o cero de absorbancia (densidad óptica). El primer tubo (tiemtome 1 ml del tubo de reacción que contiene la enzima diluida, a cada uno de los tubos de la serie que contiene solución de yodo. Agitar

5. Agregar6. Colocar en una celda y leer la absorbancia a 620 nm.7. Graficar la absorbancia a 620 mn contra tiempo de rea

con el cambio de color de la serie B.

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ENSAYO B

1. Prepare 10 tubos de ensaye (13x150) agregando a cada uno 1 ml de la

2. servirá para calibrar 575 nm

3. mpo 0) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos;

4. ño maría. ar, incluyendo al tubo

6. s en un vaso de precipitados con hielo y agua. lda), leer en

8. reacción. e color con la solución de

METODO PARA ELABORAR LA CURVA DE CALIBRACIÓN CON GLUCOSA

Solución 1 2 3 4 5 6 7

solución de DNS (ácido 3,5 – Dinitrosalicilico). Adicione 2 ml de agua destilada a un tubo queel espectrofotómetro a 100% de transmitancia o cero de absorbancia (densidad óptica) Al primer tubo (tietome 1 ml del tubo que contiene la enzima diluida y agregue a cada uno de los tubos que contienen solución de DNS. Calentar los tubos durante 10 minutos a ba

5. Agregar a cada tubo 8 ml de agua destilada y agitpara calibrar. Enfriar los tubo

7. Tomar lectura de cada uno de los tubos (utilizando la ceabsorbancia a 575 nm de cada tubo. Graficar absorbancia contra tiempo de

9. Correlacione los datos obtenidos con el cambio dyodo.

QUE SERVIRA COMO PATRÓN PARA HACER EL ANÁLISIS DE REGRESIÓN LINEAL, INCLUYENDO EL COEFICIENTE DE COORELACIÓN (r)

Glucosa 0.1% 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Agua Destilada 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0

Reactivo DNS 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

IBLIOGRAFIA:

1. Kaufman P.B., Labavitch J., Anderson-Prouty A., y Ghosheh N.S. (1975).

2. Laboratory Manual. Wadsworth

3. ones R.L. (2001). Biochimestry and

B

Laboratory Experiments in Plant Physiology Laboratory Manual. Macmillan Publishing Co., Inc. Nueva York. 261 pp. Ross C.W. (1974) Plant Physiology Publishing Co.,Inc. Belmont. 200 pp. Buchanan B.B., Gruissem W.Y., Jmolecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologists. Rockville. 1400 pp.

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CUESTIONARIO:

1. ¿A que grupo pertenece la enzima amilasa vegetal? lmidón, y cual relación

3. la enzima en el germinado de maíz? nto de las enzimas?

6. ficiente de correlación en el análisis de regresión

2. ¿Qué diferencia bioquímica existe entre glucosa y ahay entre ellas? ¿Porqué aparece

4. ¿Cuáles son las condiciones que alteran el funcionamie5. ¿Cómo se distingue bioquímicamente la degradación del almidón por

amilasa y por fosforilasa? ¿Cuál es la utilidad del coepara la elaboración de la curva de calibración?

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