CROMATOGRAFA EN COLUMNA FLASH (CC)
La cromatografa en columna es el mtodo ms utilizado para la
separacin y purificacin de compuestos orgnicos, slidos o lquidos, a
escala preparativa. La fase estacionaria (adsorbente) se coloca en
una columna de vidrio que termina en un estrechamiento con una
llave y se impregna con el eluyente (fase mvil). La mezcla a
separar se deposita en la parte superior de la columna y la fase
mvil atraviesa el sistema (Figura 1). Los compuestos se van
eluyendo disueltos en el eluyente, se van recogiendo ordenadamente
en fracciones de pequeo volumen (1, 2, 3,.....) y se analizan por
CCF. Los productos van saliendo de la columna segn su polaridad,
primero salen los menos polares que son los menos retenidos por el
adsorbente y los ltimos los ms polares por su mayor retencin en la
fase estacionaria. El adsorbente ms utilizado para este tipo de
cromatografa es la gel de slice y en segundo lugar la almina. El
tamao de partcula del adsorbente es importante para la separacin y
su eleccin depende en gran medida de que la elucin de la
cromatografa se realice por gravedad o a media presin (flash
chromatography). En una elucin a media presin se pueden emplear
tamaosde partcula ms pequeos, que permiten una separacin ms eficaz.
Sin embargo, en una elucin por gravedad el uso de tamaos de
partcula pequeos impedira el flujo del disolvente.
Antes de realizar una separacin en cromatografa de columna hay
que elegir adecuadamente el disolvente haciendo ensayos en CCF.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1.- Separacin por cromatografa en columna de una mezcla de
cristal violeta y naranja de metiloSe sujeta la columna, en posicin
vertical, a un soporte utilizando dos pinzas: una cerca de la llave
y otra en la parte superior y se introduce un pequeo copo de algodn
en su extremo inferior. Se coloca un erlenmeyer debajo de la
columna y un embudo en la parte superior (Figura 1). En un vaso de
precipitados se prepara una suspensin con 5 g. de gel de slice
(adsorbente) y 50 mL. de etanol (eluyente). Se aade un poco de
etanol a la columna y luego se vierte la suspensin previamente
preparada en su interior. Se abre la llave, se golpean suavemente
las paredes de la columna mientras dura la sedimentacin del
adsorbente para que este se compacte adecuadamente procurando que
no se formen burbujas y evitando que se seque la gel de slice.El
etanol que se va recogiendo de la columna se incorpora al vaso
donde se prepar la suspensin adsorbente-eluyente para as recuperar
la gel de slice que hubiera podido quedar y se trasvasa todo de
nuevo a la columna. Se deja que el eluyente baje hasta una altura
sobre el adsorbente de 1-2 mm, se cierra la llave de la columna se
quita el embudo y con una pipeta se aade cuidadosamente 1 mL de una
solucin preparada de cristal violeta y naranja de metilo. Se abre
la llave de la columna para que esta disolucin quede inmersa en la
gel de slice y se vuelve a cerrar cuando la disolucin de colorantes
alcanza una altura de 1 mm sobre el adsorbente. Se aaden con una
pipeta 5mL de etanol con mucho cuidado y muy lentamente para no
distorsionar el frente de la columna. A continuacin, se abre la
llave y se contina aadiendo etanol para desarrollar la columna
hasta que se recoja el primer colorante. Despus se utiliza una
mezcla de disolventes: etanol/trietilamina en proporcin 9:1 como
eluyente para el segundo colorante ( Figura 2).
Observacin: Durante todo el proceso nunca debe secarse la
columna!
El naranja de metilo es un colorante azoico (los azo-derivados
contienen el agrupamiento N=N-, son compuestos intensamente
coloreados y muchos se emplean como colorantes) que se utiliza como
indicador cido-base y es amarillo en medio bsico y rojo en medio
cido. El cristal violeta es un colorante derivado del
trifenilmetano. Ambos compuestos son muy polares y sus estructuras
son:
Anotar los resultados obtenidos y discutir la separacin
obtenida.
PREGUNTAS1. El valor del Rf depende del adsorbente utilizado? y
del eluyente?2. Sugerir un ensayo para determinar la pureza de un
compuesto por CCF
