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Universidad de Sonora

Departamento de Agricultura y Ganadería

Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica General

Ingeniero Agrónomo

Hermosillo, Sonora. Agosto 2007

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Tabla de Contenido PRÁCTICA 1: REACCIONES CARACTERISTICAS PARA IDENT IFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS 3 PRACTICA 2: ESTUDIO DE ALGUNAS PROPIEDADES DEL ALMIDÓN 11 PRACTICA 3: ESTUDIO DE ALGUNAS PROPIEDADES DE LOS LÍPIDOS 20 PRÁCTICA 4: OBTENCION DE LECITINA Y COLESTEROL A PARTIR DE LA YEMA DEL HUEVO 22 PRACTICA 5: REACCIONES DE COLOR PARA AMINOÁCIDO S 29 LECTURAS EXPERIMENTO 5 36 PRACTICA 6: PRECIPITACION DE PROTEÍNAS 38 PRACTICA 7: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ACI DOS NUCLEICOS 46 PRÁCTICA 8: ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA SOBRE L A LECHE HOMOGENIZADA 54 PRÁCTICA 9: HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE PROTEINAS POR LA ACCIÓN DE LA TRIPSINA 57 PRACTICA 10: PRESENCIA DEL ÁCIDO CÍTRICO Y TARTÁRIC O EN TEJIDOS VEGETALES 61 PRÁCTICA 11: PRODUCCIÓN DE ALMIDÓN DURANTE LA FOTOS ÍNTESIS 62

1.

Metodología de trabajo

El manual de prácticas de laboratorio de Bioquímica General para estudiantes de la carrera de Ingeniero Agrónomo ha sido elaborado tomando en su mayor parte prácticas de los manuales elaborados por los maestros Q. F. B. Eva Irma Vejar Rivera y M. C Jesús Rubén Gracilazo Pérez, fundadores del Departamento de Químico-Biológicas. Consta de 11 prácticas que se contempla realizar en 13 sesiones de laboratorio. Dado que el semestre consta de 16 semanas de actividades, deberán realizarse todas en tiempo y forma y sobrará tiempo para aplicar una evaluación general y resolver cualquier duda. Si se realiza a conciencia cada una de ellas demostrarás los principios establecidos en la clase teórica, aumentarás tu capacidad de observación y adquirirás destrezas manuales con lo que tendrás una base sólida para continuar con materias como Fisiología Vegetal, Nutrición Animal, Poscosecha de productos hortícolas y en general podrás comprender el comportamiento de cualquier ser vivo, incluido tu mismo. Para todas las sesiones de laboratorio los estudiantes deberán leer con anticipación la práctica y elaborar un diagrama de flujo que incluya principalmente dibujos y evite el uso de textos donde plasmarás el procedimiento paso por paso, este diagrama será revisado al entrar al laboratorio, si lo haces con cuidado te permitirá distribuir rápidamente el trabajo entre los integrantes del equipo, realizar el experimento sin demora, y salir a tiempo para que no te deje el camión. Al final de cada práctica se revisará tu desempeño mediante la revisión de la siguiente lista de cotejo: Si No ¿Asististe puntualmente?

¿Elaboraste anticipadamente un diagrama de flujo de la práctica a realizar para saber que vas a hacer antes de empezar?

¿Trajiste el material necesario indicado para realizar la práctica?

¿Usaste bata de laboratorio blanca, limpia de algodón durante la práctica?

¿Preparaste los reactivos de forma anticipada?

¿Limpiaste el equipo, material y área de trabajo una vez realizada la práctica?

¿Dispusiste los desechos en forma adecuada?

¿Entregaste el reporte de la práctica anterior?

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El Reporte a elaborar deberá ser escrito en una libreta sin resorte. Esta libreta de laboratorio debe: � Especificar lo qué se hizo � Detallar lo que se observó � Ser comprensible para cualquier persona.

Deberán incluir los siguientes datos: • Datos personales: Nombre y grupo del alumno * • Nombre, número y fecha de realización de la práctica. * • Objetivo * • Listado de materiales y reactivos * • Diagrama de flujo c/ fecha de revisado * • Observaciones y Resultados con el formato incluido en el manual • Discusiones y Conclusiones donde des una breve, pero crítica evaluación de tus resultados, así como

del éxito o no del experimento. • Preguntas correctamente contestadas * • Bibliografía de consulta * • Comentarios personales • Tabla de constantes físicas y datos de seguridad de los compuestos químicos utilizados y obtenidos.

Estos deberán incluir entre otros, los daños a la salud y al ambiente, precauciones durante su manejo, así como la disposición final de los residuos.

*Son aspectos que puedes realizar antes de realizar la práctica para que no se te acumule el trabajo � Prepare el cuaderno para recibir datos numéricos � Habitúese a escribir frases completas

• El desempeño en el laboratorio de cada una de la sesiones será evaluado de la siguiente manera

Lista de cotejo completa = 50%

Reporte elaborado en tiempo y forma = 50 %

• Para aprobar el laboratorio el alumno deberá aprobar al menos el 80 % de las prácticas realizadas

• Se requiere calificación aprobatoria en el laboratorio para poder considerar la calificación de teoría.

• La reprobación del laboratorio no da derecho a examen de regularización de la materia.

• Tres faltas en el laboratorio ocasionan la reprobación del mismo.

Te deseo éxito en tus estudios y en todos los aspectos de tu vida. No dudes en acercarte a resolver cualquier

duda sobre la materia. Mi correo electrónico es merenteria@guayacan.uson.mx.

M. C. Ma. Eugenia Rentería Martínez

PRÁCTICA 1: REACCIONES CARACTERISTICAS PARA IDENT IFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS

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Las reacciones que se practicarán en esta sesión son las siguientes. . Reacción de Fehling: identifica Carbohidratos reductores en general . Reacción de Barfoed: puede distinguir entre mono y disacáridos. . Reacción de Seliwanoff: identifica carbohidratos cetohexosas. . Reacción de Bial: identifica carbohidratos aldopentosas. Es responsabilidad del alumno el consultar los libros de texto para conocer los fundamentos científicos de cada una de las reacciones arriba mencionadas, antes de hacer la práctica. Al final de la práctica, deberá escribir un breve resumen del fundamento de las reacciones. Y en la hoja de Datos Experimentales Obtenidos deberá anotar todas sus observaciones y resultados. Esto se hará en todas las sesiones de laboratorio. MATERIAL NECESARIO: 1 Gradilla 1 Vaso de precipitados de 100 ml. 2 Pipetas de 5 ml. 1 Pinzas para tubos de ensaye 2 Pipetas de 1 ml. 10 Tubos de ensaye de 15 x 150 Mechero, tripie y tela de asbestos 6 Tubos de ensaye de 13 x 100 1 Vaso de precipitados de 600 ml.

P R O C E D I M I E N T O. REACCION DE FEHLING Con el vaso de precipitados de 600 ml., tripie y tela de asbestos, instale un baño de agua, y prenda su mechero para calentar el agua hasta ebullición. Utilice agua destilada para que no se incrusten sales en el vaso de precipitados. El agua no debe rebasar la mitad del vaso de precipitados puesto que ahí va a colocar los tubos y el agua se derramaría 1. Coloque en su gradilla 5 tubos de ensaye de 18 x 150 y numérelos. 2. Pipetee los carbohidratos de la siguiente manera: 5.0 ml. de Glucosa al tubo 1 5.0 ml. de Fructosa al tubo 2 5.0 ml. de Sacarosa al tubo 3 5.0 ml. de Lactosa al tubo 4 5.0 ml. de Maltosa al tubo 5 Para hacer eso utilice una de las pipetas de 5 ml. Tenga junto el vaso de precipitados de 100 ml. con agua destilada, enjuague la pipeta dos veces después de haber pipeteado los carbohidratos. 3. Utilizando la segunda pipeta de 5 ml. agregue 5.0 ml. del reactivo de Fehling, ya preparado, a cada uno de

los cinco tubos. Enjuague inmediatamente la pipeta. 4. Cuando el agua del baño esté hirviendo, coloque los cinco tubos al mismo tiempo, dentro del vaso, todos al

mismo tiempo y anote el tiempo.

Revisión de Conceptos

. Definición de Carbohidratos . Monosacárido, Polisacárido . Aldosas, Cetosas.

. Clasificación completa.

El alumno debe de estar seguro de que tiene claros los conceptos y que recuerda los ejemplos concretos de cada una de las categorías de la clasificación de los Carbohidratos.

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5. Una vez que aparezca el precipitado característico de color rojo ladrillo, en la mayoría de los tubos (toma de

uno a tres minutos) saque del baño todos los tubos con ayuda de las pinzas y colóquelos en la gradilla. Si algún tubo no ha dado el precipitado después de cinco minutos quiere decir que la reacción con el carbohidrato de ese tubo es negativa.

6. Anote sus resultados en la ‘Hoja de Datos’. Los tubos con reacción positiva serán los que contienen 7. Lave inmediatamente los tubos donde hubo precipitado o las manchas no se podrán quitar. REACCIÓN DE BARFOED (Pronuncie Barfed) 1. Repita los pasos dos y tres de la reacción anterior. No use los mismos tubos aunque ya estén lavados. 2. Agregue 5.0 ml. del reactivo de Barfoed ya preparado, a cada uno de los cinco tubos. 3. Coloque los cinco tubos al mismo tiempo en el agua hirviendo y anote el tiempo. 4. Espere hasta 10 minutos, observando cuidadosamente la aparición de precipitados. El precipitado va a ser

un poco menos grueso que en la reacción anterior. Anote los tiempos de aparición del precipitado. Los tubos positivos para la prueba en unos tres minutos serán los que contienen carbohidratos monosacáridos. Los tubos positivos en cinco o más minutos serán los que contienen carbohidratos

5. Como opción para ver la utilidad de esta prueba, coloque una mezcla de Glucosa y Lactosa en un tubo de

ensaye, agregue el reactivo de Barfoed y llévelo al agua hirviendo. En cuanto aparezca el primer precipitado, saque el tubo y filtre. El filtrado vuélvalo a colocar en agua hirviendo por unos diez minutos más o hasta que aparezca un nuevo precipitado. De acuerdo a los resultados verá que esta reacción puede detectar monosacáridos y disacáridos en mezcla.

REACCION DE SELIWANOFF (Pronuncie Selivanof). 1. Coloque en su gradilla tres tubos de ensaye y numérelos. 2. Pipetee 1.0 ml. de Xilosa al tubo 1; 1.0 ml. de Glucosa al tubo 2 y 1.0 ml de Fructosa al tubo 3. Recuerde que la reacción identifica Sabemos que de las muestras que tenemos para esta práctica solamente una contiene Cetohexosa por lo que basta probar esa muestra y otras dos como controles negativos. 3. Agregue 5.0 ml. del Reactivo de Seliwanoff, ya preparado a cada uno de los tres tubos. 4. Coloque los tres tubos al mismo tiempo en el baño de agua hirviendo. 5. Observe la aparición del color y el tiempo. Aquellos tubos que sean positivos serán los que contienen

Cetohexosas. 6. Anote sus resultados en la hoja de datos.

CETOHEXOSAS

DISACARIDOS

CARBOHIDR ATOS REDUCTORES

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REACCIÓN DE BIAL. 1. Coloque en su gradilla tres tubos de ensaye y numérelos. 2. Pipetee 0.5 ml. de Xilosa en el tubo 1; 0.5 ml. de Glucosa en el tubo 2 ; y 0.5ml. de Fructosa en el tubo 3. 3. Agregue 5.0 ml. del reactivo de Bial, ya preparado a cada uno de los tres tubos. 4. Coloque los tres tubos al mismo tiempo en el baño de agua hirviendo 5. Observe la aparición de color y el tiempo de aparición. 6. Anote sus resultados en la hoja de datos. Aquella muestra que haya dado la reacción positiva será la que

contenga carbohidrato

PREPARACIÓN DE REACTIVOS. Reactivo de Fehling (1 litro) Solución A: Disolver 34.65 gr. de Sulfato Cúprico Pentahidratado en Suficiente agua destilada para hacer 500 ml. Solución B: Disolver 178.gr. de Tartrato doble de Sodio y Potasio y 50 Gr. de Hidróxido de Sodio, en suficiente agua destilada para hacer 500 ml. Antes de usarse, mezcle las soluciones A y B en partes iguales, de acuerdo con la cantidad que se vaya a usar. LA MEZCLA ES INESTABLE, pero las soluciones individuales son estables, así que no mezcle más de lo que va a usar cada día. Reactivo de Barfoed (1 litro) Disolver 66.5 gr. de Acetato cúprico en poco menos de un litro de agua Destilada. Filtrar a través de papel filtro Whatman 1. Agregar 24.8 ml. de Acido Acético al 38 % (Aforar 9.0 ml. de Acido Acético Glacial a 25 ml. con agua destilada. Aforar a 1 litro. Reactivo de Seliwanoff (500 ml.) Disolver 250 miligramos de Resorcinol en un poco de agua destilada y Aforar a 50 ml. (Solución al 0.5 %). Agregar 170 ml. de Acido Clorhídrico concentrado Aforar a 500 ml. con agua destilada. (mucho cuidado al agregar el Agua al ácido). Reactivo de Bial (180 ml.)

PENTOSA

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Disolver 60 miligramos de Orcinol en 20 ml. de agua destilada Agregar 100 ml. de Acido Clorhídrico concentrado. Añadir 12 miligramos de Cloruro Férrico (unos cuantos granitos) Aforar a 180 ml. con agua destilada. Muestras de Soluciones de Carbohidratos. Todas a concentración 0.1 M. ♦ Xilosa (o Arabinosa) (50 ml.) Pesar 750 miligramos de Xilosa

Disolver en suficiente agua destilada para hacer 50 ml. (Si es necesario Se diluye 1:10

♦ Glucosa (300 ml.) Pesar 5.4 gramos de Glucosa Agregarlos lentamente y con agitación constante a 250 ml de Agua Destilada. Aforar a 300 ml. ♦ Fructosa (300 ml.) Pesar 5.4 gramos de Fructosa Disolver en agua destilada y Aforar a 300 ml. ♦ Sacarosa (300 ml.) Pesar 10.8 gramos de Sacarosa. Disolver en agua destilada y aforar a 300 ml. ♦♦♦♦ Maltosa (300 ml.) Pesar 10.8 gramos de Maltosa. Disolver en agua destilada y aforar a 300 ml. ♦ Lactosa (300 ml.) Pesar 10.8 gramos de Lactosa . Disolver en agua destilada y aforar a 300 ml.

DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS

EXPERIMENTO 1

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Reacción de Fehling Tubo No. Carbohidrato Precipitado Tiempo (+) o (-) 1 ___________ _________ ________ 2 ____________ _________ ________ 3 ____________ _________ ________ 4 ____________ _________ ________ 5 ____________ _________ ________ Reacción de Barfoed Tubo No. Carbohidrato Precipitado Tiempo 1 ____________ _________ _______ 2 ____________ _________ _______ 3 ____________ _________ _______ 4 ____________ _________ _______ 5 ____________ _________ _______ Reacción de Seliwanoff Tubo No. Carbohidrato Color Tiempo 1 ____________ __________ ________ 2 ____________ __________ ________ 3 ____________ __________ ________ Reacción de Bial Tubo No. Carbohidrato Color Tiempo 1 ___________ _______ _______ 2 ___________ ________ _______ 3 ___________ ________ _______

FUNDAMENTO DE LAS REACCIONES Escriba brevemente el fundamento de las reacciones practicadas. Si es necesario consulte el libro de texto o alguna otra bibliografía. Reacción de Fehling: Reacción de Barfoed: Reacción de Seliwanoff: Reacción de Bial: CUESTIONARIO 1. Dibuje un modelo de pared celular vegetal donde muestre los polisacáridos que la forman. 2. Establezca las diferencias estructurales y funcionales entre pared celular y membrana celular 3. Investigue cómo cambia la composición de carbohidratos de la pared celular en mango y calabaza a

medida que estos van madurando.

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4. Mencione los carbohidratos que contienen las uvas y los melones y como se cuantifica el contenido de éstos?

5. ¿Cuál es la diferencia entre el reactivo de Fehling y el de Barfoed en cuanto a composición y en cuanto a su

capacidad de reconocer carbohidratos? 6. Cómo se realiza el proceso de digestión de pastos en el aparato digestivo de los rumiantes? 7. Por qué los humanos no nos podemos alimentar de pastos o zacates?

LECTURAS EXPERIMENTO 1

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Las siguientes lecturas están diseñadas para que los alumnos puedan fácilmente consultar todos los datos necesarios para entender los ejercicios que practiquen en el laboratorio. Por eso también están divididas de acuerdo a los mismos ejercicios.

Los carbohidratos son Polihidroxialdehidos o Polihidroxicetonas, y sus derivados, o compuestos que puedan hidrolizarse a estos. Los más sencillos son los Monosacáridos que pueden ser Aldosas o Cetosas según que contengan la función aldehido o cetona en sus moléculas. Según el número de carbonos serán tri osas, tetr osas, pent osas, hexosas y hept osas. Correspondientemente habrá Aldotriosas, Aldotetrosa Aldopentosas y Aldohexosas; o Cetotriosa, Cetotetrosas, Cetopentosas y Cetohexosas. Si la molécula consta de unos pocos monómenos unidos en Unión Glucosídica , entonces será un Oligosacárido. Disacárido, tri sacárido, tetra sacárido… Si la molécula cuenta con cientos o miles de monosacáridos unidos en unión glucosídica entonces tendremos a los Polisacáridos. Los Homo polisacáridos constarán de un solo monómero repetitivo. Los Hetero polisacáridos, constarán de dos o, en contadas ocasiones, más monómeros distintos en su molécula. Carbohidratos Reductores son aquellos carbohidratos (fundamentalmente Monosacáridos y Oligosacáridos), que tienen su grupo funcional aldehido o cetona libre o potencialmente libre. Libre si la molécula existe en forma abierta, potencialmente libre si la molécula existe en forma cíclica. Todos los monosacáridos, aun si existen en forma cíclica, son reductores. Los disacáridos que tengan el hidroxilo del Carbono Anomérico de alguno de los dos monómeros libre, también serán reductores, aunque más lentamente, por ejemplo la Maltosa y la Lactosa. Pero aquellos que estén unidos por sus dos carbonos anoméricos, como la Sacarosa, no serán reductores, a menos que se hidrolice la unión y queden libres los monómeros. A medida que el número de monómeros aumenta, las características reductoras se van haciendo más y más leves. De ahí que los polisacáridos, a pesar de tener su último monómero, con carbono anomérico, potencialmente libre, en la práctica nunca son reductores. Pero si los polisacáridos se hidrolizan, entonces sí mostrarán las características reductoras de sus monómeros constituyentes. Reacción de Fehling Esta reacción identifica a carbohidratos reductore s en general. Cuando se calienta un carbohidrato reductor en una solución alcalina de cobre, se inestabiliza la doble ligadura, por lo que cambia constantemente de posición, dando origen a los compuestos llamados Enedioles . Los enedioles en algún momento se rompen por la doble ligadura, dando fragmentos de gran potencia reductora. Los fragmentos reductores, en presencia de iones cúpricos, se convierten en fragmentos ácidos, a la vez que los iones cúpricos pasan a cuprosos. Los iones cuprosos entonces se combinan con los hidroxilos de la solución para formar hidróxido cuproso de color amarillo El hidróxido cuproso con el calor se convierte a Oxido cuproso que precipita dando un color rojo ladrillo característico. Esto es lo que identifica a un carbohidrato como reductor. Reacción de Barfoed

Esta reacción identifica carbohidratos reductores y puede disting uir entre Monosacáridos y Disacáridos. La reacción utiliza un reactivo oxidante más débil, por lo que las condiciones de la reacción son más bien ácidas que alcalinas. Es una reacción un poco más lenta que la de Fehling. El reactivo es Acetato Cúprico en Acido Acético diluido.

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El carbohidrato reductor, al contacto con el reactivo da el característico precipitado de color rojo ladrillo. Los monosacáridos reductores dan la reacción positiva en poco tiempo (de dos a cinco minutos), mientras que los disacáridos reductores la dan positiva pero más lentamente (de cinco a diez minutos).

En una mezcla de monosacáridos y disacáridos reductores, bastará filtrar el primer precipitado que aparezca, que corresponderá al monosacárido, y esperar la formación de un nuevo precipitado, que si existe, corresponderá al disacárido.

Reacción de Seliwanoff

Esta reacción identifica carbohidratos Cetohexosas. Al reaccionar una cetohexosa , (fructosa es la más común), con ácido clorhídrico, el carbohidrato pierde moléculas de agua, dando como resultado el 5-hidroximetilfurfural. Esta molécula reacciona con el Resorcinol dando un complejo rojo intenso, que será signo de la presencia de la cetohexosa. No es precipitado, sino complejo.

La reacción es muy rápida en cuanto a la formación del complejo. Lo que varía en cuanto a tiempo es la formación del 5-hidroximetilfurfural. Las cetohexosas lo dan rápidamente, mientras que las aldohexosas lo dan lenta y débilmente, por lo que esta reacción se considera más bien característica para identificación de cetohexosas, y en concreto de Fructosa

Reacción de Bial

Identifica carbohidratos Aldopentosas. Al reaccionar una aldopentosa con Acido Clorhídrico, pierde moléculas de agua y produce la sustancia conocida con el nombre de furfural . El furfural puede reaccionar en medio ácido con el orcinol . Si en estas condiciones se agrega una pequeña cantidad de cloruro férrico, se formará un complejo verde .

Las cetopentosas en estas condiciones dan un complejo de color rojo. Las cetohexosas y las metilpentosas dan un complejo naranja, que al reposar producen un precipitado de color verde oscuro. Las triosas y los ácidos 5-cetoaldónicos dan positiva la reacción, así como los ácidos urónicos, por lo que hay que tener cuidado de que en la mezcla de reacción no existan estos compuestos si es que se quiere demostrar la presencia de las aldopentosas.

Esta reacción se utiliza para identificar a los Acidos Ribonucleicos , puesto que las condiciones ácidas hidrolizan al ácido nucleico y las ribosas libres darán positiva la reacción.

La presencia de hexosas no interfiere con la reacción, siempre que no haya calentamiento prolongado, en cuyo caso las hexosas interferirán con la producción de un precipitado rojo.

PRACTICA 2: ESTUDIO DE ALGUNAS PROPIEDADES DEL ALMIDÓN

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Las manipulaciones que se practicarán aquí son las siguientes: . Obtención del Almidón en granos . Observación de granos de almidón al microscopio . Determinación de la temperatura de Gelatinización del Almidón . Observación de la reversibilidad del complejo Yodo-Almidón. . Hidrólisis ácida del almidón. Es responsabilidad del alumno consultar los libros de texto para conocer los fundamentos de cada una de las manipulaciones que se practicarán aquí. En la hoja de datos deberá mencionar esos fundamentos.

MATERIAL NECESARIO Vaso de precipitados de 600 ml. Gradilla Vaso de precipitados de 250 ml. Mechero, tripie y tela de asbestos Vaso de precipitados de 50 ml. Vidrio de reloj mediano Pipeta de 5 ml. Termómetro 10 tubos de ensaye de 13 x 100 Portaobjetos y cubreobjetos Placa excavada de porcelana Agitador. Escobetilla Además: Cada grupo de trabajo será responsable de traer al laboratorio por su cuenta, lo siguiente: Una papa de tamaño mediano Una navaja o pelador de papa Un rayador de queso Un pañuelo limpio de tejido no muy cerrado.

P R O C E D I M I E N T O

OBTENCIÓN DEL ALMIDÓN:

Revisión de conceptos.

. Polisacárido

. Celulosa y Almidón

. Glucógeno

. Amilosa y Amilopectina

. Gelatinización

. Complejo Yodo-Almidón

El alumno debe estar seguro de entender las distintas formas de uniones glucosídicas en los Polisacáridos.

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1. Pele una papa de tamaño mediano y ráyela con un rayador de queso de manera que la pulpa fina que se obtenga caiga en el vaso de precipitados de 600 ml. (Esto debe hacerse lo más rápidamente posible para evitar las reacciones de oscurecimiento).

2. Agregue agua destilada a la pulpa, más o menos el doble de su volumen y agite fuertemente por unos

minutos. 3. Con gaza doble, que puede proporcionar el laboratorio o con un pañuelo de tejido no muy cerrado filtre,

apretando si es necesario, hacia el vaso de precipitados de 250 ml. La parte gruesa que queda en el filtro, y que es fundamentalmente celulosa, se descarta.

4. Deje unos minutos a que el filtrado se asiente. Una vez asentado descarte el agua sobrenadante y lave el

almidón agregando nuevamente suficiente cantidad de agua destilada y agitando por unos minutos. Se deja asentar. La operación se puede repetir una vez más para obtener un almidón limpio.

5. Decante finalmente lo más posible de agua y extienda el Almidón en un vidrio de reloj mediano, y llévelo a

la estufa a 60 ° C. Mientras este almidón se seca, proceda a las siguientes manipulaciones, con el almidón que le proporcione el Instructor del Laboratorio.

6. Una vez seca el almidón pulverícelo lo mejor posible y guárdelo en donde su instructor le indique. Lo que se ha obtenido en esta parte de la práctica son los:

OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO 1. Con en almidón que le proporcione su Instructor y utilizando su vaso de precipitados de 50 ml. haga una

suspensión de Almidón de aproximadamente el 2 % en agua destilada. (Serían más o menos 0.5 gr. en 25 ml. de agua.

2. Coloque su tripie, tela de asbestos y mechero y encienda el mechero. 3. Coloque sobre la tela de asbestos su suspensión de almidón para calentarla UN POCO, teniendo cuidado

de que no llegue a ebullición. 4. Con el agitador tome una gota de la suspensión y colóquela en el centro de un portaobjetos y añada una

gota de Lugol. 5. Ponga el cubreobjetos sobre la preparación y presione ligeramente para eliminar el exceso de agua. Seque

los bordes con un poco de papel filtro. 6. Observe la preparación al microscopio con el objetivo seco débil. Si es posible dibuje algunos de los granos

que observe. En esta forma se puede llegar a observar las: TEMPERATURA DE GELATINIZACIÓN

GRANOS DE ALMIDÓN

CAPAS CONCÉNTRICAS DE LOS GRANOS DE ALMIDÓN.

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1. Con el almidón proporcionado por su Instructor haga una suspensión de Almidón al 5 % (1 gramo en 20 ml.

de agua destilada), en su vaso de precipitados de 50 ml.

2. Con su tripie, tela de asbestos y vaso de precipitados de 600 ml. instale un baño de agua, sin llenar completamente el vaso de precipitados con el agua.

3. Con ayuda de una pinza para tubos de ensaye , cuando el agua del baño esté hirviendo, sostenga su vaso de precipitados con la solución de almidón, dentro del agua a ebullición.

4. Agite constantemente e introduzca un termómetro a la suspensión de almidón.

5. Cuando la suspensión cambie de aspecto, del normal a un aspecto gelatinoso, haga la lectura de la temperatura.

6. Anote sus resultado en la hoja de datos, esa será la:

COMPLEJO YODO-ALMIDÓN 1. Pipetee 5.0 ml. de la solución de Almidón soluble al 1 % (preparada de antemano por el Instructor), a un

tubo de ensaye de 13 x 100. 2. Agregue 3 gotas de solución de Yodo 0.1 N. Si el color del complejo es tenue, agregue una gota más. El

color del complejo debe ser de un morado oscuro. 3. Prenda el mechero. Tome el tubo de ensaye con pinzas y páselo lenta y repetidamente sobre la llama,

teniendo cuidado de que la boca del tubo apunte hacia donde no haya nadie, porque el contenido caliente del tubo puede en algún momento saltar.

4. Anote el tiempo requerido para la desaparición TOTAL del color. 5. Lleve entonces el tubo de ensaye al agua corriente de la llave y anote el tiempo requerido para que

aparezca nuevamente el color. 6. Anote sus resultados en la Hoja de datos. Lo que se acaba de observar es la: HIDRÓLISIS ACIDA DEL ALMIDÓN. 1. Coloque en su gradilla 10 tubos de ensaye de 13 x 100 y numérelos. 2. De alguna manera también identifique 10 pozos de una placa excavada de porcelana.

Temperatura de Gelatinización del Almidón.

Reversibilidad del complejo Yodo-Almidón.

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3. En un vaso de precipitados de 50 ml. coloque 25 ml. de una solución de almidón al 1 % ya preparada de

antemano por el Instructor. 4. Añada 10 gotas de Acido Clorhídrico concentrado y agite suavemente. 5. Con una pipeta tome un poco de esa solución y coloque una gota de ella en el pozo número 1 de la placa

excavada y tres gotas en el tubo número 1 de la gradilla. Enjuague su pipeta con agua destilada. 6. Encienda el mechero y coloque el vaso de precipitados con la solución sobre la tela de asbestos para

calentarla hasta que hierva. El hervor debe ser suave. Si es necesario baje de intensidad la llama del mechero.

7. A la gota que puso en el pozo 1, agréguele una gota de solución de yodo. Se debe observar el color azul

característico de la reacción positiva del yodo con el almidón. 8. Anote el tiempo en que la solución comienza a hervir. En ese momento tome con su pipeta otro poco de la

solución y coloque una gota en el pozo número 2 y tres gotas en el tubo número 2. Enjuague la pipeta. 9. Agregue inmediatamente una gota de solución de yodo al pozo número 2, y observe si la reacción del

complejo yodo-almidón comienza a hacerse débil o negativa. 10. A los dos minutos exactos de haber comenzado a hervir la solución repita la operación tomando un poco y

dejando una gota en el pozo 3 y tres gotas en el tubo 3. Agregue solución de yodo al pozo 3 y enjuague la pipeta.

11. Esta operación se repite cada dos minutos hasta que la reacción yodo-Almidón sea negativa, es decir que

dé un color café característico del yodo y no el azul de complejo yodo-almidón. En ese momento se termina el calentamiento de la solución.

12. Agregue 3 mililitros de la solución de Fehling a todos los tubos que recibieron gotas de la solución. 13. Con su vaso de precipitados, y usando agua destilada, prepare un baño de agua hirviendo. Cuando el agua

esté hiriviendo, coloque en él todos los tubos, procurando que no se derrame agua, para lo cual desde el principio llene el vaso solamente hasta un poco más de la mitad.

14. Espere cinco minutos. Saque todos los tubos y colóquelos en su gradilla de acuerdo a su numeración.

Observe el grado de reducción por la cantidad de precipitado de Oxido Cuproso de color rojo ladrillo en cada tubo.

15. Anote sus resultados en la Hoja de datos. Acaba de hacer una: PREPARACION DE REACTIVOS.

Solución de Lugol:( 100 ml.) Pesar 0.5 gramos de Yodo y 2.0 gramos de Ioduro de Potasio.

HIDRÓLISIS ÁCIDA DEL ALMIDÓN

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Disolver el yodo en un poco de alcohol etílico, agregar el yoduro de

potasio y aforar a 100 ml. con agua destilada.

Solución de Yodo (100 ml.) Pesar 1.27 gramos de Yodo. Disolverlos en un poco de alcohol y aforar a 100 ml. con agua destilada Solución de Almidón al 1 % (1 litro) Pesar 10 gramos de Almidón Soluble. Agregar suficiente agua fría para hacer una pasta. Agregar agua hirviendo para disolver la pasta y Aforar a 1 litro con agua destilada. No debe quedar muy turbio. Reactivo de Fehling: ( Checar práctica anterior para su preparación) Acido Clorhídrico Concentrado.

DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS

EXPERIMENTO 2

Obtención del Almidón

Peso en gramos del almidón que obtuvo _____________________

Observación al Microscopio

Objetivo utilizado __________________________

Forma de granos observada (Haga un dibujo)

Temperatura de Gelatinización

Tiempo requerido para la gelatinización_________________

Temperatura a la cual gelatinizó ______________________

Complejo Iodo-Almidón

Tiempo empleado para decolorar la solución ______________

Tiempo empleado para volver a colorear _________________

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Hidrólisis ácida del almidón

Pozo No. Color del complejo Tubo No. Precipitado

(+) o (-) (+) o (-) 1 _________ 1 ________ 2 _________ 2 ________ 3 _________ 3 ________ 4 _________ 4 ________ 5 _________ 5 ________ 6 _________ 6 ________ 7 _________ 7 ________ 8 _________ 8 ________ 9 _________ 9 ________ 10 _________ 10 ________

FUNDAMENTO DE LOS PROCEDIMIENTOS

Escriba brevemente el fundamento científico de cada uno de los procedimientos efectuados en esta práctica. Si es necesario consulte el libro de texto. Obtención de los granos de almidón: Observación al microscopio: Determinación de la temperatura de Gelatinización: Reversibilidad del complejo Iodo-Almidón: Hidrólisis ácida del Almidón. CUESTIONARIO 1. ¿Se podría determinar la presencia de Glucosa y Almidón que estuviesen mezclados en el mismo tubo de

ensaye? ¿Cómo?

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2. ¿En qué condiciones el almidón daría la prueba de Fehling positiva y en qué condiciones daría la prueba de Seliwanoff positiva? 3. ¿Para qué se agrega solución de Lugol a la preparación del almidón cuando se va a observar al microscopio? 4. ¿Qué otras maneras hay de hidrolizar al Almidón? Explique con detalle y con precisión. 5.¿Qué tipo de hidrólisis de almidón llevamos a cabo en el sistema digestivo cuando comemos alimentos con almidón? Explique detalladamente. 7. Como se elabora el almidón en las plantas? 8. Anote las diferencias estructurales y funcionales entre el almidón y el glucógeno

LECTURAS

EXPERIMENTO 2

Los Polisacáridos son polímeros de carbohidratos sencillos unidos entre sí por uniones glucosídicas. Normalmente contienen un gran número de monómeros, que pueden ser de un tipo, o de dos o más tipos

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distintos unidos siempre en forma alternada. Por lo general la molécula tiene un solo término reductor y muchos términos no reductores, por lo que en sí la molécula no muestra las características reductoras. Las uniones glucosídicas pueden hidrolizarse sea con ácido mineral o con enzimas.

Entre los homopolisacáridos importantes existen dos, que pertenecen a los vegetales, la celulosa y el almidón, y uno que es característico de los animales, el glucógeno . Los almidones se presentan como reserva de carbohidratos en tubérculos tales como la papa, en los granos de semillas, en las frutas y en los rizomas de las plantas. El almidón se concentra en unas formaciones llamadas granos , que pueden ser esféricos u ovalados, en forma de lente o en forma irregular. El almidón puede estar organizado en capas concéntricas en los granos, lo que es muy común en los almidones de los cereales, o en capas excéntricas como en el almidón de la papa. En ocasiones es difícil observar estas capas, pero si los granos de almidón se sujetan a un ligero calentamiento, se facilita un tanto la observación de estas capas al microscopio. La forma de los granos es una característica específica de los distintos almidones. El almidón en los granos contiene de 14 a 19 % de agua, de la cual un 10 % está unida químicamente. Las moléculas de almidón hidratadas se arreglan en forma de un enrejado cristalino, pero esta estructura se pierde y se hace amorfa cuando se expele el agua de hidratación, por calentamiento. El almidón está formado por una mezcla de moléculas de Amilosa y Amilopectina . Ambas fracciones son mezclas de moléculas de diferentes tamaños. Se han identificado amilosas con pesos moleculares entre 4,000 y 400,000. Estas moléculas de amilosa están formadas exclusivamente por monómeros de glucosa, unidos en union glucosídica α-1-4, dando una macromolécula linear. La molécula de amilopectina es mucho mayor de tamaño y presenta ramificaciones. Su peso molecular varía de 50,000 1,000,000. Son también polímeros formados exclusivamente de Glucosas. Las uniones para la parte linear de la molécula son también α-1-4, pero las uniones para formar los puntos de ramificación son α-1-6. Se calcula que las moléculas de amilopectina tienen un 5 % de ramificaciones, o sea que hay una ramificación después de cada más o menos 20 moléculas de glucosa, en forma linear. Suponiendo el peso molecular de la glucosa de 180 y restando el peso de una molécula de agua por cada unión glucosídica, será característico de la molécula de amilosa tener entre 25 y 2,500 monómeros de glucosa, y para la amilopectina de 300 a 6,000 monómeros, lo cual corresponde a unas 15 a 300 ramificaciones. Obtención del almidón La papa es un tubérculo que almacena gran cantidad de almidón, por lo que es muy sencillo obtenerlo de esa fuente. Basta con raspar la papa para hacer una pulpa fina y eliminar por filtración la parte gruesa insoluble de Celulosa, para obtener una buena suspensión de granos de almidón. Observación al microscopio Los granos de almidón son de tamaño microscópico, por lo que hay que hacer una preparación y llevarla a observación al microscopio. Para observarlos mejor y, si es posible, hacer visibles sus capas excéntricas se añade un poco de Lugol, que es una mezcla de Yodo con Ioduro de Potasio en agua, lo cual va a teñir de azul los granos de almidón. Temperatura de Gelatinización El material de los granos de almidón es una mezcla de sustancias diferentes con estructuras y propiedades distintas. Cuando el Almidón se trata con agua hirviendo, el almidón de unas partes del grano se solubiliza y se sale del grano, quedando otra parte del almidón que permanece insoluble. Esta porción

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insoluble de los granos, absorbe agua y se hincha para formar una esfera elástica, y toda la masa se convierte en una pasta de almidón. Este proceso de gelatinización sucede siempre a una temperatura definida.

No confundir almidón soluble con amilosa, ni almidón insoluble con amilopectina. Eso no es correcto. Ambos almidones, el soluble y el insoluble son mezclas de amilosa y amilopectina. Complejo Yodo-Almidón y su reversibilidad. La obtención de una sustancia colorida al reaccionar el yodo con el almidón se cree que se debe a la formación de un complejo de coordinación entre las micelas de Almidón y el Yodo. Estas micelas están formadas por cadenas polisacáridas enrolladas en hélice. El yodo puede colocarse centralmente en estas hélices. El color depende del largo de la sección linear de la molécula del almidón. Por eso la amilosa pura, que es el polisacárido exclusivamente linear dará con el yodo el color más intenso de un azul profundo.

La amilopectina dará un color azul violeta mientras que el glucógeno que es la molécula más ramificada dará un color café rojizo . La celulosa no da reacción de color con el yodo. Las dextrinas formadas por hidrólisis del almidón dan un color que varía de café rojizo a la ausencia de color, dependiendo del tamaño de la molécula. El color disminuye cuando la temperatura aumenta, hasta desaparecer por completo, y se intensifica al bajar nuevamente la temperatura. Esto indica la formación y destrucción de los complejos de coordinación formados entre el yodo y el almidón. La reacción del yodo con el almidón nos sirve para detectar el grado de hidrólisis del almidón. Hidrólisis del almidón. El almidón es la reserva alimenticia de las plantas, pero las células para la obtención de su energía no pueden metabolizar el almidón como tal, sino que es necesario que lo degraden por hidrólisis hasta sus constituyentes monosacáridos o glucosas, para que estas puedan metabolizarse en los caminos energéticos. Las células llevan al cabo la hidrólisis a través de procesos enzimáticos, pero en el laboratorio se puede llevar al cabo con ácido mineral, obteniendo el mismo resultado.

El curso de la hidrólisis se puede seguir de dos maneras. O por la desaparición de la reacción con el yodo a medida que avanza la hidrólisis, o por la formación de azúcares reductores. Mientras más hidrolizado esté el almidón, más azúcares reductores habrá, y menor será la reacción con el yodo hasta hacerse totalmente negativa.

PRACTICA 3: ESTUDIO DE ALGUNAS PROPIEDADES DE LOS LÍPIDOS

Revisión de Conceptos

. Lecitinas y Cefalinas

. Colesterol

. Agentes Emulsificantes

. Fracción Insaponificable

. Fracción Saponificable.

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PRÁCTICA 4: OBTENCION DE LECITINA Y COLESTEROL A PARTIR DE LA YEMA DEL HUEVO

Revisión de Conceptos

. Lecitinas y Cefalinas

. Colesterol

. Agentes Emulsificantes

. Fracción Insaponificable

. Fracción Saponificable.

El alumno debe de estar seguro de entender la solubilidad de los distintos lípidos y de conocer la composición de los mejores solventes.

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Los procedimientos que se practicarán en esta sesión de laboratorio son: . Obtención de la Lecitina . Obtención del Colesterol . Detección del Colesterol por la reacción de Liebermann-Burchard Es responsabilidad de alumno consultar los libros d e texto para conocer los fundamentos científicos d e las distintas manipulaciones de la práctica, antes de hacer la práctica. En la Hoja de Datos, deberá mencionar esos fundamentos. La práctica puede llevarse al cabo en dos sesiones, y en la segunda obtener el colesterol y hacer la prueba de Liebermann-Burchard.

MATERIAL NECESARIO PRIMERA PARTE SEGUNDA PARTE

Erlenmeyer de 250 ml. con tapón Vaso de precipitad os de 250 ml. Probeta de 50 o 100 ml. Agitador Embudo 6 tubos de ensaye de 13 x 100 Vaso de precipitados de 250 ml. Pipeta de 5 ml. Vaso de precipitados de 100 ml. Probeta de 50 o 100 ml. Vaso de precipitados de 50 ml. Gradilla. Agitador Escobetilla Además: Cada grupo de trabajo se responsabilizará de traer para la primera Parte, un huevo fresco. P R O C E D I M I E N T O

OBTENCIÓN DE LA LECITINA 1. Rompa el huevo, separe la yema y vacíela en un Erlenmeyer de 250 ml. Hágalo con cuidado, de

preferencia en el lavabo, procurando siempre la limpieza. La clara se descarta. 2. Añada 50 ml. de Alcohol Etílico y 25 ml. de Eter. Tape el Erlenmeyer y agite con cuidado durante unos dos

minutos, destapando de tiempo en tiempo para desalojar cualquier presión que pudiera desarrollarse. Deje reposar la mezcla por 10 minutos, agitando suavemente de tiempo en tiempo.

3. Filtre sobre papel filtro Whatman 1, humedecido con Etanol y doblado en la forma de “zig-zag” (en inglés

“fluted”). Cheque con el Instructor para saber cómo se dobla ese papel. 4. Pase el residuo que queda en el papel filtro a otro Erlenmeyer y añada 10 ml. de Etanol y 5 ml. de Eter.

Agite suavemente y deje reposar por cinco minutos. 5. Filtre nuevamente esta segunda extracción y combine los filtrados. El residuo se descarta. Disponga de él

en el lugar apropiado. 6. Coloque el Erlenmeyer con la mezcla de filtrados sobre una de las “Planchas Calientes”, del laboratorio,

donde le indique su Instructor.

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7. Esté pendiente a que se la haya evaporado todo el solvente y solo quede una pasta verdoso-amarillenta que burbujee un poquito. No debe proseguir calentando pues se quemará la preparación y será difícil seguir con el procedimiento.

8. Agregue 10 ml. de Eter al Erlenmeyer con su residuo 9. Prepare un vaso de precipitados de 100 ml, con 30 ml. de Acetona. Lentamente y con agitación suave solo

alrededor del centro del vaso de precipitados vacíe la solución del Erlenmeyer hacia el vaso con Acetona. Siga agitando con cuidado hasta que las partículas de Lecitina cruda precipiten, se adhieran entre sí y formen una bolita alrededor del agitador. En ocasiones la Lecitina precipita pero no se adhiere. No importa.

10. Filtre para separar la Lecitina. Guarde el filtrado para usarlo en la segunda parte de la práctica. Puede

observar la sedosidad de la lecitina obtenida. Después de lo cual se descarta, pues ya no se usará más. Lo que aprendió en esta parte es que:

OBTENCIÓN DEL COLESTEROL

1. Coloque el filtrado de la sección anterior en un vaso de precipitados de 250 ml. y colóque el vaso en la

plancha caliente que le proporcione su Instructor. Deje que se haga una pasta, pero cuidando de que se llegue a resecar totalmente.

2. Con mucho cuidado agregue 15 ml. de una solución de Potasa Alcohólica al 10 %, agite bien y vuelva a colocar la preparación en la plancha caliente, hasta que la solución se concentre a sequedad.

3. Deje que se enfríe la preparación. Añada 50 ml. de Eter y agite bien. Filtre por si hay algún precipitado de

jabón. 4. Nuevamente evapore el filtrado hasta sequedad. 5. Añada 5 ml. de Alcohol etílico y caliente por unos dos minutos. Transfiera la solución a un tubo de ensaye 6. Centrifugue por cinco minutos 7. Transfiera el sobrenadante a otro tubo de ensaye. Ese sobrenadante contiene el Colesterol. Ahora añada

gota a gota agua destilada a la solución. Comenzará a precipitarse el colesterol. Siga añadiendo agua hasta que ya no aparezca más precipitado.

8. Deje reposar la preparación unos minutos y centrifugue por cinco minutos. 9. El colesterol cristalino estará en el fondo del tubo de ensaye. Decante para eliminar el líquido, y deje secar

los cristales de Colesterol. Puede utilizarlos para la siguiente parte de la práctica. Lo que en esta parte aprendió es que:

REACCIÓN DE LIEBERMANN-BURCHARD ( Pronuncie Liberman- Burchar). 1. Coloque en su gradilla dos tubos de ensaye. 2. Si obtuvo buenos cristales de colesterol en su sección anterior, agréguelos a uno de los tubos. Al otro

agréguele 10 a 15 miligramos de Colesterol puro que le proporcione su instructor.

La Lecitina es insoluble en Acetona Donde PRECIPITA

El Colesterol disuelto en Alcohol se precipita con Agua. Se obtiene colesterol cristalino.

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3. Añada a los dos tubos 3.0 ml. de Cloroformo anhidro. 4. Añada 1.0 ml. de Anhidrído Acético a cada uno de los dos tubos. 5. Con mucho cuidado agregue dos o tres gotas de Ácido sulfúrico Concentrado a cada uno de los dos

tubos. 6. Agite suavemente y observe la aparición de color. Deje reposar y observe el color a los dos, cinco y diez

minutos para notar algún cambio de color en la reacción. 7. Anote todos sus resultados en la Hoja de Datos. En esta parte aprendió que la principal reacción para

cuantificar el colesterol es: PREPARACIÓN DE REACTIVOS

PRIMERA PARTE Alcohol Etílico……………….. 2 litros Eter Etílico…………………….1.5 litros Acetona………………………. 1 litro SEGUNDA PARTE Alcohol Etílico………………..300 ml. Eter Etílico…………………… 1 litro Cloroformo Anhidro…………..200 ml. Anhidrido Acético…………….100 ml. Äcido Sulfúrico Concentrado …50 ml. Colesterol Puro………………..100 miligramos. Solución de Potasa Alcohólica al 10 % (para 300 ml.) Disuelva 30 gramos de KOH en 300 ml. de Alcohol Etílico. Debe prepararse el mismo día.

DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS EXPERIMENTO 5

Obtención de Lecitina: ¿ Se obtuvo Lecitina en el experimento? ________

¿Cuál era la apariencia de la Lecitina __________ _______________________________________________

La reacción de Liebermann-Burchard

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Obtención de Colesterol: ¿Se obtuvo Colesterol en el experimento?_______ ¿Cuál era la apariencia del Colesterol?___________ _____________________________________________ Resultado de la Reacción de Liebermann-Burchard Tubo No. Color Tiempo 1 _________________ _______________ 2 _________________ _______________ FUNDAMENTO DE LOS PROCEDIMIENTOS

Obtención de la Lecitina Fundamento del procedimiento hasta la obtención de la Lecitina: Obtención del Colesterol.

Fundamento del procedimiento hasta la obtención del Colesterol:

Reacción de Leibermann-Burchard

Fundamento de la reacción

Cuestionario:

1. ¿Cuál es el fundamento para la clasificación de los Lípidos?

2. ¿Qué quiere decir que las Lecitinas puras sean b uenos agentes emulsificadores?

3. ¿Cuál es el mejor solvente para la extracción de los lípidos y por qué?

4. ¿Cuáles son los productos de la hidrólisis compl eta de la Lecitina?

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5. ¿Por qué en la obtención del colesterol se usa K OH disuelto en alcohol y no disuelto en Agua?

6. Es muy importante que consulte en sus libros y t enga claros los modelos de los Fosfolípidos y colesterol, para entender sus propiedades de anfote ricidad y sus características de orientación sobre todo en la estructura de las membranas biológ icas. Anote las estructuras de estos lípidos.

LECTURAS EXPERIMENTO 3 y 4

Lípidos son aquellas sustancias orgánicas extraíble s de tejidos animales o vegetales, por medio de solventes orgánicos como Éter, Cloroformo, Tetracloruro de Carbono, Benceno, etc.

Los lípidos, como grupo, son muy insolubles en agua. Bioquímicamente hablando, son sustancias de suma importancia, en primer lugar porque constituyen formas de almacenamiento de energía, y en segundo lugar, porque forman parte de estructuras celulares, principalmente de todo tipo de membrana biológica.

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Los lípidos extraídos de material biológico representan una gran variedad de moléculas, estructuralmente diferentes, pero que comparten la propiedad de ser solubles en solventes orgánicos, llamados por eso, solventes de las grasas. Entre los lípidos existen moléculas no polares, como los triacilgliceroles, o triglicéridos, y moléculas polares como los Fosfoglicéridos, o Fosfolípidos, y los Esfingolípidos, y moléculas de tipo terpenoide los Esteroides, los Terpenos y algunas Vitaminas.

No existe clasificación de lípidos, aceptada universalmente, pero una de las más comunes es la que los divide en: Acidos Grasos, Triacilgliceroles, Fosfoglicéridos y Lípidos no fosforilados, siendo esta última una categoría heterogenea que incluye: Gangliósidos, Cerebrósidos, Sulfolípidos, Proteolípidos, Esteroides, Terpenos y Eicosanoides o Prostaglandinas. Hay que notar que los nombres genéricos de los grupos de lípidos pueden variar de acuerdo a diferentes autores.

Es muy difícil, si no imposible, el separar cuantitativamente, por extracción con solventes orgánicos, a todos los lípidos de un tejido, por ejemplo con Etanol-Eter, o con Etanol-Eter-Cloroformo. Unos lípidos son más solubles en un solvente y otros en otro.

Entre los Fosfolgicéridos más comunes, tenemos a los tres derivados del Acido Fosfatídico, a saber: Fosfatidil Colina, Fosfatidil Etanolamina y Fosfatidil Serina. A los Fosfatidil Colina se les conoce con el nombre genérico de Lecitinas . Existen varias lecitinas dependiendo de los dos ácidos grasos que contengan esterificados en los carbonos alfa y beta del glicerol.

Las Lecitinas son moléculas polares que existen en forma de sales internas o zwiteriones, ya que contienen la carga negativa del Acido Fosfórico, y la carga positiva del grupo trimetilamino de la colina. El pH isoeléctrico de una Lecitina pura es generalmente de 6.7 o un poco mayor, lo cual concuerda con su estructura anfótera.

Las lecitinas puras son sustancias blancas de aspecto grasoso, que cuando se exponen a la luz y al aire toman una coloración café, debido a la autooxidación y descomposición. Son solubles en los solventes ordinarios de las grasas, excepto en Acetona . Esta propiedad se emplea para su aislamiento. Son higroscópicas y se mezclan bien con el agua formando soluciones coloidales nebulosas.

Preparaciones de Lecitina purificada son suficientemente efectivas en bajar la tensión superficial de soluciones acuosas, propiedad que se aumenta cuando la lecitina está combinada o adsorbida a Proteínas y carbohidratos, en cuyo caso las lecitinas son muy activas y constituyen agentes emulsificantes excelentes.

La identificación de la lecitina puede hacerse por saponificación, para separar los Acidos Grasos, hidrólisis para separar la Colina y después probar para presencia de Colina.

En el reino animal el esteroide más abundante es el Colesterol . El colesterol no se precipita del eter por la Acetona, y como es insaponificable, puede extraerse con eter, después del tratamiento con hidróxido de potasio.

El colesterol, generalmente cristaliza como placas rómbicas blancas. No tiene olor ni sabor. Si se expone a la luz y al aire, se oxida lentamente, formando una mezcla de productos que bajan su punto de fusión y cambian sus reacciones de solubilidad. Es insoluble en agua, ácidos y álcalis. Es un poco soluble en soluciones jabonosas y todavía más solubles en soluciones de ácidos biliares. Es muy soluble en Eter, Benceno, Cloroformo, Eter de Petroleo, Disulfuro de Carbono y Acetona. Sus principales propiedades químicas se relacionan con su grupo hidroxilo secundario y su doble ligadura.

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Después de la saponificación de un Triacilglicerol, los productos son solubles en agua e insolubles en Eter. Una sustancia insaponificable, como el Colesterol, es aquella que mantiene su insolubilidad en agua y su soluibilidad en eter después del tratamiento alcalino. El conjunto de sustancias que se comportan así se llaman genéricamente: Fracción insaponificable de las grasas.

A su vez se llamará Fracción saponificable, al conjunto de sustancias que después del tratamiento de saponificación se vuelven solubles en agua e insolubles en eter. Esta última fracción contiene principalmente jabones y ésteres de ácidos grasos, mientras que la fracción insaponificable la componen principalmente alcoholes de alto peso polecular, Esteroides y Terpenos.

Extracción de Lecitina y Colesterol

En la yema del huevo se encuentran las lecitinas en gran abundancia y además el colesterol en suificiente cantidad para hacer su aislamiento y detección fácil.

Separada la yema, se extraen los lípidos con solventes orgánicos. Tal vez la mejor mezcla de solventes es Ethanol-Eter al 2:1. Las lecitinas una vez extraídas por los solventes orgánicos, se precipita fácilmente agregando Acetona. Una vez precipitadas las lecitinas en soluición queda el colesterol junto con otras sustancias de menor concentración. Si entonces se hace una saponificación se separa la fracción saponificable y queda la fracción insaponificable, donde viene el colesterol. El colesterol entonces se precipita en forma cristalina agregando agua.

Reacción de Liebermann-Burchard

La demostración de la presencia del colesterol se hace por medio de la reacción de Liebermann-Burchard, que es específica para Esteroles con insaturación en los anillos A, B o C.

Las reacciones de color de los esteroles se deben a una dehidración preliminar para formar dienos, principalmente el 3,5-Colestadieno o el 2,3-colestadieno, que se polimerizan a dímeros y trímeros. Entonces el Colestadieno, y sus polímeros reaccionan con el Acido Sulfúrico para formar Acidos Sulfónicos, que pueden representar productos intermediarios o finales de la reacción, se deben a los diversos pasos del proceso, por lo que se requiere de 15 a 20 minutos para que se desarrolle completamente el color típico verde azulado oscuro característico, que puede incluso cuantificarse. Para esta reacción se requieren condiciones completamente anhidras.

PRACTICA 5: REACCIONES DE COLOR PARA AMINOÁCIDO S

Revisión de conceptos

. Composición e hidrólisis de las proteínas.

. Clasificación de los aminoácidos. .Tipos de cadenas laterales de los aminoácidos.

El alumno debe tener claro la configuración L o D de los aminoácidos. Las reacciones de los grupos amino y los grupos carboxilo de los aminoácidos y las reacciones específicas para los grupos de las cadenas laterales de los aminoácidos.

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Las reacciones que se practicarán en esta sesión son las siguientes: . Reacción de la Ninhidrina: Universal para detectar Aminoácidos. . Reacción de Millon: Identifica Tirosinas en solución o en Proteínas. . Reacción Xantoproteica: Identifica Tirosina y Triptófano. . Reacción de Sakaguchi: Identifica Arginina Es responsabilidad del alumno consultar los libros de texto para conocer los fundamentos científicos en que se basa cada una de las reacciones arriba mencionadas, antes de hacer la práctica. En la Hoja de Datos deberá mencionar esos fundamentos. MATERIAL NECESARIO:

Gradilla 2 Pipetas de 5 ml. 20 tubos de ensaye de 15 x 150 3 pipetas de 1 ml. 1 Vaso de precipitados de 600 ml. 2 pinzas para tubos de ensaye 1 Vaso de precipitados de 250 ml. Mechero, tripie y tela de asbestos 7 Vasos de precipitados de 50 ml. Escobetilla. Además: Es responsabilidad de cada grupo traer un poco de hielo que se necesitará para la última reacción. Se pueden juntar dos o tres grupos y entre ellos traer una bolsa de hielo.

P R O C E D I M I E N T O

REACCIÓN DE LA NINHIDRINA (Pronuncie Ninidrina) 1. Con su mechero, tripie, tela de asbestos y el vaso de precipitados de 250 ml. prepare un baño de agua

hirviendo. No llene de agua totalmente el vaso de precipitados sino más o menos a la mitad. Use agua destilada.

2. Con ‘masking tape’, o con plumón graso, titule s us siete vasos de precipitados de 50 ml. con los

nombres de las muestras que van a contener y que so n: Albúmina, Alanina, Tirosina, Triptófano, Aspártico, Arginina y Gelatina.

3. Con los vasos así titulados vaya a la mesa de reactivos y tome más o menos 15 ml. de cada una de las

muestras. Estas soluciones estarán en su mesa de trabajo para facilitar la práctica. Si al final algo sobrara se podrá regresar al frasco original, teniendo mucho cuidado de identificar bien las sustancias.

4. Coloque en su gradilla 7 tubos de ensaye e identifíquelos de alguna manera con los nombres de las

sustancias que va a probar (puede usar una hoja aparte para la correcta identificación de las sustancias). 5. Pipetee 3.0 ml. de cada una de las muestras a sus correspondientes tubos. Cuide de no perder la

identificación de las muestras. Las muestras las tiene ya en sus vasos de precipitados en su lugar de trabajo.

6. Con papel indicador, cheque el pH de las muestras. Si no está neutro, ajústelo con mucho cuidado. 7. Añada 1.5 ml. de la solución de Ninhidrina al 0.1 % a cada uno de los siete tubos. 8. Cuando ya esté hirviendo el agua en el baño que preparó coloque ahí los siete tubos al mismo tiempo y

déjelos unos minutos. Vaya sacando los tubos del baño de agua hirviendo a medida que vayan dando la reacción positiva. Si algún tubo después de 10 minutos no ha dado la reacción positiva, sáquelo y considere en ese tubo una reacción negativa.

9. Observe el color desarrollado y anote en su ‘Hoja de Datos’, las características de tiempo y color de la

reacción para cada tubo. La reacción que en esta parte ha practicado es la:

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REACCIÓN DE MILLON (pronuncie Mílon) 1. Coloque en su gradilla 4 tubos de ensaye y numérelos o identifíquelos de acuerdo a las muestras que va a

probar, que son: Tirosina, Alanina, Albúmina y Gelatina. 2. Pipetee 3 ml. de las soluciones correspondientes a los túbos así identificados. 3. Añada 5 gotas del Reactivo de Millon a cada uno de los cuatro tubos. 4. Coloque los tubos en el baño de agua hirviendo y déjelos por cinco minutos. 5. Saque del baño de agua hirviendo los tubos y observe el color desarrollado en algunos de los tubos.

Identifíque las muestras que estaban en los tubos que dieron reacción positiva. 6. En su ‘Hoja de Datos’ anote sus observaciones y resultados. Lo que acaba de realizar es la prueba

llamada:

Reacción Xantoprotéica 1. Coloque en su gradilla 5 tubos de ensaye y numér elos o identifíquelos de alguna manera con los

siguientes nombres: Tirosina, Triptófano, Alanina, Albúmina y Gelatina. 2. Pipetee 2.0 ml. de las soluciones a los correspondientes tubos. 3. Con mucho cuidado añada a cada uno de los cinco tubos 1.0 ml. de Acido Nítrico concentrado (incoloro). 4. Lleve los tubos al baño de agua hirviendo y déjelos ahí por cinco minutos. 5. Saque los tubos de ensaye del baño de agua hirviendo y enfríelos en agua corriente. 6. Con sumo cuidado, resbale lentamente con una pipeta, por la pared de cada tubo, 2.0 ml. de Hidróxido de

Amonio Concentrado. NO AGITE. 7. Observe el resultado. Si la reacción es positiva, se desarrollará un anillo de color naranja 8. Anote sus observaciones en su ‘Hoja de Datos’. La prueba que acaba de demostrar es la:

Reacción de Sakaguchi 1. Prepare un baño de hielo, poniendo hielo picado en su vaso de precipitados de 600 ml. 2. Coloque en ese baño de hielo 3 tubos de ensaye numerados o identificados como: Aspártico, Arginina,

Albúmina. 3. Pipetee 5.0 ml. de las soluciones correspondientes.

Reaccion de la Ninhidrina.

Reacción de Millon.

Reacción Xantoprotéica

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4. Añada 1.0 ml. de Hidróxido de Sodio al 10 % a cada uno de los tres tubos. 5. Añada 2.0 ml. de solución de Alfa-Naftol al 0.02 % a cada uno de los tres tubos. 6. Añada 1.0 ml. de Hipobromito alcalino a cada uno de los tres tubos. 7. Después de un minuto añada 1.0 ml. de solución de Urea al 40 % (Para destruir el exceso de Hipobromito).

Mezcle bien por inversión del tubo. 8. Observe el desarrollo de un color rojizo que indica que la prueba es positiva. 9. Anote en la ‘Hoja de Datos’, sus observaciones y resultados. Lo que acaba de practicar es la prueba de la:

PREPARACIÓN DE REACTIVOS Solución de Ninhidrina al 0.1 % (350 ml.) Pesar 350 miligramos de Ninhidrina Disolverlos en 35 ml. de Etanol de 95 % Aforar a 350 ml. con agua destilada. Reactivo de Millon (100 ml.) Pesar 25 gramos de Mercurio. Disolverlos en 25 ml. de Acido Nítrico. Se requiere de calentamiento Por lo que lo mejor es hacerlo en una plancha caliente colocada En la campana pues los humos que salen son tóxicos. Una vez disuelto el mercurio, enfríe la solución en agua corriente Añada entonces 50 ml. de Agua Destilada. Nota: Las proporciones de Mercurio-Nítrico-Agua deben ser 1-1-2. Como es difícil pesar con exactitud el mercurio, lo mejor pesar Una determinada cantidad de mercurio y ajustar las cantidades De los otros reactivos a esa cantidad de mercurio, conservando Siempre las proporciones mencionadas.

Hipobromito Alcalino (100 ml.)

Pesar 0.8 gramos de Bromo y disolverlos en 100 ml. de NaOH al 5 % Alfa-Naftol al 0.2 % (100 ml.) Pesar 0.2 gramos de Alfa-Naftol Disolverlos en 100 ml. de Alcohol Etilico de 95 % Nota: Este reactivo es muy inestable. Hay que prepararlo inmediata Mente antes de usarlo. Urea al 40 % (100 ml.) Pesar 40 gramos de Urea

Reacción de Sakaguchi.

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Disolverlos en 100 ml. de Agua Destilada. Hidróxido de Sodio al 10 (100 ml.) Pesar 10 gramos de NaOH Disolverlos en 100 ml. de Agua Destilada. Hidróxido de Sodio al 5 % (100 ml.) Pesar 5 gramos de NaOH Disolverlos en 100 ml. de Agua Destilada. Acido Nítrico concentrado . . . . . . . . . . .100 ml.

Acido Sulfúrico concentrado . . . . . . . . . 100 m l. Hidróxido de Amonio concentrado. .. . . 200 ml.

Soluciones de Aminoácidos y Proteínas (Todos al 0. 1 %) ♦ Albúmina (500 ml.) Pesar 500 miligramos de Albúmina Disolver en 500 ml. de Agua Destilada. ♦♦♦♦ Gelatina (500 ml.) Pesar 500 miligramos de Gelatina Disolverlos en 500 ml. de Agua Destilada. ♦♦♦♦ Alanina (500 ml.) Pesar 500 miligramos de Alanina Disolverlos en 500 ml. de Agua Destilada. ♦♦♦♦ Triptófano (300 ml.) Pesar 300 miligramos de Triptófano, Disolverlos en 300 ml. de Agua Destilada. ♦♦♦♦ Tirosina (250 ml.) Pesar 250 miligramos de Tirosina Disolverlos en 250 ml. de Agua Destilada. ♦♦♦♦ Acido Aspártico (100 ml.) Pesar 100 miligramos de Acido Aspártico Disolverlos en 100 ml. de Agua Destilada. ♦♦♦♦ Arginina (100 ml.) Pesar 100 miligramos de Arginina Disolverlos en 100 ml. de Agua Destilada. Nota: Si alguno de los aminoácidos no se disuelve bien en Agua Destilada, por ejemplo la Tirosina, agregue un poquito de ácido Clohídrico y calor.

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DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS

EXPERIMENTO

Reacción de la Nimhidrina

Tuno No. Muestra Color Tiempo Proteina o AA

1 Albúmina ________ ________ ________ 2 Alanina ________ ________ ________ 3 Tirosina ________ ________ ________ 4 Triptófano ________ _______ ________ 5 Aspártico ________ ________ ________ 6 Arginina ________ ________ ________ 7 Gelatina ________ ________ ________

Reacción de Millon Tubo No. Muestra Color Tiempo 1 __________ __________ _________ 2 __________ __________ _________ 3 __________ __________ _________ 4 __________ __________ _________

Reacción Xantoprotéica

Tubo No. Muestra Color Tiempo

1 __________ __________ _________ 2 __________ __________ _________ 3 __________ __________ _________ 4 __________ __________ _________ 5 __________ __________ _________

Reacción de Sakaguchi

Tubo No. Muestra Color Tiempo 1 __________ __________ _________ 2 __________ __________ _________ 3 __________ __________ _________

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FUNDAMENTO DE LAS REACCIONES

Escriba brevemente el fundamento de las reacciones practicadas. Si es necesario consulte el libro de texto, o pida a su Instructor le indique donde puede encontrarlos.

Reacción de la Ninhidrina Reacción de Millon Reacción Xantoprotéica Reacción de Sakaguchi CUESTIONARIO. 1. ¿Cuál de las dos configuraciones de los aminoáci dos se encuentra exclusivamente en la estructura

de las proteínas? 2. ¿Cuáles son las características de solubilidad d e los aminoácidos? 3.- En sus cursos de Química Inorgánica, ¿recuerda haber tocado ácido Nítrico? ¿Que pasó y qué reacción era?

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LECTURAS EXPERIMENTO 5

La hidrólisis completa de las proteínas da como resultado una mezcla de los 20 aminoácidos

componentes de las proteínas. Con excepción de Prolina, todos los aminoácidos, como su nombre lo indica, tienen un grupo funcional ácido y un grupo funcional amino, los dos grupos unidos al mismo carbono α de la molécula. Por eso se dice que los aminoácidos son compuestos α-amino-α-carboxílicos.

Todos los aminoácidos, excepto Glicina, poseen al menos un átomo de carbono asimétrico, y

químicamente pueden existir en la forma D (dextro) o en la forma L (levo), o en mezcla racémica. Se sabe que la configuración de los grupos asimétricos de los aminoácidos de plantas y animales es la misma que la del L-Gliceraldehido, por lo que se considera mque todos los aminoácidos que forman parte de las proteínas en plantas y animales están en configuración L.

Todos los aminoácidos tienen varias reacciones en común. Son aquellas que se llevan al cabo en el

grupo amino, o en el grupo carboxilo o en ambos. Además, aquellos aminoácidos que contienen cadena lateral con un grupo reactivo, podrán sobrellevar reacciones específicas para ese grupo particular. Tales reacciones

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son de interés, primero porque permiten la detección y estimación de algunos aminoácidos en particular, y segundo poraue esas reacciones permiten modificar a las proteínas químicamente.

En general, los aminoácidos son fácilmente solubles en agua, algo solubles o insolubles en alcohol y

totalmente insolubles en eter. La Tirosina, en particular, es muy poco soluble en agua fría, aunque aumenta su solubilidad en agua caliente. La Cisteína es difícilmente soluble tanto en agua fría como en caliente. La Prolina es soluble en alcohol y eter.

Los aminoácidos son solubles en ácidos y bases diluidas, en las que forman sales de aminoácidos.

Pero, como siempre, la Tirosina y la Cisteína tienen características contrarias, o sea en este caso de solubilidad en ácidos o bases diluidas, la Tirosina es poco soluble y la Cisteína insoluble.

Reacción de la Ninhidrina

Esta reacción es de bastante importancia, pues es universalmente empleada para detectar cualitativa y cuantitativamente a los aminoácidos. Para los aminoácidos esta es la unica reacción de color, verdaderamente importante.

La ninhidrina es un agente oxidante poderoso y lleva al cabo la deaminación oxidativa de los grupos α-

amino, liberando amoniaco, bióxido de carbono y el correspondiente aldehido, asi como la forma reducida de la ninhidrina. El amoniaco entonces, reacciona con un mol adicional de ninhidrina oxidada y un mol de ninhidrina reducida para dar una sustancia de color azul violeta , que presenta un máximo de absorción a 570 nanómetros. Como esta absorción es casi una función linear de la cantidad original de los grupos amino, esta reacciónsirve para estimar cuantitativamente las aminas primarias, y si no hay compuestos que interfieran, también sirve para determinar cuantitativamente a los aminoácidos.

Es una reacción general dada por aminas primarias cuyo carbón alfa posea un átomo de hidrógeno.

Por eso las proteínas o derivados proteicos pueden dar positiva esta reacción. Por otro lado la evolución de bióxido de carbono se podría seguir manométricamente como una estimación segura de la cantidad de los aminoácidos presentes en la muestra. Esto es mucho más difícil y normalmente ya no se hace.

En el caso de los iminoácidos como la Prolina, el producto que se forma tiene color amarillo, con un

máximo de absorción de 440 nanómetros.

Reacción de Millon Esta reacción, llamada también de Hofmann, es específica para determinar Tirosina. De hecho lo que se determina son los grupos hidroxifenilos que puedan nitrarse fácilmente. El reactivo es una solución de Nitrato Mercúrico con Acido Nítrico. El color rosa rojo que se forma al reaccionar la Tirosina con el reactivo, se cree que se debe a un complejo Mercúrico con los derivados nitrofenol. Cuando se añade el reactivo a una solución proteica, se forma primero un precipitado blanco, que corresponde a la proteína coagulada por el calor, pero si la proteína contenía Tirosina, ese coágulo se pondrá de color rosa rojo al prolongar un poco el calentamiento. Si la solución que se prueba es alcalina, tendrá que neutralizarse primero con un poco de clorhídrico, pues de lo contrario se precipitaría el mercurio del reactivo. Los cloruros interfieren con la reacción, probablemente porque el ácido nítrico forma cloro libre que destruye el compuesto colorido.

Reacción Xantoproteica La reacción es debida a la nitración del anillo bencénico con el ácido nítrico concentrado, para dar productos de color amarillo, que se tornan anaranjados al añadir álcali, debido a la formación de sales. En las

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condiciones del experimento solo la Tirosina y el Triptófano darán positiva la prueba. La fenilalanina no por que es más difícil de nitrar, para lo cual requeriría ácido sulfúrico como catalizador.

Si se prueba una solución de proteína que contenga Tirosina o Triptófano, se formará primero un precipitado blanco al añadir el nítrico concentrado. Al calentar, ese precipitado se vuelve amarillo, y si la solución se hace alcalina, el precipitado finalmente se torna anaranjado. Las manchas amarillas que aparecen en la piel después del contacto con ácido nítrico se deben precisamente a la reacción xantoproteica del nítrico con los aminoácidos de las proteínas de la piel.

Reacción de Hopkins-Cole Los derivados Indol, dan productos de condensación cuando se tratan con aldehidos aromáticos en presencia de ácido sulfúrico o clorhídrico. El aminoácido Triptófano contiene un grupo indol y por eso la reacción es específica para Triptófano. Cuando se agrega el reactivo a una solución que contenga Triptófano o una proteína con triptófano, y lentamente se añade una capa de sulfúrico concentrado, se formará un anillo de color violeta en la interfase de los líquidos. Proteínas que no contengan Triptófano, como la gelatina, darán negativa la prueba. Se desconoce la naturaleza de los productos que se forman. El tirptófano puro no da la reacción a menos que contenga indicios de iones férricos o cúpricos. Los cloratos, nitratos, nitritos y cloruros en exceso impiden la reacción.

Reacción de Sakaguchi Es una reacción de los compuestos que contengan grupo Guanido o guanidino. De ahí que sea una indicación de la presencia de Arginina libre p de proteínas que contengan Arginina. LA prueba consiste en tratar la muestra con Alfa-Naftol e hipoclorito de sodio o hipobromito de sodio, con lo cual se desarrollará un color rojo intenso. El desarrollo del color se altera o se previene por completo por la presencia de amino, histidina o triptófano. La arginina libre da la prueba positiva aun a concentraciones tan bajas como de 4 microgramos por mililitro.

PRACTICA 6: PRECIPITACION DE PROTEÍNAS En esta sesión se practicarán las siguientes formas de precipitar a las proteínas: . Precipitación por Salación o ‘salting out’. . Precipitación por Solventes orgánicos . . Precipitación por Formación de Sales . . Reacción del Biuret.

Revisión de Conceptos

. ‘Salting out’

. Precipitación diferencial

. Carga de las proteínas

. Punto Isoeléctrico.

. Formación de sales.

. Solventes orgánicos.

El alumno debe tener claras las distintas formas que hay de precipitar a las proteínas y sus usos.

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Es responsabilidad del alumno el consultar los libros de texto para conocer los fundamentos científicos de las diversas formas de precipitar a las proteínas, así como los fundamentos de la reacción del Biuret. En la ‘Hoja de Datos’ deberá mencionar esos fundamentos.

MATERIAL NECESARIO Gradilla Probeta de 50 o 100 ml. 10 tubos de ensaye de 13 x 100 Embudo Agitador Pipeta de 5 ml. 2 vasos de precipitados de 250 ml. 2 vasos de precipitados de 50 ml. 9 tubos de ensaye de 13 x 100 4 tubos de ensaye de 15 x 150 Escobetilla. Además: Cada grupo se responsabilizará de traer un huevo y un pañuelo Limpio de tejido no muy cerrado. P R O C E D I M I E N T O PRECIPITACIÓN POR SALACIÓN (SALTING OUT)

1. Rompa un huevo y separe la yema de la clara. Descarte la yema y vacíe la clara en un vaso de

precipitados de 250 ml. 2. Agite suavemente la clara. No agite vigorosamente pues provocaría la producción de espuma, cosa que no

es recomendable. (Toda solución proteica si se agita produce espuma. Si la proteína es enzima se desnaturaliza):

3. Filtre a través de gaza doble o de un pañuelo limpio de tejido no muy cerrado. Puede filtrar directamente a

una probeta para calcular la cantidad de filtrado que se obtuvo. 4. Mida el volumen de filtrado obtenido y vacíelo a otro vaso de precipitados de 250 ml. Añada un volumen

igual de una solución saturada de Sulfato de Amonio. Agite suavemente y deje reposar por unos 10 minutos.

5. Filtre a través de papel filtro ordinario. El precipitado contiene la ovoglobulina y el filtrado contiene la

ovoalbúmina todavía en solución. 6. Disuelva este precipitado en un vaso de precipitados de 100 ml. añadiendo 50 ml. de Cloruro de Sodio al 1

% 7. Al filtrado, que ya está en solución al 50 % de Sulfato de Amonio, agréguele Sulfato de Amonio sólido para

llevarlo al 100 % de saturación. Se mide la cantidad de filtrado y se calculan los gramos de sulfato de amonio que hay que añadir sabiendo que por cada 100 ml. de filtrado habrá de añadir 37.5 gramos. Agite suavemente para que se disuelva bien el sulfato de amonio. Deje reposar unos 10 minutos. Se precipita la ovoalbúmina.

8. Filtre a través de papel filtro ordinario rápido. 9. Disuelva este nuevo precipitado en otro vaso de precipitados de 100 ml. añadiendo 50 ml.de Cloruro de

Sodio al 1 %. 10. Conserve estas soluciones para hacer la siguiente reacción. Lo que acaba de hacer es la:

Precipitación de la Ovoalbúmina y la Ovoglobulina por

Salación

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REACCIÓN DEL BIURET 1. Coloque en su gradilla 3 tubos de ensaye de 13 x 100 e identifíquelos de alguna manera. 2. Pipetee 2.0 ml. de agua destilada al tubo número 1. 3. Pipetee 2.0 ml. de solución de ovoalbúmina al tubo número 2 y 2.0 ml. de solución de ovoglobulina al tubo

número 3. (Estas son las soluciones que obtuvo en la primera parte). 4. Agregue 2.0 ml. del Reactivo de Biuret ya preparado a cada uno de los tres tubos. Agite bien y deje reposar

por unos 10 minutos. 5. Observe el color desarrollado en los tubos dos y tres que deben ser positivos para la reacción 6. Anote sus resultados y observaciones en la ‘Hoja de Datos’. Lo que acaba de hacer es la: Nota: El experimento se puede hacer cuantitativo, para lo cual en necesario primero hacer curva patrón con una serie de tubos de ensaye a los cuales se les pipetean cantidades crecientes de proteína, se hace la reacción y se mide la densidad óptica de cada uno de los tubos a 550 nanómetros. Se grafican los datos en papel milimétrico. A esa gráfica se refiere cualquier problema de cantidad de proteína. PRECIPITACIÓN POR SOLVENTES ORGÁNICOS.

1. Coloque en la gradilla cuatro tubos de ensaye de 15 x 150 e identifíquelos de alguna manera. 2. Pipetee 3.0 ml. de Albúmina de huevo al 0.1 %, ya preparada, a los tubos uno, dos y tres. 3. Pipetee 4.0 ml. de Agua Destilada al tubo número cuatro. 4. Pipetee 1.0 ml. de Acido Clorhídrico 0.1 N al tubo uno. 5. Pipetee 1.0 ml. de Hidróxido de Sodio 0.1 N al tubo dos. 6. Pipetee 1.0 ml. de solución amortiguadora de Acetato pH 4.7 al tubo tres. 7. Pipetee 5.0 ml. de Etanol al 95 % a cada uno de los cuatro tubos. 8. Observe la turbidez relativa de los tubos, que indica la precipitación. 9. Anote sus resultados y observaciones en la ‘Hoja de Datos’. Lo que acaba de hacer es la

Detección de Proteinas Por la reacción del

BIURET.

Precipitación de la Ovoalbúmina con solvente orgánico a distintos pHs.

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PRECIPITACIÓN POR FORMACIÓN DE SALES

1. Coloque seis tubos de ensaye de 13 x 100 en su gradilla e identifíquelos de alguna manera. 2. Pipetee 2.0 ml. de Albúmina de huevo al 0.1 %, ya preparada, a los tubos uno, tres y cinco. 3. Pipetee 2.0 ml. de Agua Destilada a los tubos dos, cuatro y seis. 4. Pipetee 0.5 ml. de Cloruro de Mercurio al 5 % a los tubos uno y dos. 5. Pipetee 0.5 ml. de Nitrato de Plata al 1 % a los tubos tres y cuatro. 6. Pipetee 0.5 ml. de Acido Tricloroacético al 10 % a los tubos cinco y seis. 7. Observe la formación de precipitado en los distintos tubos. 8. Anote sus resultados y observaciones en la ‘Hoja de Datos’. Lo que acaba de hacer es la: PREPARACIÓN DE REACTIVOS Sulfato de amonio sólido. (300 gramos) Solución saturada de Sulfato de Amonio (800 ml.) Pesar 600 gramos de Sulfato de Amonio Disolverlos en Agua Destilada y aforar a 800 ml. Cloruro de Sodio al 1 % ( 2 litros) Pesar 20 gramos de Cloruro de Sodio Disolverlos en dos litros de Agua Destilada. Reactivo de Biuret (1 litro) Pesar 1.5 gramos de Sulfato de Cobre pentahidratado y 6 gramos de Tartrato de Sodio y Potasio Disolverlos en 500 ml. de Agua Destilada. Añadir con constante agitación 300 ml. de Hidróxido de Sodio al 10 %, usando calentamiento si es necesario. Enfríar y aforar a 1 litro con Agua Destilada. Albúmina de Huevo al 0.1 (400 ml.) Pesar 400 miligramos de Albúmina de Huevo Disolverlos en 400 ml. de Agua Destilada. Acido Clorhídrico 0.1 N (100 ml.) Medir 0.83 ml. de Acido Clorhídirico concentrado Aforar a 100 ml. con Agua Destilada. Hidróxido de Sodio 0.1 N (100 ml.)

Precipitación de Ovoalbúmina

Por formación de SALES.

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Pesar 400 miligramos de Hidróxido de Sodio Disolverlos en 100 ml. de Agua Destilada. Solución Amortiguadora de Acetato pH 4.7 (100 ml.) Solución A: Acido Acético 0.2 N Medir 1.16 ml. de Acido Acético Aforar a 100 ml. con Agua Destilada. Solución B: Acetato de Sodio 0.2 M Pesar 1.64 gramos de Acetato de Sodio anhidro O 2.72 de Acetato de Sodio trihidratado. Disolverlos en 100 ml. de Agua Destilada. Buffer: Mezclar 23.4 ml. de la solución A y 26.6 de la solución B Aforar a 100 ml. con Agua Destilada. Etanol de 95 % (400 ml.) El etanol viene de fábrica a 96 o 95 % por lo que se puede usar Sin más dilusión. Cloruro de Mercurio al 5 % (50 ml.) Pesar 2.5 gramos de Cloruro de Mercurio Disolverlos en 50 ml. de Agua Destilada. Nitrato de Plata al 5% (50 ml.) Pesar 2.5 gramos de Nitrato de Plata Disolverlos en 50 ml. de Agua destilada. Acido Tricloroacético al 10 % (50 ml.) Pesar 5 gramos de Acido Tricloroacético Disolverlos en 50 ml. de Agua Destilada

DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS

EXPERIMENTO 6

Precipitación por ‘Salting out’ Total en ml. de filtrado obtenido: ________________ Cantidad de Sulfato de Amonio Sólido agregado al filtrado de la solución De Ovoalbúmina: ________________________

Reacción del Biuret Tubo No. Color Tiempo 1 _____________ _____________ 2 _____________ _____________ 3 _____________ _____________

Precipitación por Solventes Orgánicos Tubo No. Turbidez

1 _____________ 2 _____________ 3 _____________

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4 _____________

Precipitación por Formación de Sales Tubo No. Precipitado

1 _____________ 2 _____________ 3 _____________ 4 _____________ 5 _____________ 6 _____________

FUNDAMENTO DE LOS PROCEDIMIENTOS

Escriba concretamente cual es el fundamento de cada uno de los procedimientos realizados. Si es necesario consulte el libro de texto. Precipitación por Salación (Salting out)

Reacción del Biuret Precipitación por Solventes Orgánicos. Precipitación por Formación de Sales.

CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es, en general, la solubilidad de las proteínas globulares y a qué se debe esta solubilidad? 2. Conociendo lo que es el ‘Salting out’, ¿qué significará el procedimiento del ‘Salting in’? 3. ¿Investigue por qué el Sulfato de Amonio es la sal más empleada en la precipitación de proteínas? 4. ¿Qué proteínas precipitan al 50 % de saturación de Sulfato de Amonio, y que proteínas precipitan al 100 %

de saturación?

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5. Le conviene investigar qué es una Diálisis, cómo se lleva al cabo y para qué sirve.

LECTURAS EXPERIMENTO 6 La precipitación de proteínas es uno de los procedimientos más empleados en los procesos metodológicos de la bioquímica moderna De ahí que sea necesario tener claros los principios en que se basan los diversos tipos de precipitaciones.

Por lo general la solubilidad de las proteínas es variable. La mayoría de las proteínas globulares es soluble en agua, sea totalmente o coloidalmente soluble, cuando están en su estado nativo. Cuando están desnaturalizadas las proteínas pierden parte de su solubilidad. Cuando se dice que una proteína es Coloidalmente soluble se quiere indicar o bien que las moléculas proteicas son de tamaño tan grande que incluso dispersas en solución tienen el tamaño y superficie que caracteriza a las partículas coloidales, o que hay alguna fuerza que las hace formar agregados de tamaño coloidal. De las proteínas globulares, las albúminas son solubles en agua pura, pero también solubles en soluciones salinas. Las globulinas son insolubles en agua pura, pero se disuelven en soluciones neutras de sales como el cloruro de sodio, y para permanecer en solución las globulinas necesitan una cierta concentración de sal, precipitando cuando el contenido de sal disminuye. Las proteínas coaguladas son insolubles en agua, soluciones salinas, ácidos y álcalis diluidos. Se disuelven en los ácidos minerales y álcalis fuertes, los que las hidrolizan, desdoblándolas a sus correspondientes aminoácidos. El punto clave para entender la precipitación de las proteínas es que la proteína es una molécula cargada tanto positiva como negativamente, y que por consiguiente pueden reaccionar se entre sí o con iones de cargas opuestas o con el agua. Podemos, por tanto, señalar tres tipos de interacciones de una proteína en solución. A.- proteína-proteína, B) proteína-agua, C) proteína-iones pequeños. Si la interacción proteína-proteína es grande y la interacción proteína-agua es pequeña la proteína tenderá a ser insoluble. Si la situación es la contraria, o sea que predominan las interacciones proteína-agua,

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entonces las proteínas tienden a ser solubles. Por consiguiente, cualquier cosa que aumente o favorezca la interacción proteína.proteína o disminuya la interacción proteína-agua, disminuirá la solubilidad de la proteína, favoreciendo su precipitación y cualquier cosa que disminuya la interacción proteína.proteína y aumente la proteína-agua, aumentará la solubilidad de la proteína. Precipitación por Salación (salting out) Si disminuye la concentración efectiva del agua, en una solución proteica añadiendo una sal muy soluble, se aumentará la interacción proteína-proteína, favoreciéndose la precipitación de la proteína. La gran cantidad de sal estará robándole a la proteína las moléculas de agua que la solubilizan. Como las proteínas varían en la proporción de cargas superficiales, las distintas proteínas precipitarán a distintas concentraciones de sal, proporcionando esto un método para lo que se llama la “precipitación diferencial” de las proteínas. El procedimiento en general se llama en inglés “salting out” En español se llamado de varias formas, siendo el más empleado el “salado”. La sal más empleada para este efecto es el Sulfato de Amonio. Una solución saturada de Sulfato de Amonio es aquella que tiene 75 gramos de sulfato de amonio por 100 ml. de agua

Precipitación por Solventes Orgánicos

Al añadir solventes orgánicos como Etanol o Acetona, a una solución acuosa de proteínas, se baja la constante dieléctrica del agua disminuyendo efectivamente la interacción proteína-agua y aumentando la interacción proteína-proteína, favoreciendo así la precipitación. Si esto sucede arriba de cero grados, las proteínas se desnaturalizan, de ahí que este tipo de precipitación cuando se usa para purificar proteínas con actividad biológica como las enzimas, se tenga que hacer a bajas temperaturas. En este tipo de precipitación sí hay que tener en cuenta factores como pH, electrolítos, presencia de metales pesados, etc., pues pueden tener efecto en la precipitación.

Precipitación por formación de sales

Las proteínas precipitan de sus soluciones por algunas sales de metales pesados como cloruro de mercurio, nitrato de plata, sulfato de cobre, etc. El ión del metal pesado muy probablemente se combina con la forma aniónica de la proteína. La proteína en el lado alcalino de su punto isoeléc trico, existe como ion negativo , y así, al combinarse con el ión del metal o catión formará lo que podríamos llamar “Proteinatos”, por ejemplo proteinato de mercurio, proteinato de plata, etc.

En cambio los reactivos llamados “reactivos alcaloidales”, que son ciertos ácidos como el pícrico, el fosfotungstico, el tannico, el metafosfórico, etc., precipitan la proteína al combinarse el radical ácido del reactivo, con la forma catiónica de la proteína que predomina en el lado ácido de su punto isoeléctrico. Se forma entonces un precipitado que podríamos llamar, por ejemplo: Tannato de proteína, fosfotungstato de proteína, tricloroacetato de proteína.

La mayoría de las globulinas animales se precipitan con sulfato de amonio al 50 % de saturación. Las albúminas se precipitan con soluciones de sulfato de amonio al 100 % de saturación. Esto nos da la oportunidad de separar las albúminas de las globulinas. De hecho la precipitación por salación es aun más fina, ya que dentro del grupo de las globulinas se puede llegar a una separación o fraccionamiento de proteínas, son solo variar la concentración de sulfato de amonio.

Precipitación isoeléctrica

Una manera muy sencilla de precipitar a las proteínas es el ajustar el pH de su solución a su punto isoeléctrico. Se forma entonces un precipitado reversible, que se disolverá tanto del lado alcalino como del lado ácido del punto isoeléctrico. En el punto isoeléctrico de la proteína la carga neta es cero, favoreciéndose entonces la precipitación por ser ese el punto de menor solubilidad en el agua.

Reacción de Biuret

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El Biuret es un reactivo de sulfato de cobre diluido en álcali fuerte. Es un reactivo muy bueno para demostrar presencia de proteínas e incluso cuantificarlas. La prueba la dan positiva todos los componentes que tengan dos o más uniones peptídicas, por lo cual es propia para Proteínas y péptidos.

La intensidad del color de la reacción es proporcional a la cantidad de proteína en la muestra. El color azul morado de la reacción positiva se debe a un complejo de coordinación entre el catión divalente de cobre y cuatro átomos de nitrógeno, dos de cada cadena peptídica. Los dipéptidos y los aminoácidos no dan positiva la reacción, excepto treonina y serina. Esta reacción requiere relativamente grandes cantidades de proteína, de 1 a 5 miligramos, para la formación del color.

Para demostrar la precipitación proteica con solventes orgánicos se utiliza el etanol. Aquí se puede ver la influencia del pH en este tipo de precipitación

La precipitación con metales pesados y con reactivos alcaloidales dará un precipitado más o menos grueso.

La precipitación por punto isoeléctrico se puede demostrar con una solución de Acetato de caseina 0.1 N. Utilizando la fórmula de Henderson-Hasselbach se podrá calcular el pH de cada uno de los tubos y así determinar el punto isoeléctrico de la caseina.

Si no se dispone de bolsas de diálisis se puede hacer la prueba del Biuret con la proteína precipitada con Sulfato de Amonio .La cantidad de sal interfiere un poco con la aparición del color, pero si se trata de una prueba cualitativa solamente no habrá problema

PRACTICA 7: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ACI DOS NUCLEICOS

(DOS SESIONES)

Los procedimientos que se practicarán en esta sesió n de Laboratorio son los siguientes: . Aislamiento de los Acidos Nucléicos a partir de hígado de res. . Separación de ácidos Deoxiribonucléicos y Ribonucléicos. . Reacción de Bial para identificación de ácido Ribonucléico. . Reacción de Dische para identificación de ácido Deoxiribonucléico. Es responsabilidad del alumno consultar los libros de texto para conocer los fundamentos científicos de cada uno de los procedimientos arriba mencionados antes de hacer la práctica. En la ‘Hoja de Datos’ deberá mencionar esos fundamentos. Se puede convenientemente dividir la práctica en dos sesiones, en la primera se hace el aislamiento de los ácidos nucléicos a partir del hígado de res, y en la segunda se separan y se identifican.

Revisión de Conceptos

. Poliribonucleótidos

. Acido Deoxiribonucléico

. Acido Ribonucléico

. Doble hélice WatsonCrick

El alumno debe tener clara la manera en que se forma la doble hélice de Watson-Crick, y cuales son sus características .

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MATERIAL NECESARIO PRIMERA PARTE. SEGUNDA PARTE Cuba para hielo Cuba para hielo Vaso de precipitados de 600 ml. 10 tubos de ensaye de 13 x 100 Vaso de precipitados de 100 ml. Vaso de precipitados de 250 ml. Probeta de 50 0 100 ml. 2 pipetas de 5 ml. Erlenmeyer de 250 ml. con tapón Pipeta de 1 ml. Embudo Gradilla Tubo de ensaye de 15 x 150 Mechero, tripie y tela de asbestos Mechero, tripie y tela de asbestos. Escobetilla. Además: Cada grupo se responsabilizará de traer para la primera parte unos 15 gramos de Hígado de Res. Se pueden juntar varios grupos para traer el hígado necesario para todos los grupos. Traer también con qué cortar el hígado: navaja, tijeras o cuchillo. Tanto para la primera como para la segunda parte se necesita Hielo También aquí se pueden juntar varios grupos para comprarlo.

P R O C E D I M I E N T O AISLAMIENTO DE ACIDOS NUCLEICOS 1. Prepare un recipiente con hielo, suficientemente grande, e introduzca en él un vaso de precipitados de

100 ml, sumergido completamente en el hielo. Enfríe también ahí 40 ml. de Cloruro de Sodio al 10 %, colocados en su Erlenmeyer de 250 ml.

2. Así mismo con su mechero, tripie y tela de asbestos y un vaso de precipitados de 600 ml., prepare un baño

de agua hirviendo. No llene todo el vaso y use agua destilada. 3. Pese 10 o 15 gramos de hígado de res. 4. Córte el hígado con tijeras, cuchillo o navaja, en fragmentos lo más pequeños posible y viértalos

directamente al vaso de precipitados de 600 ml. que está en el baño de hielo. 5. Añada al vaso de precipitados los 40 ml. de Cloruro de Sodio al 10 % helado. Viértalo todo a la licuadora. 6. Conecte la licuadora y homogenice el hígado por 30 segundos. Vierta el homogenado a una probeta para

medir el volumen obtenido 7. Vierta el homogenado al Erlenmeyer de 250 ml. Tápelo sin apretar y llévelo al baño de agua hirviendo.

Déjelo por 30 minutos. 8. Filtre la suspensión caliente a través de fibra de vidrio hacia una probeta para medir el volumen de filtrado

obtenido. Deje que se enfríe. Lo grueso que queda en la fibra de vidrio se descarta.

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9. Pase el filtrado a un vaso de precipitados de 100 ml. y añada 2.5 volúmenes de Etanol de 95% (Por ejemplo si se obtuvieron 20 ml. de filtrado, se añadirán 50 ml. de etanol). Mezcle bien y deje reposar por 10 minutos. Los Acidos Nucléicos se sedimentan.

10. Decante lo más posible de la solución sobrenadante, sin dejar que se vaya ningún sólido y luego filtre. El

precipitado de Acidos Nucléicos queda en el filtro. 11. Lave el precipitado en el mismo papel filtro, primero con 10 ml. de alcohol de 95 % y luego con 10 ml. de

éter etílico agregándolos despacio. Deje secar el precipitado al aire. 12. Transfiera el precipitado a un tubo de ensaye de 15 x 150. Añada 4 ml. de Hidróxido de Sodio 1,0 N.

Suspenda bien el precipitado. Tape el tubo y déjelo reposar toda la noche o hasta la siguiente sesión de Laboratorio.

13. Anote sus resultados y observaciones en la ‘Hoja de Datos’. El procedimiento que acaba de terminar es el: SEGUNDA PARTE Separacion de los dos tipos de Acidos Nucléicos 1. Prepare un baño de hielo como en la parte anterior y enfríe en él, por cinco o diez minutos el tubo de

ensaye donde están los ácidos nucleicos tratados con álcali. 2. Sin sacar el tubo de ensaye del baño de hielo, agréguele 4.0 ml. de Acido Tricloroacético al 5%, y 2.0 ml. de

Acido Clorhídrico 6.N 3. Centrifugue la suspensión, repartiéndola si es necesario en dos tubos. 4. Decante cuidadosamente el sobrenadante, que contiene el ARN hidrolizado y consérvelo para terminar de

tratarlo como se indica en el número 7. 5. El precipitado contiene el ADN no hidrolizado. Lave ese precipitado con 3.0 ml. de agua y una gota de

ácido clorhídrico 6.N. Vuelva a centrifugar y descarte el lavado. 6. Disuelva este precipitado en 5.0 ml. de Hidróxido de Sodio 1.0 N. Esta es su fracción de ADN. A esta

fracción se le hará la prueba de Dische. A esta fracción se le hará la prueba de Dische. 7. Del sobrenadante obtenido en el número 4 pase 2.0 ml. a un tubo de ensaye de 13 x 100 y añádale 5.0 ml.

de Etanol de 95 %. Cubra el tubo y mezcle por inversión. (Si la solución se vuelve turbia, enfríela en baño de hielo por 10 minutos y vuelva a centrifugar. Este tratamiento quita el Glucógeno que pueda haber y que interferiría con la reacción de Bial)

8. Esta es su fracción de RNA. A esta fracción se le hará la prueba de Bial. Lo que acaba de terminar es la: Reacción de Bial Con su mechero, tripie y tela de asbestos y su vaso de precipitados de 250 ml. prepare un baño de agua hirviendo, de la manera acostumbrada.

Aislamiento de todos los Acidos Nucléicos.

Separación de los Acidos Ribonucléicos y los Deoxiribonucléicos

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1. Coloque en su gradilla tres tubos de ensaye de 13 x 100 e idéntifíquelos de alguna manera. 2. Pipetee 2.0 ml. de la ‘fracción de RNA’ al tubo número uno. 3. Pipetee 2.0 ml. de la ‘fracción de DNA’ al tubo número dos. 4. Pipetee 2.0 ml. de agua destilada al tubo número tres. 5. Agregue 5.0 ml. del Reactivo de Bial ya preparado a cada uno de los tres tubos. Mezcle el contenido de

los tubos por agitación y déjelos en el baño de agua hirviendo por 10 minutos. 6. Observe la aparición de un color verde, que significa la reacción positiva. El único tubo que la dará es el que

contiene la ‘fracción de RNA’. 7. Anote sus resultados y observaciones en la ‘Hoja de Datos’. Lo que acaba de demostrar es la: Reacción de Dische (tambien se conoce como la reacción de la Difenilamina)

1. Coloque en su gradilla tres tubos de ensaye de 1 3 x 100 e identifíquelos de alguna manera. 2. Pipetee 2.0 ml. de la ‘fracción de ADN’ al tubo número uno. 3. Pipetee 2.0 ml. de la ‘fracción de ARN’ al tubo número dos. 4. Pipetee 5.0 ml. del Reactivo de Dische, ya preparado, a cada uno de los tres tubos. Mezcle bien el

contenido de los tubos y déjelos en el baño de agua hirviendo por 15 minutos. 5. Observe el color azul violaceo que aparece en la reacción positiva. Solamente un tubo debe darla positiva. 6. Anote sus observaciones y resultados en la ‘Hoja de Datos’.

Lo que acaba de practicar es la:

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

Cloruro de Sodio al 10 % (1 litro) Pesar 100 gramos de Cloruro de Sodio, Disolverlos en 1 litro de Agua Destilada. Etanol al 95 % (2 litros) Eter Etílico (200 ml.) Hidróxido de Sodio 1.0 N (250 ml.) Pesar 10 gramos de Hidróxido de Sodio,

Reacción de BIAL

Reacción de DISCHE o de la

difenilamina

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Aforarlos a 250 ml. con Agua Destilada Acido Tricloroacético al 5% (100 ml.) Pesar 5 gramos de Acido Tricloroacético Aforarlos a 100 ml. con Agua Destilada. Acido Clorhídrico 6.0 N (100 ml.) Medir 50 ml. de Acido Clorhídrico concentrado, Aforarlos a 100 ml. con Agua Destilada. Reactivo de Bial (350 ml.) Igual que en la práctica número uno pero a doble cantidad. Reactivo de Dische (350 ml.) Pesar 8.75 gramos de Difenilamina, Disolverla en 350 ml. de Acido Acético Glacial Agregar 9.0 ml. de Acido Sulfúrico concentrado Si se prepara con cierto tiempo de anticipación, se guarda en el refri- Gerador y se saca un par de horas antes de usarla. Nota: Si la Difenilamina no está blanca hay que recristalizarla, disol- viéndola en alcohol de 70 %, calentándola y dejándola crista- lizar en frío. DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS

EXPERIMENTO 7

Aislamiento de Ácidos Nucleicos

Gramos de Hígado de Res Originales _______________ _

Volumen Obtenido después de la Homogenización _____ ________________ Volumen de filtrado después del calentamiento _____ ______________

Separación de Acidos Nucleicos

Volumen de la ‘fracción de ARN’ _________________ Volumen de la ‘fracción de ADN’_________________

Reacción de Bial

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Tubo No. Color Tiempo 1 ___________ ___________ 2 ___________ ___________ 4 ___________ ___________

Reacción de Dische

Tubo No. Color Tiempo 1 ___________ ___________ 2 ___________ ___________ 3 ___________ ___________

FUNDAMENTO DE LOS PROCEDIMIENTOS Escriba brevemente el fundamento científico de los procedimientos y reacciones aquí practicadas. Si es necesario consulte su libro de texto.

Aislamiento de los ácidos nucleicos Separación de los Acidos Nucleicos. Reacción de Bial Reacción de Dische.

CUESTIONARIO

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1. ¿Qué diferencia hay entre la estructura y función del DNA y la estructura y función del RNA? 2. ¿Cuál de los ácidos nucleicos tiene mayor peso molecular y cual menor y por qué? 3. ¿Porqué los primeros pasos que se siguen para aislar ácidos nucleicos hay que hacerlos entre cero y

cuatro grados de temperatura? 4. Le conviene tener clara y precisa la estructura molecular de la Doble Hélice del DNA con todas sus características. Así mismo la estructura de los Ribosomas y de los RNA de transferencia. Anótelas.

LECTURAS EXPERIMENTO 7

Ácidos Nucleicos es una expresión que designa a todo un conjunto de moléculas con estructura general de poliribonucleótidos y polideoxiribonucleótidos. Sin embargo no todas estas moléculas se encuentran en el núcleo de la célula como el nombre lo haría esperar. Sin embargo el término Acidos Nucléicos se sigue empleando universalmente para designar a todo este conjunto de moléculas, prescindiendo de su localización particular en las células. El Acido Desoxiribonucleico o ADN (DNA en inglés), es el material genético de las células. Es un polideoxiribonucleotido capaz de replicarse, y que en su molécula tiene codificadas a todas las características de los demás constituyentes de la célula, y en esa forma, se puede decir, que tiene el control de todos los procesos vitales. Cada molécula de ADN está formada por dos cadenas sencillas complementarias, unidas entre sí por puentes de hidrógeno, para formar la doble hélice propuesta por Watson y Crik. Lo que forma la columna vertebral de cada cadena sencilla de ADN es una cadena polimérica de 2-deoxiribosas unidas entre sí por uniones fosfodiester, del hidroxilo 3 de un monómero al hidroxilo 5 del siguiente monómero. En la posición 1 de cada deoxiribosa hay una base nitrogenada, que puede ser púrica (adenina o guanina), o pirimidínica (citosina o timina). El acido Ribonucleico o ARN (RNA en ingles), tiene dos diferencias básicas con el ADN. El carbohidrato es Ribosa en vez de deoxiribosa, y Uracilo sustituye a Timina como una de las bases pirimidínicas. Sin embargo Uracilo también puede unirse a Adenina. La molécula de ARN actúa en el proceso de traducción del mensaje genético a estructura proteica, y así, es indispensable para la síntesis de todas las proteínas celulares. Este proceso es muy complicado y requiere de tres distintos tipos de ácidos ribonucleicos: el ARN mensajero (ARNm), el ARN ribosomal (ARNr) y los ARNs de transferencia (ARNt). Cada uno de estos tres tiene su composición, estructura y función particular.

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El ADN es de muy alto peso molecular, y es una doble hélice de estructura más o menos rígida. Esto tiene como consecuencia que las soluciones de ADN sean extremadamente viscosas y que baste calentar las soluciones para que disminuya esa viscosidad, debido al rompimiento de los puentes de hidrógeno que unen a las dos cadenas. El ARN tiene pesos moleculares menores y por lo general es de cadena sencilla, lo cual hace que las soluciones de ARN sean mucho menos viscosas. Para aislar a los Acidos Nucleicos, libres de otros componentes tisulares, se siguen normalmente los siguientes pasos: a) rotura de las membranas celulares por Homogenización, b) Desnaturalización y remoción de las proteínas y c) precipitación de los ácidos nucleicos. Todos los pasos hasta antes de la desnaturalización de las proteínas, deben llevarse al cabo a cero grados centígrados, para evitar la acción de las enzimas nucleasas, que romperían las cadenas y evitarían el aislamiento de los ácidos nucleicos como tales. El ADN es estable a la acción del Hidróxido de Sodio 1.0 N mientras que el ARN se hidroliza fácilmente, debido a la rpesenbcia del hidroxilo en el carbono dos de la ribosa. Esto da la posibilidad de separar a ambos cuando están en mezcla. Para extraer a los ácidos nucléicos de los tejidos se puede usar las soluciones de sales neutras o los álcalis, o con fenol. Una vez extraidos se pueden precipitar con alcohol o ácido. La identificación se hace por reacciones de color. Reacción de Bial Esta reacción se describe en el experimento uno, y con fruto se puede ir nuevamente a consultar las lecturas de ese ejercicio, para estar seguro de que se conocen los fundamentos de la reacción. La intensidad del color verde de la reacción se puede usar para mediciones cuantitativas, a un máximo de absorción de 620 nanómetros.

Reacción de Dische (Difenilamina) En esta reacción se produce un color azul debido a la presencia de la 2-deoxiribosa. El intermediario responsable del color azul es el aldehido omega-hidroxilevulínico, al que se convierte la deoxiribosa por la acción del ácido acético o sulfúrico. El hidroxilevulaldehido se condensa con la difenilamina para dar el color azul. Toda sustancia que dé un compuesto aldehídico como intermediario, dará positiva la reacción. La fructosa que por la acción del ácido da Hidroximetilfurfural, produce un color verde con este reactivo La intensidad del color azul de la reacción positiva se puede usar para mediciones cuantitativas. El máximo de absorción es de 595 nanómetros. Los reactivos de Bial y Dische se pueden aplicar directamente a las soluciones de ARN y ADN, porque los ácidos fuertes que se emplean en estos reactivos hidrolizan a los nucleótidos, y los azúcares liberados reaccionan con los reactivos cromogénicos, para dar el color. Los azúcares unidos a las bases en los nucleotidos NO dan positiva la reacción.

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Para hacer las reacciones cuantitativas se deben tener los patrones puros para poder comparar las intensidades de color. Para ARN se puede usar como patrón a la Ribosa pura, mientras que para el ADN se tiene que usar un patrón de ADN purificado. Hay que tener cuidado con las reacciones cruzadas. La deoxiribosa reacciona ligera pero mediblemente con el reactivo de Bial, así que el cálculo colorimétrico de ARN en presencia de ADN debe tener en cuenta la absorbancia contribuida por el ADN. En cambio la reacción de Dische para el ADN en presencia de ARN no tienen ninguna interferencia. Para preparar los estándares basta hacer soluciones de 50 a 250 microgramos por mililitro. Para hacer un análisis verdaderamente cuantitativo hay que sacar la proporción del fósforo y de las bases para obtener el verdadero porcentaje de ribosa y deoxiribosa.

PRÁCTICA 8: ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA SOBRE L A LECHE HOMOGENIZADA

Revisión de conceptos

� Hidrólisis de lípidos

� Pancreatina

El alumno debe revisar cómo se lleva al cabo la hidrólisis de los lípidos, cuáles son sus productos y sus condiciones.

Este es un ejercicio muy sencillo con el cual se demostrará la acción enzimática de la lipasa Pancreática. Se deducirá la hidrólisis de los lípidos y la existencia de los productos, en forma titrimética.

MATERIAL NECESARIO 5 tubos de ensaye de 15 x 150 1 gradilla 5 vasos de precipitados de 250 ml. 1 bureta para titulación.

Cada grupo se responsabilizará de traer a la práctica la leche homogenizada. Como cada grupo va a requerir solamente 50 ml. se puede poner de acuerdo todo el grupo para ver quien la trae para todo el grupo.

PROCEDIMIENTO

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1. Coloque en su gradilla 5 tubos de ensaye de 15 x 150 y numérelos de alguna manera para su identificación. 2. Añada 10 ml. de leche homogenizada a cada uno de los cinco tubos. 3. Añada 3.0 ml. de Pancreatina al 1 % a cada uno de los cinco tubos, y agítelos 4. Inmediatamente vacíe el contenido del tubo 1 a un vaso de precipitados de 250 ml. que ya contenga 25 ml. de alcohol etílico de 95 grados. 5. Lleve los demás tubos a un baño de agua a 37°C anotando la hora exacta. 6. Agite bien el contenido del primer vaso de precipitados. Añádale 0.5 ml. de fenoftaleina y titúlelo con KOH al 0.05 N hasta un color rosa permanente. 7. A los 10 minutos saque el tubo 2 del baño, vacíe su contenido a otro vaso de precipitados con 25 ml. de alcohol etílico. Añádale 0.5 ml. de Fenoftaleina y titúlelo de la misma manera que en el caso anterior. 8. A los 20 minutos saque el tubo número 3, a los 30 minutos el tubo número 4 y a los 40 minutos el tubo número 5. Deles el mismo tratamiento que el tubo número 1. 9. El tubo número 1 es el testigo, por lo tanto para obtener los valores que va a reportar tiene que restarle a todos los tubos, el valor obtenido en el tubo 1. 10. Calcule los ml. de KOH consumidos en cada tubo. En este ejercicio se demostró en forma titrimética, la Acción Enzimática de La Lipasa Pancreática.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS.

Pancreatina al 1 % (200 ml.) Pancreatina…………………..2 gramos Agua destilada……………… 200 ml. Para disolver la pancreatina hay que usar agitación suave y es preferible Disolverla en Buffer de Fosfatos p11 7.4 (ver el ejercicio anterior) Checar el pH y ajustarlo, si es necesario, a 7.4

Fenolfaleina al 0.1 % (50 ml.) Fenoftaleina ………………..50 miligramos Etanol de 70 % …………….50 ml.

Hidróxido de Potasio al 0.05 N (3 litros) Hidróxido de Potasio ………8.4 gramos Agua Destilada ……………...3 litros.

Alcohol etílico de 95 % (1.5 litros)

DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS

EXPERIMENTO 8

Tubo ml. de KOH consumidos en la titulación ml. de KOH después de restar el testigo.

1 _____________________________ _____________________________

2 _____________________________ _____________________________

3 _____________________________ _____________________________

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4 _____________________________ _____________________________

5 _____________________________ _____________________________

FUNDAMENTO DE LA REACCIÓN

Fundamento de la reacción de la Lipasa

Fundamento de la determinación titrimétrica

CUESTIONARIO

1. ¿Porqué podemos usar leche homogenizada en este ejercicio?

2. ¿Por qué el KOH consumido en la titulación, aumenta en cantidad a medida que el tiempo de incubación es mayor?

LECTURAS PRÁCTICA 8

Entre las clases de enzimas que catalizan la hidrólisis de diversos ésteres hay diferencias entre las lipasas y las esterasas. Esta diferencia se basa en su especificidad preferencial selectiva. Los sustractos naturales de las lipasas son aceites o grasas, o sea triacilgliceroles de ácidos grasos de cadena larga, mientras que los sustractos naturales de las Esterasas, son los ésteres de dos de bajo peso molecular. Las dos clases de enzimas son sumamente específicas en cuanto a la naturaleza del ácido graso o del alcohol, que tienen efecto no en la especificidad sino en la velocidad de la reacción.

La hidrólisis de los triacilgliceroles que consumen los animales superiores se lleva al cabo principalmente en el intestino delgado, por medio de enzimas lipolíticas elaboradas en el Páncreas. Las lipasas pancreáticas existen en dos tipos: las específicas para romper la unión éster en posición alfa a prima de los triglicéridos, y las específicas para las uniones beta. La hidrólisis completa de los triacilgliceroles procede entonces por pasos. ro se hidrolizan rápidamente las uniones alfa y alfa prima, y luego lentamente se rompen las uniones beta.

Estas reacciones se aceleran con las sales biliares como Taurocolato o glucocolato de sodio, que emulsifican y solubilizan a los lípidos. Las sales se producen en el hígado, se almacenan en la vesícula biliar y al momento de las comidas se vierten al intestino delgado inducidas por la hormona Colecistocinina, que se sintetiza en el mismo intestino delgado.

La lipasa (E.C. 3.1.1.3.) tiene el nombre técnico de Triacil Glicerol acilhidrolasa. Antiguamente se llamaba Esteapsina. Se extrae de diferentes fuentes biológicas. Contiene siempre diversas fracciones proteicas de muy diversas masas moleculares, que van desde 39,000 hasta 200,000 faltones, todas ellas con actividad lipolítica.

Estas esterasas hidrolizan sustractos hemulsificados y no atacan a sustractos en veraddera solución. Se cree que esto se debe a que la enzima se adsorbe a su sustracto emulsificado, y la velocidad inicial de reacción está en función del número de moléculas de enzima adsorbidas en la interfase. Se le llama Pancreatina a un extracto de pandreas con fuerte actividad lipolítica. La actividad enzimática se mide por titulación de la cantidad de ácidos grasos liberados de los ésteres. Es necesario trabajar con emulsiones de los sustractos. Uno de los emulsificantes más comúnmente empleados es el Alcohol Polivinílico

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(PVA), pero se pueden usar otros emulsificantes como bentonita, goma arábiga, Oleato de sodio etc. El uso de la leche liomogenizada es fácil y da excelentes resultados para mostrar la actividad de las lipasas, puesto que en la leche homogenizada ya están las grasas emulsificadas y vienen en glóbulos finamente divididos. Consiguientemente en este caso no habrá necesidad de una emulsificación.

PRÁCTICA 9: HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE PROTEINAS POR LA ACCIÓN DE LA TRIPSINA

Revisión de conceptos: - Hidrólisis enzimática de las proteínas. - Productos de la hidrólisis - Método para medirlos

El alumno debe recordar bien lo que es una hidrólisis enzimática. Así mismo debe recordar la composición de la Gelatina.

En este ejercicio se demostrará la acción enzimática de una enzima que hidroliza a las proteínas, la tripsina. El ejercicio es parecido a los anteriores pero en este caso se trata de una Proteasa. MATERIAL NECESARIO.

1 Vasos de precipitados de 250 ml. 5 Matraces Erlenmeyer de 250 ml. 1 Probeta de 50 o 100 ml. Bureta con soporte y pinzas

2 Pipetas de 10 ml Gotero Agitador Mechero

El alumno deberá traer una hoja de papel milimétrico para graficar los resultados.

PROCEDIMIENTO

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1. Mida en su probeta 50 ml. de Gelatina al 5 % (conservada en estado líquido en baño maría), y vacíelos aun vaso de precipitados de 250 ml. 2. Añada 10 ml de solución de Tripsina al 0.2 % y agite por dos segundos. 3. Lleve INMEDIATAMENTE, la mezcla a un baño maría de 37°C y anote la hora exacta

4. Tome inmediatamente 10 ml. en un erlenmeyer de 250 ml. y llévelo a fuego directo por dos minutos. (Con mucho cuidado para que no vaya a saltar la mezcla y se desperdicie. Si es necesario use pinzas de tubo de ensaye para sostener al erlenmeyer.) Enfríe con agua de la llave y añada 15 ml. de solución de formol neutralizado y 5 gotas de fenoftaleína. Esta será la muestra de cero tiempo. 5. A los diez minutos de que la mezcla de reacción esté en el baño a 37°C tome otra muestra de 10 ml. y proceda con el mismo tratamiento que a la muestra de cero tiempo. 6. A los 20 minutos saque otros 10 ml. A los 30 minutos, otros diez, y los últimos l0 ml. a los 40 minutos. A todas las muestras se les da el mismo tratamiento que a la muestra de cero tiempo. 7. Titule las cinco muestras con hidróxido de sodio al 0.02 % hasta que aparezca un color rosa permanente. Tenga mucho cuidado para que el color sea igual en las cinco titulaciones. En este ejercicio se aprendió a detectar en forma titrimétrica la: Hidrólisis enzimática de las Proteínas.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

Gelatina al 5 % (1 litro) Gelatina …………………………………………. 50 gramos Solución amortiguadora de fosfatos pH 7.4 …….. 800 ml. Agua Destilada hasta aforar a …………………….1 litro. Esta gelatina se debe mantener líquida en baño de agua caliente hasta el momento de hacer la práctica.

Solución amortiguadora de fosfatos pH 7.4 (1.5 iltros) Solución de Fosfáto disódico 0.06 M ……………1,2 12 ml. Solución de Fosfato monopotásico 0.06 M ………. 138 ml. Agua Destilada …………………………………….150 ml. Checar el pH y ajustarlo si es necesario.

Fosfato Disódico 0.06 M (1.5 litros) Fosfato Disódico (Na2HPO4. 12 H20)……… 32.22 gramos Agua destilada, hasta aforar a ………………….1 .5 litros.

Fosfato Monopotásico 0.06 M (200 ml.)

Fosfato Monopotásico (KH2PO4). . . 1.63 gramos Agua destilada 200 ml.

Tripsina al 0.2 % (250 ml) Tripsina……………………………………………....0.5 gramos. Solución Amortiguadora de fosfatos……..…….…..250 ml.

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Formol neutralizado (1 .5 litros) Formaldehido Comercial (30-40%) ………………...........1 .5 litros Fenoftaleina ………………………………………….......25 ml. Hidróxido de sodio 0.2 N...........Hasta que la mezcla adquiera un color Rojo violeta pálido permanente por 30 segundos. (Se requieren aproximadamente unos 75 ml.)

Hidróxido de sodio 0.2 N (100 ml). Hidróxido de sodio............................................................. 800 miligramos. Agua destilada.....................................................................100 ml.

Hidróxido de sodio 0.02 N. (5 litros) Hidróxido de sodio.............................................................4.0 gramos Agua Destilada................................................................... 5 litros.

Fenolftaleína (100 ml.) Fenoftaleína.......................................................................100 miligramos. Alcohol de 70 %................................................................ 100 ml.

DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS

Muestra a Solución de NaOH 0.02 Cantidad de NaOH deducidos el tiempo 0

0 min. ______________ _______________

10 min. ______________ _______________

20 min. ______________ _______________

30 min. ______________ _______________

40 min. ______________ _______________

En una hoja de papel milimétrico aparte trace una gráfica poniendo en las ordenadas el volumen de álcali gastado y en las abscisas el tiempo de la reacción. En la misma gráfica trace otra curva de tiempo contra nitrógeno de aminoácidos tomando en cuenta que 1 ml de solución de hidróxido de sodio 0.1 N es equivalente a 1 .4 miligramos de nitrógeno amínico.

Muestra a Nitrógeno amínico mgs. 0 min. _______________

10 min. _______________

20 min. _______________

30 min. _______________

40 min. _______________

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FUNDAMENTO DE LA REACCION

Fundamento de la reacción de la tripsina.

Fundamento de la metodología para detección de la actividad enzimática de la tripsina. CUESTIONARIO 1. ¿Qué es la gelatina, utilizada como sustracto en este ejercicio?

2. ¿Es la gelatina un buen alimento? Porqué si o por qué no.

3. ¿Qué es la avidina, dónde se encuentra y que relación tiene con la tripsina?

4. ¿Cuál es el mecanismo de acción de la tripsina?

5. Enumere por lo menos 5 enzimas proteolíticas, señalando su acción específica.

6. ¿Qué es un zimógeno y cuáles son los medios para activarlo?

7. ¿Cuál es el zimógeno de la tripsina?

LECTURAS PRACTICA 9

La Tripsina (E.C. 3.4.21.4.) forma parte de un grupo de enzimas “serina proteasas”. Se llaman así por tener una Serina en el sitio activo, serina que es esencial para la actividad de la enzima. En este grupo de enzimas, además de la Tripsina, se consideran entre otras, la Quimotripsina (EC. 3.4.21.1.), la Ulastasa (E.C. 3.4.21.11.), la Trombina (E.C. 3.4.21.5.), la Subtilisina (E.C. 3.4.21.14.), así como enzimas que no son propiamente proteolíticas, como la fosforilasa (E.C. 2.4.1.1,) y la Fosfatasa Alcalina (liC. 3.1.3.1.). La Tripsina hidroliza péptidos, amidas, ésteres, etc., en las uniones que involucran al grupo carboxilo de L-Arginina o L-Lisina. Es una proteasa de las más específicas. En los animales superiores se sintetiza en Páncreas en forma de Tripsinógeno, que es la forma inactiva o precursor de la Tripsina misma. El Tripsinógeno es una proteína de masa molecular de 24,000 daltons, que cuando pierde sus seis primeros aminoácidos del término amino, por la acción de la Enterocinasa, o por otra molécula de Tripsina ya activada, se convierte a Tripsina activa, proteína de masa molecular 23,281 daltons. Actualmente se conoce perfectamente su secuencia de aminoácidos, su estructura terciaria y su mecanismo de acción. La actividad enzirnática de la tripsina se puede inhibir por ciertas a sustancias como la p-aminobenzidina, la acetamida, la fenilacetamida, la etilamina, la butilamina, etc. El calor también inhibe a la enzima, pero la inhibición por calor, o desnaturalización es irreversible. Por otro lado los compuestos organofosforados como el dietilo de paranitrofenilfosfato (DPF), la inhiben específica y totalmente como a todas las esterasas. Estos compuestos inhiben a la tripsina de la misma manera que lo hacen con la enzima colinesterasa y acetilcolinesterasa.

El colágeno es la proteína estructural del tejido conjuntivo. Es el principal componente de los tendones, huesos y ligamentos. En la piel se encuentra en la dermis, mientras que la queratina está en las capas de la epidermis. La queratina puede solubilizarse por reducción de sus puentes disulfhídricos, separándose así las cisteínas unidas que estaban unidas entre si. El colágeno se hace entonces soluble. Si el colágeno se calienta por largo tiempo con agua, se solubiliza y se convierte en la proteína conocida como Gelatina. Esta conversión parece que encierra la hidrólisis de algunas uniones peptídicas débiles.

61

La gelatina tiene una masa molecular promedio de 60,000 daltons. Las soluciones de gelatina son muy viscosas y forman geles duros a temperatura ambiente, cuando están en concentraciones de más del 2 %. La formación de estos geles depende del pH y de la fuerza iónica de la solución. La gelación se atribuye a la formación de uniones de hidrógeno entre pares de uniones peptídicas. Entre glicina (26.1 %), Prolina (13 %), Hidroxiprolina (13.6 %), y ácido glutámico (11%), está el 63 % de los aminoácidos del colágeno y de la gelatina. Pero no existe triptófano. El contenido de arginina es de 8.3 % y el de Lisina es de 3.6 %. La tripsina al romper las uniones peptídicas de la gelatina va dejando grupos carboxilo libres. Mientras más tiempo actúa la enzima, más grupos 1carboxilo titulables habrá en la solución. El formol neutralizado se añade para que se una con los grupos amino libres no cargados, y hacer más exacta la titulación de los grupos carboxilo. Como desde el principio del experimento, aun sin actuar la enzima puede haber grupos carboxilo titulables, se necesita tener una muestra de cero tiempos, para restar el valor inicial de cero tiempo a todos los demás valores que se obtengan de la acción de la enzima.

PRACTICA 10: PRESENCIA DEL ÁCIDO CÍTRICO Y TARTÁRIC O EN TEJIDOS VEGETALES

OBJETIVO Identificación cualitativa del ácido cítrico y tartárico en tomate. INTRODUCCION. En las plantas superiores actúan simultáneamente el ciclo de los ácidos tricarboxilicos como el del glioxilato; el primero para proporcionar energía mediante la fosforilación oxidativa y el segundo para proporcionar succinato destinado a la formación de un nuevo glúcido procedente de las grasas. Las reacciones del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en las plantas superiores se hallan localizadas en las mitocondrias. La actividad del complejo deL piruvato deshidrogenasa, que aporta la porción principal de! acetil CoA que se incorpora al ciclo, resulta disminuida por la fosforilación del ATP dependiente del componente deshidrogenásico, y es activado por la fosforilación del fosfoenzima. La condensación del acetil CoA con el oxaloacetato para rendir citrato es el punto de control primario del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en la mayoría de los tejidos vegetales de origen tropical. Por otro lado, estrechamente relacionado con el mecanismo y la regulación de la biosíntesis de hexosa en las plantas fotosintéticas se halla el fenómeno de la fotorrespiración. Las células de las plantas verdes contienen rnitocondrias, además de cloroplastos; tales células exhiben una respiración mitocondrial y una fosforilación oxidativa en la oscuridad, a expensas de los sustratos producidos por la fotosíntesis durante períodos previos de iluminación. Surge entonces el problema de si las células de las plantas verdes respiran también cuando están iluminadas y durante su fotosíntesis, o si la respiración se ve entonces interrumpida. Se ha demostrado que las plantas respiran realmente bajo la acción de la luz, al tiempo que efectúan la fotosíntesis. Sin embargo, el tipo de respiración que tiene efecto a la luz no es mitocondrial. Esta respiración “lumínica” llamada fotorrespiración desvía al poder reductor fotoinducido de la biosíntesis de la glucosa, hacia la reducción del oxigeno. La fotorrespiración es muy activa en plantas de zonas templadas pero se encuentra en plantas de origen tropical.

Por lo tanto varios ácidos orgánicos se encuentran en los tejidos de las plantas, como producto de almacenamiento de las plantas o como intermediarios de los procesos metabólicos. Estos ácidos pueden ser cuantificados al determinar su capacidad amortiguadora. Los ácidos orgánicos en

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particular pueden ser determinados mediante reacciones químicas específicas o por métodos enzimáticos. MATERIAL Y EQUIPO Baño maría Agitador Pipeta de 5 ml Embudo de separación Determinador de pH, Peachímetro ó Potenciómetro Cuchillo Probeta de 20 ml

SUSTANCIAS

Reactivo de Denigé 0.O1N (HgO +H2S04 I. -FH,O) Éter Permanganato de potasio 0.05N

Ac. sulfórico 0.01 N

Resorcinol al 2%

PROCEDIMIENTO • 1. Quitar la cáscara a un tomate, cortarla en pequeñas fracciones, descongelarlas a temperatura ambiente y exprimirlos. 2. Acidificar hasta pH 1, utilizandoH2SO4 0.01 N. 3. Utilizando un embudo de separación, extraer tres veces con pequeñas porciones de éter. 4. Evaporar el éter en baño maría. 1 5. Disolver el residuo en 15 ml de H2O, filtrar y efectuar las siguientes reacciones utilizando el filtrado.

Prueba para ácido cítrico : Tomar 4 ml del filtrado y añadir 2 ml del reactivo de Denigé. Hervir la solución y añadir lentamente 15 gotas de KMnO4 0.05N.

Prueba para ácido tartárico: Tomar 3 ml del filtrado y añadir 3 gotas de resorcinol al 2% y después añadir 2 ml (H2S04 concentrado. .

CUESTIONARIO Haz una lista de los ácidos orgánicos que se encuentran en las plantas y su función en el metabolismo de las mismas

PRÁCTICA 11: PRODUCCIÓN DE ALMIDÓN DURANTE LA FOTOS ÍNTESIS

OBJETIVO Demostración de la producción de almidón durante la fotosíntesis, empleando una hoja de planta verde y solución de iodo.

INTRODUCCIÓN. Durante la segunda fase de la fotosíntesis no se requiere de luz y se le conoce como fase

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oscura en la cual hay fijación de CO2, y se fabrican carbohidratos utilizando como fuente de energía al ATP y NADPH, producidas en la fase luminosa. El producto final de la fotosíntesis depende de la especie de planta que se trate, aunque la mayoría de las hojas almacenan almidón, la luz es indispensable para que se realice el proceso fotosintético ya que en su ausencia no ocurre la síntesis del almidón.

MATERIALES Y EQUIPOS Papel aluminio

Lámpara de mesa con foco de 100 W

1 Vaso de precipitado de 250 ml

Perforador de corcho

2 Caja de petri

2 Pipetas de 5 ml

1 Tripié 1 Mechero Baño maría Parrilla eléctrica

SUSTANCIAS

Hojas verdes de tamaño grande

Etanol (grado industrial)

Solución de I/KI (Iodo con Ioduro de Potasio)

PROCEDIMIENTO

1. Cubra la mitad de la hoja de la planta con papel aluminio y exponerla a la luz emitida por un foco de 100 watts a una distancia de 60 a 90 cm, durante 24 horas. Al día siguiente descubra la hoja y usando un perforador de corcho corte discos de 1 a 2 cm de diámetro de las dos partes de la hoja.

2. Colocar los discos en agua caliente hasta ablandar las paredes lunares, y luego extraer la clorofila con alcohol caliente sobre la parilla eléctrica. (! CUIDADO¡ Puede provocar incendio) cambiar el etanol en caso de ser necesario, hasta que se haya extraído la clorofila y transferir el disco a una caja de petri que contenga solución diluida de jodo.

3. Comparar la forma en que se han coloreado los discos provenientes de cada una de las dos partes de la hoja.

4. CUESTIONARIO 1. Realizar con dibujos todas las observaciones indicando con color las áreas de cada una de las partes de la hoja. 2. Escribir la reacción que se verifica entre la molécula de almidón y la solución de yodo.

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3. Escriba la estructura química de la molécula de clorofila y explicar cuál es la función durante la fotosíntesis.

4. Escriba y explique qué ocurre durante la primera fase de la fotosíntesis y cómo repercute durante la fase obscura de la hoja empleada en su experimento.

5. Escriba qué experimento realizó Calvin para llegar a proponer el ciclo de la biosíntesis de la glucosa a partir de CO2