Practica 4

Determinación Cuantitativa Enzimática Colorimétrica de Ácido

Úrico en Suero, Plasma u Orina

INTRODUCCIÓN

El ácido úrico es producto del metabolismo de las purinas (componentes de ciertas proteínas) y se produce de forma natural en el organismo.

Al existir más purinas en el cuerpo, aumentan las concentraciones de ácido úrico en sangre. Esto se conoce como hiperuricemia. Las concentraciones normales del ácido úrico en sangre son 7mg/dl para hombres y para las mujeres 6 mg/dl. Entre más tiempo se mantenga la hiperuricemia, mayor es la posibilidad de llegar a desarrollar “gota”, Inflamación articular aguda o crónica causada por la presencia de cristales de ácido úrico dentro de la articulación.

MATERIALES Y MÉTODOS

- 6 eppendorfs: 3 puntas amarillas de 2-200 µL y 3 azules de 100 a 1000 µL para micro pipetas.- Guantes- Cubreboca- 1 Tubo rojo para muestra sanguínea- Sistema vacutainer- 2 micro pipetas: 1-1000 µL- 1 reactivo para análisis de ácidoúrico (RB):

Buffer de fosfatos. pH………7.0 50 mmol/L

Acido 3,5-dicloro-2-hidroxibencensulfónico…..4 mmol/L

4-aminofenazona…….0.3 mmol/L

Peroxidasa………..> 1000 U/L

Uricasa…….> 200 U/L

- Estándar de ácido úrico enzimático(8 mg/dL)- Estabilizadores y activadores en solución buffer- 1 torniquete- Alcohol- Algodón

- Muestra de sangre

Equipo a utilizar:

- Centrifuga- Incubadora- Espectrofotómetro * reemplazado por el equipo automático Spinlab

PROCEDIMIENTO

1. Ejecutamos la extracción de sangre en el paciente2. Se depositó el recipiente (tubo de tapa roja) en la centrifuga (balancear la

centrifuga antes de utilizar, se balancea insertando en cada canaleta tubos con agua destilada para así balancear el peso) y se centrifuga de un rango de 10 a 15 minutos.

3. Después de centrifugar, el plasma estaba encima de los demás compuestos de la sangre.

4. Se deposito la muestra con el plasma en la incubadora por 10 minutos.5. Entonces, se procedió con los micrótomos, ajustando las puntas apropiadas

para cada reactivo [Nota: después de agregar la cantidad de cada compuesto en cada eppendorf, se etiqueta para así evitar confundirse]

Reactivo(RB) Estándar (E) Muestra (M)

Blanco 1.0 1.0 1.0

Reactivo - 0.02 -

Muestra - - 0.02

*NOTA: El volumen puede ser incrementado si el instrumento requiere volúmenes mayores a 1 mL. Use 2 mL del reactivo y añada 0.05 mL del estándar o de la muestra.

6. Después de preparar estos, se procedió a calibrar con el reactivo blanco, para asi verificar que el espectrofotómetro esté listo para proceder a verificar el Estandar. Al verificar el estandar, se procede a utilizar la muestra, y se comparan los resultados del estandar con la muestra

7. Se comparan datos, y estos son diferentes según la marca de espectrofotómetro, es diferente la ecuación para el resultado (aunque el que utilizamos en la práctica arrojaba el resultado sin necesidad de convertir con ecuación).

Valores esperadosRango Normal:

- Hombres: 3.4-7.0 mg/dL- Mujeres: 2.4-5.7 mg/dL

Orina: 0.5-1.0 g/día (dependiendo del contenido de purinas en la dieta)

ResultadosPaciente: Gabriela Rodríguez Castro Edad: 19 añosEstado: en Ayunas

CUESTIONARIO Y ACTIVIDADES

1. ¿Por que se lee a 520 nm la muestra?De acuerdo al principio (determinado por la marca LinconR) durante la reacción enzimática se produce un complejo color rojo violeta este color es algo que se llamamos complementarios pues es el color que para nosotros es “visible”; dicho compuesto debe ser leído a 520nm pues es la longitud de onda que permite percibir ese color, esto ejemplificado en la siguiente tabla:

2. ¿Cual es la diferencia entre un estándar y un blanco?Una solución estándar sirve como referencia o por decirlo así como un punto de comparación al momento de realizar la valoración de la muestra (ya que contiene

Blanco Reactivo 0.111 AbsStandard 0.342 AbsFactor Calc. 23.4Resultado 25.3 mg/dL

cierta concentración de la sustancia a evaluar); en cambio la solución blanco es una forma de calibrar el aparato; pues es una muestra a medir la cual no contiene nada de la sustancia que se busca cuantificar y sirve para ajustar el aparato a cero dentro de la escala determinada.3. ¿Cual es la finalidad de determinar acido úrico en sangre u orina?En el caso de la sangre se utiliza porque la mayor parte del acido úrico se disuelve en la sangre; si tomamos en cuenta que es una prueba cuantitativa. Y en orina por que esta después de disolverse se filtra en los riñones donde sale atreves de la orina.4. Describa los componentes del tejido sanguíneo:

El plasma sanguíneo es la parte líquida de la sangre. Es salado, de color amarillento y en él flotan los demás componentes de la sangre, también lleva los alimentos y las sustancias de desecho recogidas de las células. El plasma cuando se coagula la sangre, origina el suero sanguíneo.

Partes Formes o Células Sanguíneas

Glóbulo RojoEritrocito: Se parece a un plato o una rosquilla pero sin el agujero del centro. Los glóbulos rojos sólo miden de 7 a 8 micrones de diámetro, pero son las partículas

más pesadas de la sangre, contienen hemoglobina, una proteína que transporta el oxígeno.

Glóbulos Blancos: son un conjunto de células sanguíneas cuya función principal es la defensa del organismo de sustancias ajenas o agentes infecciosos.Leucocito Granulocitos: son un tipo de glóbulo blanco que incluye neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Se denominan granulocitos debido a que están compuestos de pequeños gránulos que contienen proteínas importantes, ayudan al cuerpo a combatir infecciones bacterianas.

Neutrófilo: Miden de 9 a 12 μm, Es una célula muy móvil y su consistencia gelatinosa le facilita atravesar las paredes de los vasos sanguíneos para migrar hacia los tejidos, ayudando en la destrucción de bacterias y hongos y respondiendo a estímulos inflamatorios.Basófilo: Miden alrededor de unos 10 μm, son los responsables del inicio de la respuesta alérgica.Eosinófilo: Miden 10-12 μm, interaccionan con otras células por la expresión de múltiples receptores en su superficie. Además, son células fagocitarias que demuestran especial afinidad por los complejos antígeno-anticuerpo, por lo que la mayoría de los eosinófilos son atraídos por quimiotaxis.

Leucocitos Agranulocitos: comprende a linfocitos y monocitos cuyo citoplasma carece de granulaciones

Linfocito: Mide entre 7 y 15 μm son los encargados de producir anticuerpos y sintetizan en el citoplasma las diferentes gamaglobulinas.Monocito: Mide de 9-12 μm, su función principal es remover y procesar partículas extrañas.Macrófagos: los monocitos son sus precursoras y tienen como función actuar en los procesos de fagocitosis, inflamación, presentación de antígenos y la hemostasia.

PlaquetasLas plaquetas, también llamadas trombocitos, son fragmentos celulares derivados del megacariocito. Tienen un tamaño de 2-3 micras y un aspecto discoidal. Carecen de núcleo y su función consiste en la formación de coágulos para evitar la pérdida de sangre. En su interior poseen varios tipos de vesículas secretoras. Cuando se produce una lesión que desencadena el proceso de coagulación.

CONCLUSIÓN

El paciente presento un valor elevado de acido úrico o bien altos niveles de actividad de la enzima uricasa en suero o plasma. En esta práctica se logró hacer la determinación de urea ( la cual es el resultado final del metabolismo de las proteínas)en suero (debido a que si se utiliza la sangre entera, es decir plasma + suero, en estos hay una gran diferencia de valores que existe entre el suero y los

eritrocitos, por lo que se prefiere el suero o en su defecto el plasma para esta determinación) mediante una reacción colorimétrica en donde la urea presente en las muestras reaccionó con el o-ftalaldehido en medio ácido (solución de boratos, que son sales o ésteres de ácido bórico) originando así un complejo coloreado (rosa) que se cuantificó espectrofotométricamente dando así como producto a la isoindolina, la cual le proporcionó la coloración a la muestra y de esta manera la intensidad del color formado por la reacción fue proporcional a la concentración de urea en la muestra ensayada.

Discusión de los resultados

Después de vistos los resultados, se determinó que las personas a las que se extrajo las muestras salieron muy bien en ácido úrico. No padecerá de problemas por una alta concentración de ácido úrico.

El espectrofotómetro no se puede calibrar con agua destilada, se tiene que calibrar con un blanco, el cual fue en esta ocasión, nuestro reactivo blanco. La muestra fue de la sangre de una mujer, puesto que la cantidad de ácido úrico es diferente en el otro sexo por una gran cantidad. También, esta cantidad puede variar según el estado de salud de la persona y el tamaño que esta tenga, aparte de su peso.

Referencias:

http://www.cimascientific.com/4250S.htm

http://ocw.usal.es/ciencias-experimentales/analisis-aplicado-a-la-ingenieriaquimica/contenidos/course_files/Tema_3.pdf

http://www.todoexpertos.com/categorias/ciencias-e-ingenieria/quimica/respuestas/1363718/tubo-blanco-control-estandar

http://answers.yahoo.com/question/index?qid=20070620101816AA5R8yb

http://answers.yahoo.com/question/index?qid=20060926074447AAdayzG

http://www.mvzunipaz.edu.co/documentos/bloques/patologia/charlas/globulos-rojos-y-blancos.pdf