PRACTICA: Determinación y caracterización del Acido ascórbico

en naranja

Presentado por:Arce Arbildo LadyHachoque Cristobal EddittHilasaca CarlosSauceda Plasencia Nivia

Docente:Mg Sc. Ing. Indira Betalleluz

Curso:Química de Alimentos Avanzada

ESCUELA DE POST GRADOESPECIALIDAD DE TECNOLOGÍA DE

ALIMENTOS

DICIEMBRE 2007, PERU

I. INTRODUCCIÓN

El ácido ascórbico o vitamina C es un nutriente esencial en la dieta humana. La

vitamina C, funciona como un cofactor redox y un catalizador en una amplia

serie de procesos y reacciones bioquímicas. En humanos, la vitamina C sana y

previene el escorbuto, por ello la designación de ácido ascórbico. El término

"Scurvy" o "scurfy", en el inglés antiguo, probablemente se derivó de los

términos escandinavos, skjoerberg y skorbjugg, queriendo decir piel áspera o

costrosa. En la historia humana, además de la hambruna, el escorbuto ha

causado la mayoría de los padecimientos de origen nutricional (Johnston et al.,

2001).

Esta enfermedad fue descrita por los antiguos griegos, egipcios y romanos,

siendo asociado por mucho tiempo a los ejércitos invasores, marinas de guerra

y exploradores. Aun al final del último siglo, el escorbuto estaba ampliamente

generalizado en medio de los mineros de oro de California y Alaska. En 1747,

el Capitán James Lind, médico de la armada británica, demostró que el

escorbuto, era consecuencia de la falta de ingesta de frutas y verduras frescas.

Lind demostró que la mejor forma de prevenirlo se lograba agregando a la dieta

diaria de la tripulación un poco de jugo de limón (Braverman, 1980; Davey et

al., 2000).

El grupo que desarrolla la nomenclatura para vitaminas había propuesto que el

nuevo factor antiescorbútico sea llamado "factor o vitamina C", ya que la "A" y

"B" habían sido previamente designadas como factores potenciales de salud y

de crecimiento o vitaminas. En 1915, Zilva y sus asociados del Instituto Lister

en Londres habían aislado la actividad antisorbútica de una fracción cruda de

limón. Utilizando ensayos animales demostraron que la actividad se destruye

por oxidación y es protegida por agentes reductores (Braverman, 1980;

Johnston et al., 2001). En 1928, Szent-Gyorgyi y Haworth lograron aislar el

ácido ascórbico en forma de cristales (Davey et al., 2000). Debido a su gran

aporte por el estudio de la vitamina C, ambos recibieron el Premio Nobel en

1937 (Eitenmiller y Landen Jr., 1999).

Debido a su alta sensibilidad a los factores externos, la vitamina C ha sido

utilizada para definir la vida útil durante el almacenamiento de vegetales

frescos y semisecos.

II. OBJETIVOS

Cuantificar el contenido de ácido ascórbico en frutas

Cinética de degradación

III. FUNDAMENTO TEÓRICO

1.1. Estructura Química

El ácido ascórbico o el ácido L-ascórbico es la designación de la Comisión

IUPAC-IUB para Vitamina C (2-oxo-L-teo-hexono-4-lactona-2,3-enodiol). Las

estructuras químicas del ácido ascórbico y algunos derivados se muestran en

la figura 1. El ácido ascórbico tiene un anillo planar de cinco miembros; los dos

centros quirálicos que están en las posiciones 4 y 5 determinan los cuatro

estereoisómeros. El ácido dehidroascórbico, la forma oxidada del ácido

ascórbico, retiene alguna actividad de la vitamina C y puede existir como un

hemicetal hidratado, o como un dímero (Johnston et al., 2001). Tanto el ácido

L-ascórbico como el ácido dehidroascórbico poseen actividad biológica o

vitamínica. Pero el ácido D-isoascórbico no posee actividad biológica, siendo

este el sustituto comercial del ácido L-ascórbico (Wong, 1995; Gregory, 1996).

Gregory (1996) y Davey et al. (2000) afirman que debido a que el ácido L-

ascórbico posee propiedades ácidas y reductoras debidas al resto 2,3 enodiol,

es un compuesto muy polar. El carácter ácido del ácido L-ascórbico se debe a

la ionización del grupo hidroxilo en el carbono C-3, donde tiene un pKa1 = 4.04

a 25ºC. Una segunda ionización, la disociación del hidroxilo en el carbono C-2,

con pKa2 = 11.4 a 25ºC, es mucho menos favorables.

Fig. 1. El ácido ascórbico y varios productos de oxidación. En solución, el ácido

ascórbico probablemente existe como hemicetal hidratado (Johnston et al., 2001).

1.2. Estabilidad y Formas de Degradación

Braverman (1980) sostiene que pequeñas cantidades de oxígeno, que suelen

haber en los alimentos a consecuencia de las diferentes operaciones

realizadas, son suficientes para iniciar la cadena de reacciones autooxidativas

que degradan el ácido ascórbico. Mientras que Tannenbaun (1976) citado por

Huapaya (1995) menciona que el ácido ascórbico está sujeto a una variedad de

mecanismos de degradación:

Degradación aerobia catalizada, en presencia de oxígeno, metales y

enzimas

Degradación aerobia no catalizada, sólo oxígeno

Degradación anaerobia, flavonoides

Lixiviación

El ácido ascórbico es fácilmente destruido por la oxidación, especialmente a

temperaturas elevadas y/o cuando la reacción es catalizada por iones

metálicos como el Fe+3 y Cu+2, convirtiéndose en la vitamina que se pierde

más fácilmente durante el procesamiento, almacenamiento y cocción de los

alimentos. Su degradación está relacionada con la temperatura, luz, pH,

disponibilidad de oxígeno, metales, actividad de agua, ciertas enzimas y hasta

la presencia de otras vitaminas como la riboflavina. Su estabilidad es mayor a

pH ácidos y en ausencia de oxígeno puede resistir temperaturas de

esterilización (Badui, 1990).

Davey et al. (2000) afirman que las hortalizas de hoja verde y los granos verde

son particularmente vulnerables a los periodos inmediatos a la post-cosecha,

pudiendo perder un 20% de ácido ascórbico. Un proceso de deshidratación

como el que se les da a las papas, puede producir hasta un 75% de pérdidas

de ácido ascórbico. Mientras que para las hortalizas, se puede dar algo de 50%

de pérdidas, en el enlatado. Estas pérdidas son inevitables debido a la

movilización del agua. Tal como se aprecia en la figura 2, en los enlatados y

otros productos, una parte del ácido ascórbico es lixiviado hacia el líquido de

procesado.

Regímenes de Cocción a diferentes proporciones agua: muestra 1. Sancochado, 1:1. 10 min de cocción 2. Sancochado, 2:1. 10 min de cocción 3. Sancochado, 5:1. 10 min de cocción 4. Sancochado y Frito, 2:1. 12 minutos de

cocción 5. Frito en movimiento. 10 min de cocción 6. Cocido a Presión, 2:1. 6 min de cocción 7. Microondas, 30ml de agua. 6 min de

cocción

Fig. 2. Pérdidas de Ácido L-Ascórbico durante el procesamiento y cocción en

casa (Davey et al., 2000)

Davey et al. (2000) concluyen que la oxidación del ácido ascórbico ocurre en

dos pasos. El primero es reversible, mientras que el segundo no lo es. En la

primera etapa, la oxidación no es severa y sólo se pierde dos hidrógenos hasta

llegar a la forma de ácido L-Dehidroascórbico. En la segunda etapa, la vitamina

C generalmente se degrada hasta 2, 3 dicetoglucónico (figura 3). Además

sostienen que esta reacción ocurre a los 6 minutos a 37ºC. En este proceso

térmico, las enzimas catalizadoras, como la fenolasa, citocromos oxidasa,

ácido ascórbico oxidasa y peroxidasas se desnaturalizan.

Fig. 3. Oxidación del ácido L-ascórbico (Davey et al., 2000)

1.3. Cinética del Tratamiento Térmico del Ácido Ascórbico

1.3.1. Cinética de Degradación del Ácido Ascórbico

La estabilidad del ácido ascórbico ha sido descrita por varios modelos

cinéticos. Laing et al. (1978) citado por Huapaya (1995) afirma que a

temperaturas y actividades de agua altas, la cinética de degradación del ácido

ascórbico es de orden cero. Lee y Labuza (1975) y Thompson (1982) citados

por Huapaya (1995) afirman que con variaciones de parámetros como

temperatura, metales, concentración de oxígeno y actividad de agua, la cinética

es de primer orden.

Por si parte, Robertson y Samaniego (1986), Eison-Perchonok y Downes

(1982) y Singh et al. (1976) citados por Mikacatl (2003) concluyen que el

mecanismo de degradación del ácido ascórbico puede seguir cinéticas de

primer o segundo orden. En condiciones abundantes de oxígeno o ambientes

anaeróbicos, la degradación del ácido ascórbico sigue una cinética de primer

orden. Mientras que bajo condiciones limitantes de oxígeno, el mecanismo es

de segundo orden.

A condiciones isotérmicas, la ecuación general de cinética de degradación de

orden n que sigue la ley de la potencia, está dada por la ecuación:

Donde:

C(t): Concentración del nutriente, en este caso vitamina C, en el tiempo t.

k(T): Constante de velocidad de reacción correspondiente a la temperatura T.

(s–1)

n: Número de orden de reacción

Para una reacción de orden cero (n = 0), la ecuación quedaría de la forma:

Y si la reacción fuera de primer orden (n = 1)

Pero si la reacción fuera de segundo orden (n = 2)

Donde C0 es la concentración inicial del ácido ascórbico.

Sin embargo, en la actualidad se están aplicando modelos cinéticos de

degradación en procesos no isotérmicos (Corradini y Peleg, 2006).

1.3.2. Ecuación de Arrhenius y Energía de Activación

Cada una de las reacciones anteriormente mencionadas está dada para una

temperatura determinada. La ecuación de Arrhenius nos ayuda a correlacionar

las constantes de velocidad de reacción.

Donde:

k0 : Coeficiente cinético o factor de frecuencia (s–1)

Ea : Energía de activación (KJ/mol-K, Kcal/mol-K)

R : Constante Universal de los Gases Ideales (8.314 J/mol-K, 1.98 cal/mol-K)

1.3.3. Tiempo de Reducción Decimal o Valor D

El tiempo de reducción decimal se define como el tiempo necesario para

reducir la concentración de nutriente hasta su décima parte a una temperatura

T.

1.3.4. Termorresistencia o Valor Z

La sensibilidad de los nutrientes a la temperatura se mide por medio del valor

Z, que se define como el incremento de temperatura necesario para reducir el

valor D a su décima parte.

1.4. Métodos de Determinación

Existen varios métodos de cuantificación de ácido ascórbico. Eitenmiller y

Landen Jr. (1999) mencionan que las principales son los métodos de titulación,

diclorofenolindofenol, fluorescencia automatizada a de 365 y 440,

espectrofotometría a 500nm o HPLC.

La figura 4 nos ilustra acerca de las reacciones del ácido ascórbico con algunos

tipos de análisis.

Fig. 4. Reacciones importantes del ácido L-ascórbico durante el análisis de la Vitamina C

(Eitenmiller y Landen Jr., 1999).

1.4.1. Titulación con 2, 6 diclorofenolindofenol

En 1930, Tillmans introdujo el método de titulación con 2, 6

diclorofenolindofenol (DCPI). El DCPI, que tiene una coloración azulina, es

reducido por el ácido ascórbico hasta convertirse en una solución incolora. El

ácido L-ascórbico es oxidado a ácido dehidroascórbico. En exceso de DPI

obtiene una coloración ligeramente rosada. Este es el punto final de titulación.

Una alternativa de la determinación visual del punto final de titulación es medir

la absorbancia a 518nm.

Este es un método sencillo y práctico de realizar. Sin embargo, existen

deficiencias importantes. La titulación es limitada a la cuantificación de ácido de

L-Ascórbico. El ácido dehidroascórbico no será medido a menos que sea

reducido a ácido ascórbico. La titulación no distingue entre ácido L-Ascórbico

del ácido isoascórbico. El método no sirve para análisis de vitamina C en

carnes procesadas y curadas que contienen ácido isoascórbico. La titulación

con DCIP puede ser usada para jugos frescos y multivitaminas que no

contienen cantidades excesivas de cobre o hierro. Para comidas procesadas o

cocinadas que contengan cobre, hierro, o estaño, debería utilizarse otros

métodos capaces de medir el ácido dehidroascórbico, además del ácido de L-

ascórbico. Los extractos altamente coloreados de frutas y hortalizas pueden

enmascarar el cambio de color en el punto de final de la titulación.

Además, la reducción de DCIP no se limitada al ácido L-ascórbico. Cualquier

sustancia reductora presente en la muestra puede disminuir el color. Tales

interferencias pueden ocasionar mediciones altamente erróneas, si no

reconocidas de ácido L-ascórbico. Las sustancias que pueden interferir

incluyen iones cuprosos, ferrosos, y estañosos, sulfito, tiosulfato, taninos,

betanina, cisteína, glutatión, y reductones generados por pardeamiento no

enzimático. Distintas modificaciones de este método han sido introducidas para

eliminar o minimizar los efectos de interferencias en la titulación DCIP.

Recientemente, un método de extracción de fase (SPE) sólida fue desarrollado

que expande la titulación DCIP para multivitaminas altamente coloreadas,

bebidas no alcohólicas, y frutas y hortalizas. Por otro lado, el paso de limpieza

remueve cobre, hierro,

sulfito, y otras sustancias, como la cisteína y glutatión, disminuyendo la

interferencia. La Sílica C18 impregnada con 2,2 - bipiridil-2,9-dimetil-1,10-

fenatrolina (neocuproína) y N-etilmaleimida quitan compuestos de Fe (II) y Cu

(I) y sulfidril, respectivamente. El método tiene prevista la determinación de

ácido L-ascórbico y ácido dehidroascórbico por reducción de ácido

dehidroascórbico a ácido L-ascórbico con cisteína antes del paso SPE. Este

método es simple y aumenta la sensibilidad del método DCIP. La incorporación

del paso SPE en los métodos reguladores existentes podría disminuir los

problemas asociados con los métodos existentes de titulación (Eitenmiller y

Landen Jr., 1999).

IV. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1. Materia Prima

Naranja valencia

4.2. Materiales

Cubetas de espectrofotómetro

Papel Tissue

Fiolas de 1000, 500, 100 y 50 ml

Tubos de ensayo

Pipetas volumétricas de 1, 2, 10 y 20 ml

Beakers de 100 y 50 ml

Embudo

Varilla de vidrio

Balanza analítica, electrónica de 0,1 mg de sensibilidad

Centrifuga

Tablas de picar

Cuchillo

4.3. Reactivos

Acido oxalico al 0,4%: Pesar 4 g y llevar a 1000 ml con agua destilada.

Solución madre de acido ascórbico 0.1% en solución ácido oxálico:

Pesar 100mg de acido ascórbico y llevar a volumen de 100 ml con una

solución de acido oxalico al 0,4%

Solución de 2,6 Dicloroindofenol: Pesar 12 mg de 2-6 DFIF, disolver y

llevar a 1000 ml de volumen con agua destilada. Emplear agua destilada

hirviente. Almacenar en botella de color oscuro y en refrigeración

4.4. Metodología de desarrollo

4.4.1. Preparación de soluciones estándares y curva de calibración

Tomar 1, 2, 3, 4 y 5 ml de solución madre de acido ascórbico, llevar a volumen

de 100 ml con la solución de acido oxalico al 0,4%. Estas soluciones

enumeradas del 1 al 5 contendrán 1, 2, 3, 4 y 5 mg de acido ascórbico por 100

ml respectivamente

Tomar 4 tubos de prueba y enumerarlos del I al IV y agregar lo siguiente:

I 10ml de agua destilada

II 1 ml de acido oxalico al 0,4%

III 1 ml de solución estándar + 9 ml de agua

IV 1 ml de solución estándar

Ajustar a cero la absorbancia usando I y una longitud de onda de 515 nm

(Klinmezak, 2007)

Al tubo III añadir 9 ml del colorante y exactamente después de 15 segundos,

leer la absorbancia (L1)

Ajustar a cero la absorbancia con la solución del tubo III

Al tubo IV añadir 9 ml del colorante y exactamente después de 15 segundos,

leer la absorbancia (L2)

Repetir desde 2. Para cada estandar de trabajo y registrar los correspondientes

valores de L1 y L2. Construir la curva estandar con las concentraciones de

acido ascórbico (mg/100ml) en la abcisa y en la ordenada la absorbancia (L1-

L2) para cada estandar de trabajo.

4.4.2. Preparación y determinación del contenido de Vitamina C de la

muestra problema

Extraer 200 ml de jugo de la muestra problema por el método de exprimido y

llevarlo a clarificar con la centrifuga a 4000 rpm por 15 minutos, luego someter

a un filtrado al vacío con papel de filtro.

Tomar 3 ml del filtrado y llevarlo a 100 ml con solución de acido oxálico al 0,4

% en una fiola u otra dilución que permita tener medidas dentro del rango de

medida de la curva estándar.

Proceder como se señaló en el item anterior desde 2 hasta 6. En lugar del

estándar de trabajo trabajar con el jugo de la muestra problema.

Calcular L1-L2 y la concentración de acido ascórbico mediante la curva

estándar.

4.4.3. Tratamiento térmico de la muestra problema

Se toma muestras del jugo filtrado de naranja de 10 ml y se coloca en tubos de

prueba cerrados , para minimizar la variación de masa debido a la perdida de

agua de la muestra por efecto de la temperatura (Acebedo, 2005)

Las muestras serán sometidas a dos temperaturas: T1 = 80ºC y T2 = 90ºC.

Para cada temperatura se tomara tiempos de 15, 25, 45 y 60 minutos de

calentamiento en el baño termostático.

Enfriar en baño con hielo

Realizar una dilución adecuada con la muestra tratada (la lectura debe caer en

el rango de la curva de calibración) en 100 ml de acido oxalico al 0,4%.

Medir la absorbancia en el espectrofotómetro a una λ = 515 nm. Realizar tres

repeticiones

4.4.4. Obtención de la equivalencia gasto de 2,6 dicloroindofenol con

cantidad de ácido ascórbico

Transferir 2 ml de la solución estándar de ácido ascórbico en un erlenmeyer de

50ml conteniendo 5 ml solución de extracción. Titular rápidamente con la

solución estándar de 2,6 dicloroindofenol hasta la aparición de un color rosado

persistente por un tiempo mayor de 5 segundos. Realizar una titulación similar

de 3 blancos compuestos de 7 ml de la solución de extracción más un volumen

de agua equivalente al volumen de la solución estándar de dicloroindofenol

gastado en la titulación directa. Después de sustraer el blanco del gasto en la

solución estándar de ácido ascórbico, cálcular y expresar la concentración de la

solución estándar de 2,6 dicloroindofenol como mg de ácido ascórbico

equivalente a 1 ml de gasto.

V. RESULTADO Y DISCUSIONES

Figura 1 - Curva estándar de Acido ascórbico a 515 nm (mg AA/100 ml solución de

acido oxálico al 0.4%)

y = 0.0532x + 0.0032

R2 = 0.9964

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 1 2 3 4 5 6

CONCENTRACION (mg/100ml)

AB

SO

RB

AN

CIA

Tabla 1 – Concentración mg/100ml de acido ascórbico en naranja

Tiempo (min)

L1 L2 L1 – L2 Absorbancia 

Concentración mg/100mlR1 R2 R1 R2 R1 R2

0 0.271 0.272 0.093 0.092 0.178 0.18 0.179 53.127215 0.272 0.273 0.107 0.112 0.165 0.161 0.163 48.292030 0.27 0.271 0.102 0.155 0.168 0.116 0.142 41.945745 0.272 0.27 0.157 0.165 0.115 0.105 0.11 32.275260 0.275 0.273 0.195 0.203 0.08 0.070 0.075 21.6981

Figura 2 - Degradación de acido ascórbico en naranja a 90ºC a diferentes

tiempos

y = -0.5258x + 55.243

R2 = 0.975

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50 60

Tiempo (min)

Con

cent

raci

on A

A (

mg/

100

ml)

La concentración inicial de ácido ascórbico es de 53.1272 mg/100ml de jugo de

naranja. Collazos reporta entre 43 y 92 mg/100g de naranja. Mientras que

Braverman (1980) afirma que el contenido de ácido ascórbico varía en función

a la parte de la naranja. La cáscara amarilla tiene entre 175 y 292mg/100g. En

el albedo o cáscara blanca, 86 - 194 mg/100g y en la pulpa, 44.9-73.2

mg/100g. La figura 2 muestra la disminución del ácido ascórbico al aplicarse

los tratamientos térmicos al jugo de naranja en diferentes tiempos.

Como se dijo anteriormente, a condiciones totalmente aerobias o anaerobias, la

cinética de reacción es de orden cero (Robertson y Samaniego, 1986; Eison-

Perchonok y Downes, 1982 y Singh et al., 1976; citados por Mikacatl, 2003).

VI. CONCLUSIONES

El jugo de naranja de variedad valencia tiene 53.1272 mg/100ml de ácido

ascórbico. Y es degradado elevadas temperaturas respecto al tiempo de

tratamiento.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Badui, Salvador. 1990. Química de los Alimentos. 2da Edición. México. Editorial

Alhambra.

Belitz, Hans-Dieter y Grosch, Werner. 1997. Química de los Alimentos. 2da Ed.

Trad. por López Buesa, María Otilia. España. Ed. Acribia. 187p.

Braverman, J.B.S, 1980. Introducción a la Bioquímica de los Alimentos. México.

Editorial El Manual Moderno. 358p.

Corradini, Maria G. y Peleg, Micha. 2006. Prediction of vitamins loss during

non-isothermal heat processes and storage with non-linear kinetic models.

Trends in Food Science & Technology 17: 24–34

Davey, Mark W.; Montagu, Marc Van; Inze´, Dirk; Sanmartin, Maite; Kanellis,

Angelos; Smirnoff, Nicholas; Benzie, Iris J.J.; Strain, John J.; Favell, Derek y

Fletcher, John. 2000. Review: Plant L-ascorbic acid: chemistry, function,

metabolism, bioavailability and effects of processing. J Sci Food Agric 80:825-

860

Huapaya García Monterroso, Erika Corona. 1995. Evaluación de la pérdida de

Vitamina C durante el proceso y almacenamiento de pulpa de camu – camu

(Myrciaria paraensis). Tesis para optar el título de Ingeniero de Industrias

Alimentarias. UNALM. Perú.

Johnston, Carol S.; Steinberg, Francene M. y Rucker, Robert B. 2001. Chapter

15. Ascorbic Acid. In: Rucker, Robert B.; Suttie, John W.; McCormick, Donald

B. y Machlin, Lawrence J. Handbook of Vitamins. 3rd Edition. USA. Marcel

Dekker, Inc.

Matissek, Reinhard; Schnepel, Frank y Steiner Gabriele. 1998. Análisis de los

Alimentos. Fundamentos, Métodos y Aplicaciones. España. Ed. Acribia, S.A.

416p.