Embed Size (px)
Citation preview
2013
Rosmery Cárdenas Hurtado
UNIVRSIDAD CATOLICA SANTA
MARIA
08/11/2013
CULTIVO IN VITRO DE
ANTERAS
CULTIVO IN VITRO DE ANTERAS
1. OBJETIVOS:
→ Establecer in vitro anteras de Dianthus caryophyllus (clavel).
→ Evaluar la respuesta del explante bajo la interacción auxina-citoquinina en la inducción
de tejido calloso.
2. MARCO TEÓRICO
El polen que se encuentra en las anteras, en estado en de microspora, es un gran
precursor para el desarrollo de organogénesis indirecta. Esta característica de las
anteras conocida se una en el cultivo in vitro, mediante los granos de polen en
condiciones adecuadas especificas en un medio de MS enriquecido con 2,4 D que
generara una nuevas plantas, por diferenciación de tejido.
El cultivo de anteras principalmente sirve para obtener plantas con la mitad de numero
de cromosomas normal de la especie a la que pertenece, las plantas haploides serán
clones con características iguales al de la planta madre que fue seleccionada para la
práctica.
De esta forma se puede obtener líneas homocigóticas de plantas sin tener que pasar por
la endogamia normal.
En la práctica se uso botones de cucarda mediante un método de desinfección, siembra e
incubación.
Las células gametofíticas conocidas como microsporas o megasporas que son las células
sexuales de la planta, se pueden usar como explante en el cultivo de tejidos para obtener
una planta haploide. (Roca et al, 1982)
Las esporas deben pasar por una etapa llamada via esporofitica que tiene como fin
conseguir esporofitos haploides, y dejar el curso normal que pasa en condiciones de
campo esta etapa se la conoce curso ontogénico. (Roca et al, 1982)
El proceso se llama androgénesis cuando las microsporas originan embriones y plantas, y
ginegénesis cuando tiene lugar en el cultivo de óvulos y ovarios. La androgénesis,
obtenida mediante el cultivo de anteras, es la técnica más usada para la inducción de
haploides y ha demostrado tener gran importancia para el fitomejoramiento. (Roca et al,
1982).
Mediante esta técnica, las anteras inmaduras que contienen polen en una etapa especifica
de desarrollo se colocan en medios donde el polen inmadura se divide para formar
embriones o callos. Transferidos estos a medios de regeneración, se forman plantas. En
la mayoría de casos se producen plantas haploides esteriles, pero en algunas especies
ocurre una duplicación espontaea de los cromosomas en las estapas de callos y de
regeneración de la planta.
Desde que Guha y Maheshwari lo descubrieron en 1964, el cultivo de anteras se ha
exedido a mas de 150 especies (Dunwell, 1986). Si embrago, los intentos de integrar
esta técnica con el mejoramiento practico se limitan a unos poquísimos cultivos
económicamente importantes, a saber, arroz, cebada, trigo, papa, tabaco, colza
oleaginosa, y maíz.
DESARROLLO DEL CULTIVO DE ANTERAS
Se desarrolla en dos etapas principales:
* Inducción de microcallos
* Regeneración de plantaas
INDUCCION DE MICROCALLOS
En una primera face del C.A. se induce la formación de microcallos colocando las anteras
en un medio cuya composición estimule selectivamente la división mitótica de las
microspóras , a expensas de las células somaticas en el filamento, el tejido conectivo y la
pared de la antera .El medio para inducir esa formación debe tener al tas concentraciones
de auxinas
El arroz, el estado de polen optimo para esa inducción es el comprendido entre el
unicleado tardio y binucleado temprano .
A los 20 dias de cultivo se forma una masa diferenciada de tejido llamada microcallo, el
cual contiene mas de 100 celulas por cada microspora involucrada en el proceso . el
microcallo alcanza un tamaño de 2 mm alrededor de los 30 o 50 dias.
Las anteras (órgano floral de las fanerógamas; se halla en la porción final de los
estambres y contiene el polen en unas cavidades denominadas sacos polínicos.)
contienen células sexuales masculinas haploides, el polen, los cuales cultivadas en un
medio apropiado, pueden regenerar plantas también haploides. Aún cuando durante la
evolución pudieron surgir especies haploides solamente entre organismos inferiores,
puede ser conveniente durante varias etapas del proceso de mejora disponer de plantas
haploides. Estas plantas, también llamadas haplontes, pueden ser obtenidas en diferentes
especies, directamente a partir de las células del polen.
Ventajas de los haploides
Pueden manifestarse fenotípicamente alelos recesivos que en este estado no
pueden ser encubiertos por los alelos dominantes, por esta razón las plantas
haploides pueden constituir un material útil para realizar estudios genéticos y
mutagénicos.
Cuando son diploidizados, se obtienen individuos totalmente homocigóticos, eso
brinda la posibilidad de la obtención de plantas homocigóticas en una sola
generación, a diferencia de los métodos tradicionales de autofecundación o
selección, que requieren mucho tiempo para ello y aún así es imposible alcanzar la
homocigosis total.
Constituyen un material que no induce poliploidía en experimentos de hibridación
somática (fusión de protoplastos).
Las dos primeras posibilidades son aprovechadas en la mejora práctica a partir de 1964,
donde se desarrolló por primera vez embriones directamente a partir de anteras, sin la
intervención del proceso de fecundación. Desde entonces el número de especies en las
que se ha podido obtener haploides mediante el cultivo de anteras se ha ampliado a unas
200. Es posible la obtención de haploides a partir de gametos femeninos en los ovarios,
pero como el número de los gametos masculinos en las anteras es considerablemente
mayor, se prefieren las anteras como material básico para la obtención de haploides
3. MATERIALES
I. Material vegetal:
a. Botones florales de Dianthus caryophyllus (clavel).
II. Medios de cultivo:
a. Medio de Murashige y Skoog, suplementado con ANA/ BAP : 15 / 1
III. Material de vidrio:
a. Beakers, 250 mL.
b. Matraz, 100 mL.
c. Tubo de ensayo.
IV. Insumos:
a. Agua destilada estéril.
V. Reactivos:
a. Agua destilada estéril.
b. Etanol (70%).
c. Hipoclorito de sodio (2.5%).
VI. Instrumentos:
a. Bisturíes.
b. Mechero Bunsen.
c. Pinzas.
VII. Otros:
a. Algodón. Ligas.
b. Papel secante estéril.
c. Plastic wrap.
VIII. Equipos:
a. Autoclave.
b. Cámara de flujo laminar.
c. Estufa.
4. METODOLOGÍA:
Se utilizará como explantes anteras procedentes de botones florales de Dianthus
caryophyllus (clavel)
Realizar la desinfestación del material vegetal, aislamiento de los explantes y su
respectiva inoculación.
5. PROCEDIMIENTO:
→ El material vegetal ha utilizarse son los botones de clavel que estén cerrados sin
flores ya que todavía no habido polinización y así podremos encontrar las anteras
estériles.
→ Los botones los desinfestaremos con etanol por 30¨ (segundos) y luego con lejía
por 3 ́ (minutos).
→ En la cámara de flujo laminar enjuagaremos tres veces el material vegetal con
agua estéril.
→ Luego realizaremos los cortes para facilitar la obtención de anteras.
→ Realizar un raspado para hacer caer las anteras en el medio de cultivo.
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Mediante esta técnica, las anteras inmaduras que contienen polen en una etapa especifica
de desarrollo se colocan en medios donde el polen inmadura se divide para formar
embriones o callos.
RESULTADOS:
MATERIAL VEGETAL CANTIDAD
Sanos y vigorosos 34 / 34
Necrosados 0 / 34
Contaminados 0 / 34
Hongos 0 / 34
Fenolizados 0 / 34
7. CONCLUSIONES
En el cultivo de anteras no todos lograron a formar callo de las 34 anteras solo 1
llegaron a salir callo debido al tiempo
8. CUESTIONARIO:
¿En que consiste la microesporogénesis y cuales son sus fases?
Si hacemos un corte transversal de una antera en desarrollo vemos cada un de los
cuatro lobulos o sacos polínicos ocupados por las células madres de la
microspora (Fig. A y B).
Mediante un proceso especial de division celular llamado meiosis, por medio del
cual s reduce en medio de cromosomas, cada celula madre de la microspora se
divide dos veces, dando origen a cuatro microsporas, cada una de las cuales
contiene el numero básico de cromosomas (1N) según la especie (Fig. C)
Cada microspora, después de una división de su nucleo, se dessarrolla hasta
convertirse en un grano de polen (Fig. D). inmediatamente antes de la dehiscencia
de las anteras, el nucleo del grano del polen se divide, generalente por la mitosis,
para formar dos nucleos conocidos uno como nucleo vegetativo y el otro como
nucleo generativo.
En esta etapa del desarrollo, la pared de la microspora se convierte en la
envoltura del grano del polen, antes de la dehiscencia, esta pared se engrosa y la
superficie externa toma una forma, tamaño y textura caracteristica de cada
especie.
El nucleo generativo se divide, según la especie, antes o despues de la
distribucion del polen , y da origen a dos gametas masculinas o nucleos
espermaticos. El proceso de formacion del polen se denomina microsporogenesis.
¿Cuál es la importancia del cultivo in vitro de anteras en el fitomejoramiento?
Mediante esta técnica, las anteras inmaduras que contienen polen en una etapa específica
de desarrollo se colocan en medios donde el polen inmaduro se divide para formar
embriones o callo. Transferidos éstos a medios de regeneración, se forman plantas. En la
mayoría de los casos se producen plantas haploides estériles, pero en algunas especies
ocurre una duplicación espontánea de los cromosomas en las etapas de desarrollo del
callo y de regeneración de la planta.
Desde que Guha y Maheshwari lo descubrieron en 1964, el cultivo de anteras se ha
extendido a más de 150 especies.
Condiciones que afectan el cultivo de anteras:
Genotipo de las plantas donantes.
El genotipo es quizás el factor más importante que afecta el cultivo de anteras. La
capacidad genotípica general para el cultivo de anteras, se han determinado, en la
cebada y en el trigo, rasgos heredados independientemente respecto a
componentes específicos de la androgénesis, como la inducción de callo y la
regeneración de plantitas.se demostró que ambos rasgos eran altamente
heredables, lo que sugería la posibilidad de obtener una ganancia rápida en la
selección.
Albinismo.
Aunque no se ha comprendido plenamente el fenómeno, hay pruebas de que el
albinismo está relacionado con la supresión del ADN de los plásmidos. Usar
plantas híbridas como donantes de anteras se considera un método práctico para
aumentar el número de plantas productoras de polen
Ilust rac ión 1 a lbin ismo en plan tas
Nombrar 4 especies que se obtienen mediante el cultivo in vitro de anteras. Definir la especie, características de la planta
donante, pretratamiento de las anteras, medio nutritivo utilizado, concentración de reguladores de crecimien to y las
condiciones de incubación de los cultivos.
especie
característic
as de la
planta
pre-tratamiento de las
anteras
medio de
cultivo
utilizado
concentración
de reguladores
condiciones
de
incubación
imagen
arroz
(Oryza
sativa L.)
semillas de
los
genotipos
‘Cimarrón’,
‘D-oryza’ y
‘D-sativa’
fueron
sembradas
y se
seleccionaro
n al azar de
tres a cuatro
flósculos por
cada
genotipo y
se procedió
a extraer las
anteras
Las panículas fueron cortadas
desde la base de la planta y
colocadas en bolsas plásticas,
para luego ser sometidas a un
tratamiento térmico de 4ºC
durante 7 d. Esto se realizó
con la finalidad de reducir el
número de microsporas
anormales y permitir la
liberación de sustancias
endógenas esenciales para la
androgénesis (
medio de
inducción
estuvo
compuesto
por las
sales de
Nistch
(Nistch y
Nistch,
1969),
tiamina-HCl
(2,5 mg/L),
acido nicotínico
(2,5 mg/L),
piridoxina-HCl
(2,5 mg/L),
glicina (2,5
mg/L), (2,4-D, 2
mg/L), picloram
(0,07 mg/L),
cinina (KIN, 0,5
mg/L), AgNO3
(10 mg/L) y
maltosa (50g/L).
El pH se ajustó
a 5,8.
condiciones
ambientales
fueron de
total
oscuridad
para la fase
de inducción,
con
temperatura
de 25 ± 2ºC
y humedad
relativa de
60-70%.
medio de
regeneraci
ón estuvo
constituido
por las
sales de
Murashige
y Skoog
(1962),
mio-inositol
(100 mg/L),
tiamina-HCl
(0,1 mg/L),
ácido nicotínico
(0,5 mg/L),
piridoxina-HCl
(0,5 mg/L),
glicina (2 mg/L),
(ANA, 1 mg/L),
cinina (4 mg/L)
y maltosa (30
trigo
las espigas
se
cosecharon
cuando los
ápices de
las
florecencias
alcanzaban
3 / 4 de la
distancia
existente
entre la
base de la
vaina de la
segunda
hoja
Frio:
Aplicado a las
espigas
después de
cosecharlas
Aplicadas una
vez sembradas
En el material
vegetal no
resibio
tratamiento de
frio se empleo
una
temperatura de
4° por 4 a 7
dias
N8
Serina, glicina,
glutamina y
mayor cantidad
de inositol
Cámara de
crecimiento
a 25°C, con
una
irradiación
de 50 µEm-
2/seg y con
un
fotoperiodo
de 16 hr de
luz y 8hr de
oscuridad
Presión osmótica:
Fue introducida a manitol
0,8 M por 1 hr antes de ser
sembradas (este tiene el
efecto de inducir a la celula
a producir un aminoácido,
que favorece la
embriogénesis)
Potato-2
10 % de
extracto de
papa junto con
los
micronutrientes
Luz:
Las espigas fueron
incubadas bajo la luz o en
completa oscuridad por 10
dias
MS
Mismos
nutrientes que
N8
Moraes-F
Mismos
nutrientes que
N8
cafe
Se
colectaron
botones
florales en
diferentes
estado de
desarrollo
se
sembraron 5
anteras por
plato
Choque térmico:
Los botones floreales fueron
sometidos a dos regímenes
de temperatura (5 y 28°C)
para tratar de inducir cambio
androgénico el tiempo fue de
2, 4 y 8 dias. Medio
murashige
y skoog
(MS) y
medio
Gamborg
(B-5)
Concentracione
s de
citoquininas y
auxinas
Se colocaron
en una
cámara de
crecimiento
en completa
oscuridad y
temperatura
de 28°C ±
2°C
Choque térmico y
centrifugación:
De 5°C durante dos timpos
de exposición y a tres
tiempos de de centrifugación
(3,000 rpm)
Choque osmótico:
30 anteras en dos
concentraciondes de
sacarosa 20 y 40 %
ESPÁRRAGO
(Asparagus officinalis
L.)
Anteras con
un tamaño
de 1,5 a 2
mm
(coincidente
con el
estado
uninucleado
de las
microsporas
) y se
mantuvieron
en heladera
durante 24
horas a 4°C.
inmersión en etanol al 70 %
seguido por 5 minutos en
una solución de hipoclorito
de sodio al 3 % de cloro
activo con posteriores
lavados de agua bidestilada
estéril.
medio
Murashige
y Skoog
(1962)
(MS)
2 mg.l-1 de
ácido naftalen-
acético (ANA)
y 1 mg.l-1 de
bencilaminopuri
na (BAP). El
pH del medio
fue ajustado a
5,9.
oscuridad
durante 6-8
semanas y a
una
temperatura
de 28±2°C
transfiriéndo
se a
cámaras con
una
temperatura
de 25±2°C y
un
fotoperíodo
16 hs hasta
la aparición
de callos
con una
intensidad
lumínica de
50 µE.m-
2.s-1.
9. BIBLIOGRAFÍA
OBTENCIÓN DE PLANTAS A PARTIR DE ANTERAS DE ESPÁRRAGO (Asparagus officinalis L.)- MUÑOZ, Sebastián1;
ESPÓSITO, María Andrea1; CRAVERO, Vanina1; GARCÍA, Stella2; LÓPEZ ANIDO, Fernando1; COINTRY, Enrique1.
http://www.fcagr.unr.edu.ar/Investigacion/revista/rev9/3.htm
