CONTENIDO

1) Seminario Taller: La Contaminacin ambiental en el mundo, Per y Lambayeque2) Monitorizacin de la Contaminacin ambiental: Demanda Bioqumica de oxgeno (DBO)

3) Bacterias inmovilizadoras de fosfatos en aguas residuales.

4) Bacterias degradadoras de petrleo DIESEL.

5) Bacterias degradadoras de insecticidas.

6) Microorganismos fermentadores en la elaboracin de ensilado de residuos de pescado.

7) Hongos filamentosos productores de exoglucanasas.

8) Biodegradacin aerobia de residuos orgnicos slidos: Compostaje

9) Produccin de semilla de hongos comestibles.

10) Obtencin de biomasa microbiana a partir de desechos industriales

11) Obtencin de metano a partir de desechos agropecuarios.

12) Bioplsticos: Bacterias productoras de polihidroxialcanoatos (PHAs)

13) Biofertilizantes: Bacterias solubilizadoras de fsforo

14) Bioinsecticidas: Incremento masivo de hongos entomopatgenos

15) Obtencin de BIODIESEL a partir de aceites post-utilizados

16) BiolixiviacinMicrobiologa en el Tratamiento de Desechos - Manual de Prcticas de Laboratorio 2SEMINARIO TALLER

LA CONTAMINACIN AMBIENTAL

Estamos en la sexta extincin en masa?

El ser humano podra estar poniendo en peligro su propia existencia y la de la mayora de especies si no logra controlar su impacto sobre el medio ambiente

El impacto producido por el crecimiento poblacional y el incremento del desarrollo tecnolgico es complejo; pero un anlisis somero demuestra que las actividades humanas afectan el ambiente, contaminando el aire, agua y suelo perjudicando la vida humana, de animales y plantas.

Una gran mayora de los contaminantes son sustancias qumicas slidas o gaseosas, generadas como subproductos o desechos. El hombre extrae materias primas qumicas de la tierra, minerales metlicos, petrleo, gas natural, carbn, sal, azufre e incluso nitrgeno y oxgeno del aire. Despus devuelve al ambiente no slo productos terminados elaborados con estas materias primas sino tambin un nmero no determinado de productos indeseables que contaminan el ambiente.En este nuevo siglo del mundo globalizado, la humanidad nos exige que el desarrollo de los pueblos sea sostenido, donde el progreso econmico est equilibrado con el bienestar social y la preservacin del ambiente

SHAPE \* MERGEFORMAT

Trabajo encargado1. Cules son los contaminantes ms importantes del aire, agua y suelo a nivel mundial.2. Cules son los principales contaminantes provenientes de las industrias e instituciones en la regin Lambayeque?3. Que instituciones brindan asistencia tcnica y cientfica en el manejo de residuos que tienen como objetivo fundamental reducir la contaminacin y promocionar tecnologas de minimizacin y reciclaje de residuos.4. Elaborar un calendario medioambiental

5. Comentar una noticia actual de la problemtica del medio ambiente.Microbiologa en el Tratamiento de Desechos - Manual de Prcticas de Laboratorio 2MONITORIZACION DE LA CONTAMINACION AMBIENTALdEMANDA bIOQUIMIDA DE OXIGENO1. Introduccion

La demanda bioqumica de oxgeno (DBO) es una prueba emprica, en la cual se usan procedimientos estandarizados de laboratorio para estimar los requerimientos relativos de oxgeno de las aguas de desecho, efluentes y aguas contaminadas. Los microorganismos utilizan el oxgeno atmosfrico disuelto en el agua para la oxidacin bioqumica de la materia contaminante, la cual es su fuente de carbn. El ensayo de DBO5 consiste en determinar el oxgeno disuelto antes y despus de un periodo de incubacin de 5 das a una temperatura de 20 C. Por lo tanto la DBO5 representa una medida indirecta de la concentracin de materia orgnica que puede ser degradada o transformada biolgicamente en una muestra y tiene su mayor aplicacin en la medicin de la carga orgnica de aguas residuales crudas y tratadas y en la evaluacin de la eficiencia del tratamiento de aguas residuales.La DBO, determinada por incubacin en la oscuridad, incluye el oxgeno consumido por la respiracin de las algas. El efecto contaminante de un efluente sobre una corriente puede, de hecho, ser alterado considerablemente por la accin fotosinttica de las plantas verdes presentes, pero es imposible determinar cuantitativamente este efecto en experimentos de DBO a los 5 das. Por lo tanto no puede darse una regla general sobre la DBO de muestras que contengan algas, y cada caso debe ser considerado por s mismos.

Una serie complicacin en la prueba de DBO es que mucha de la capacidad de consumo de oxgeno de las muestras puede deberse al amoniaco y al nitrgeno ligado orgnicamente, los cuales eventualmente sern oxidados a nitrito y nitrato si estn presentes bacterias nitrificantes. Adems, el amonio aadido en el agua de dilucin puede tambin ser nitrificado de manera que, a este punto, el valor de DBO no es representativo de la muestra solamente. Sin embargo, las bacterias nitrificantes son extremadamente sensibles a trazas de elementos que pueden estar presentes, y por lo tanto la ocurrencia de nitrificacin depender del nmero de nitrificadores presentes inicialmente. La nitrificacin no ocurre en alguna extensin detectable durante la determinacin de la DBO a los 5 das de aguas residuales crudas (no tratadas) y desechos sedimentados y la mayora de efluentes industriales.

La oxidacin completa de un desecho dado puede requerir un periodo de incubacin demasiado largo para propsitos prcticos. Por esta razn, ha sido aceptado como estndar el periodo de 5 das. Sin embargo, para ciertos desechos industriales y para aguas contaminadas por ellos, puede ser aconsejable determinar la curva de oxidacin obtenida.

El mtodo de dilucin es el ms usado generalmente. El contenido del oxgeno disuelto del lquido se determina antes y despus de la incubacin por 5 das a 20 C. La diferencia constituye la DBO de la muestra despus que se ha tenido en cuenta la dilucin de la misma, si ha habido alguna.

Microbiologa en el Tratamiento de Desechos - Manual de Prcticas de Laboratorio 22. objetivos2.1. Determinar el porcentaje del oxgeno inyectado en una muestra que es consumida por los microorganismos durante la oxidacin de la materia orgnica presente.

2.2. Determinar la demanda bioqumica de oxgeno (DBO) de una muestra de aguas residuales.

3. metodologia

3.1. Preparacin de reactivosa. Agua destilada.b. Solucin Amortiguadora: Disolver 8,5 g de fosfato monopotsico, KH2PO4; 21.75 g de fosfato dipotsico, K2HPO4; 33,4 g de fosfato disdico heptahidratado, Na2HPO4.7H2O y 1.7 g de cloruro de amonio, NH4Cl; en 500 mL de agua destilada; diluir un litro. El pH de esta solucin debe ser 7.2 sin ajuste adicional.c. Solucin de sulfato de magnesio: Disolver 22,5 g de MgSO4.7H2O en un litro de agua destilada.d. Solucin de cloruro de calcio: Disolver 27,5 g de CaCl2 en un litro de agua destilada.e. Solucin de cloruro frrico: Disolver 0,25 g de FeCl3.6H2O en agua destilada y diluir a un litro.f. Solucin cida y bsica: 1 N, para neutralizar la basicidad o acidez de las aguas residuales.g. Solucin de sulfato de Manganeso: Disolver 480 g de MnSO4.4H2O (400 g MnSO4.2H2O 364 g MnSO4.H2O) en agua destilada, filtrar y se diluir en 1 litro. La solucin de sulfato manganoso no debe dar color cuando se le adiciona solucin acidificada de KI.h. Solucin de lcali, yoduro, nitruto: Disolver 500 g de NaOH y 135 g de NaI en agua destilada 700 g de KOH y 150 g de KI y diluir a 1 litro. Adicionar 10 g de azida de sodio disuelta en 40 mL de agua destilada. Esta solucin no debe dar color con la solucin de almidn cuando est diluida y acidificada.i. Acido sulfrico concentrado: 1 mL es equivalente a 3 mL de solucin lcali, yoduro, nitruto.j. Solucin de almidn: Adicionar una suspensin de 5 g de almidn en agua fra a 800 mL de agua destilada hirviendo con agitacin, diluir a 1 litro y dejar sedimentar toda la noche. Usar el sobrenadante y preservar con unas gotas de tolueno.k. Solucin de tiosulfato de sodio 0,025 N: Disolver 6,205 g de Na2S2O3.5H2O en agua destilada recientemente hervida fra y diluir a 1 litro. Preservar aadiendo 5 mL de cloroformo. Guardar en botellas oscuras.l. Solucin estndar de dicromato de potasio 0,025 N. Pesar 1.226 g de K2Cr2O7, previamente secado a 103 C por 2 horas, y disolver en un litro de agua destilada.m. Estandarizacin del tiosulfato con dicromato de potasio: Disolver aproximadamente 2 g de KI en un erlenmeyer con 100 o 150 mL de agua destilada. Adicionar 1 mL de H2SO4 concentrado y luego 10 mL de solucin estndar de dicromato de potasio 0,025 N diluir a 200 mL. Dejar en un lugar oscuro por 5 minutos y diluir aproximadamente a 400 mL y titular con la solucin de tiosulfato 0.025 N.3.2. Preparacin del agua de dilucin o solucin nutrientea. Medir el volumen de agua destilada necesaria para realizar el anlisis de DBO (aproximadamente 1 L por muestra) en un frasco adecuado con una entrada de aire de una fuente de aire comprimido para mantener el agua saturada de oxgeno disuelto (20 minutos). La temperatura del agua debe ser de 20 C 1.b. Adicionar 1 mL de cada una de las siguiente soluciones por litro de agua destilada Solucin Amortiguadora.

Solucin de sulfato de magnesio.

Solucin de cloruro de calcio.

Solucin de cloruro frrico.

Mezclar vigorosamente3.3. Recoleccin de la muestra y preservacinPara tomar las muestra de agua sumergir cerrada la botella de muestreo y remover el tapn debajo del agua, moviendo la botella de lado a lado tratando de eliminar toda burbuja de aire atrapada en la botella.Mantener la muestra a menos de 4 C y empezar la incubacin no ms de 6 horas despus de haber sido colectada.3.4. Pretratamiento de la muestraSegn el pH de las muestras neutralizar aproximadamente a 7 con H2SO4 1 N NaOH 1 N. Las muestras que tienen cloro residual se deben dejar en reposo por 1 o 2 horas para que este elemento se disipe.3.5. Tcnica de dilucina. Homogenizar la muestra de agua residual, agitando fuertemente no menos de 25 vecesb. En una probeta de 1 L de capacidad depositar 500 mL de agua de dilucin, evitando la formacin de burbujas. Aadir la cantidad apropiada de muestra y enrasar hasta 700 mL con agua de dilucin.

Las diluciones que dan lugar a un contenido de oxgeno disuelto residual de al menos 1 mg/L 2 mg/L despus de 5 das de incubacin, producen los resultados ms fiables. Hacer varias diluciones de la muestra preparada para obtener un contenido de oxgeno disuelto en dicho intervalo.

Un anlisis ms rpido, tal como la demanda qumica de oxgeno, DQO, presenta una correlacin aproximada con la DBO y sirve como una gua para seleccionar diluciones. En ausencia de datos previos, utilizar las siguientes diluciones:

0,1 a 1 % para residuos industriales fuertes.

1 a 4 % para aguas residuales crudas 4 a 20 % para efluentes tratados biolgicamente

20 a 100 % para aguas fluviales contaminadas

Las alcuotas tomadas de acuerdo al % de dilucin son:

Muestra% dilucinV. alcuota mLV. dilucin mL

Efluente Industrial0,53,5700

Desage Crudo214700

Efluente tratado1070700

Aguas fluviales contaminadas30210700

c. Verter rpidamente la muestra en dos frascos de DBO (300 mL de capacidad) hasta rebasar, evitando la formacin de burbujas de aire. En un tercer frasco de DBO, depositar 300 mL de agua de dilucin (blanco).

d. Tapar los frascos hermticamente.

e. Incubar un primer frasco de la muestra por 5 das a 20 C en oscuridad (para determinar la DBO final).

f. En el segundo y tercer frasco (muestra y blanco respectivamente) agregar bajo la superficie del lquido 1 mL de sulfato de manganeso e inmediatamente despus 1 mL de azida de sodio o de yoduro alcalino. Tapar cuidadosamente y mezclar por inversin (25 veces) hasta que se observe sedimentacin (color marrn - anaranjado). Reposar hasta que se observe un sobrenadante claro sobre los flocos de hidrxido de manganeso (3 minutos).g. Agitar nuevamente para disgregar los flocos. Reposar aproximadamente 3 minutos de tal manera que se formen aproximadamente 100 mL de sobrenadante transparente.

h. Cuidadosamente remover la tapa y agregar por las paredes 1 mL de H2SO4 concentrado (enfriar al cao) o cido fosfrico. Tapar y mezclar invirtiendo varias veces hasta que los flculos desaparezcan.

i. Para terminar la DBO inicial 201 mL de la muestra, depositarlos en un matraz cnico de 500 mL y titular con tiosulfato de sodio 0,025 N hasta la aparicin de un color amarillo claro. Detener la titulacin y agregar almidn gota a gota hasta la aparicin de un color morado. Continuar titulando con tiosulfato de sodio hasta la desaparicin del color y anotar el gasto total.

Realizar el clculo correspondiente:

j. Realizar el mismo procedimiento con los 201 mL del blanco y para determinar la DBO final realizar el mismo procedimiento en la muestra que fue incubada a 20 C despus de transcurridos 5 das.Tomar en cuenta que 1 mL de tiosulfato de sodio es equivalente a 1 mg de oxgeno disuelto. Por ejemplo:

MuestraPorcentaje de dilucinGasto de Tiosulfato de sodio (mL)Oxgeno disuelto (mg/L)

InicialFinalInicialFinal

Blanco-8,08,08,08,0

Agua residual307,255,257,255,25

% de Oxgeno consumido = 7,25 5,25 = 2,00 %

7,25 --------------- 100 %

2,00 --------------- X

X = 27,59 %

BACTERIAS INMOVILIZADORAS DE FOSFATOS EN aguas residuales

1. INTRODUCCIONLa escasez cada vez mayor de las aguas dulces debido al crecimiento demogrfico, a la urbanizacin y, probablemente, a los cambios climticos, ha dado lugar al uso creciente de aguas residuales para la agricultura, la acuicultura, la recarga de aguas subterrneas y otras reas. Si bien el uso de las aguas residuales para el riego en la agricultura puede aportar beneficios, su uso no controlado generalmente est relacionado con impactos significativos en la salud y el medio ambiente, debido a la presencia de contaminantes biticos y abiticos. Para apoyar en la solucin de este problema existen diferentes tecnologas fsicas, qumicas y biolgicas que constituyen parte de los tratamientos primarios y secundarios de las aguas residuales.A pesar de que estos tratamientos disminuyen ampliamente el contenido de slidos y microorganismos patgenos, estudios fsico qumicos han demostrado que contaminantes como los fosfatos pueden hallarse an en sus efluentes con valores extremadamente elevados frente a la condicin estndar mxima permitida de 2 mg/L , por lo que son motivo de honda preocupacin, ya que los fosfatos como los productos de su hidrlisis se hallan implicados en el proceso de eutroficacin, el que ocasiona una disminucin de oxgeno en el agua, induciendo a polmicos cambios desestabilizantes de los ecosistemas marinos.En aguas residuales existen microorganismos que poseen capacidad de inmovilizar fosfatos como: E. coli, Acinetobacter, Gluconobacter, Brahamella, Phenylobacterium y Aeromonas existiendo la posibilidad de realizar un tratamiento de los efluentes, que presenten concentraciones elevadas de fosfato. Por esta razn se hace necesario implementar y optimizar tecnologas biolgicas, limpias y eficientes, que conlleven a la recuperacin de los fosfatos de las aguas residuales, evitando su prdida en el ambiente marino y permitiendo su posterior uso como abono en la agricultura.

2. OBJETIVOS2.1 Aislar bacterias inmovilizadoras de fosfatos a partir de aguas residuales2.2 Cuantificar el fosfato inmovilizado por bacterias aisladas de aguas residuales

3. METODOLOGIA3.1 Muestra: 600 mL de agua residual de los colectores de la ciudad de Lambayeque.

3.2 Enriquecimiento de la muestra de agua residualColocar 500 mL de la muestra de agua residual en un biorreactor tipo tanque, Batch, con flujo descendente, de 1 L de capacidad y agregar 0, 05 g de K2HPO4 y 0,05 g de KH2PO4.

Incubar a 28 C con aireacin constante durante 72 horas.

3.3 Aislamiento de bacterias inmovilizadoras de fosfatos3.3.1 Tomar una alcuota de la muestra enriquecida de agua residual y sembrarla por agotamiento y estra sobre placas de Petri conteniendo agar fosfato.

3.3.2 Incubar a 28 C durante 3 das.

3.3.3 Elegir las tres colonias de bacterias que presenten mayor desarrollo y registrar las caractersticas macroscpicas y microscpicas de las mismas.

3.3.4 Repicar cada una de las colonias elegidas hacia viales conteniendo agar fosfato inclinado. Incubar a 28 C por 48 horas y posteriormente conservar cada una de los cultivos puros en refrigeracin.

3.4 Fosfato inmovilizado por las bacterias aisladas de aguas residuales

3.4.1 Preparacin del inculo

Reactivar cada una de los cultivos puros bacterianos inmovilizadores de fosfatos , en agar fosfato a 28 C durante 48 horas y a partir de cada una de ellos obtener una suspensin de clulas en solucin salina estril. A continuacin estandarizar la concentracin microbiana con el tubo N 3 del nefelmetro de Mc Farland (9 X 108 clulas/ mL).

3.4.2 Inoculacin de las bacterias inmovilizadoras de fosfatos Tomar una alcuota de 2 mL de cada suspensin de clulas previamente estandariza e inocularlos en 200 mL de medio Tardieux Roche contenidos en un biorreactor tipo tanque Batch, con flujo descendente y 1 L de capacidad.

Incubar a 28 C durante 8 das con aireacin constante.

3.4.3 Clculo del fosfato inmovilizadoMediante el mtodo colorimtrico mencionado por Rodier (1981), cuantificar el fosfato libre (soluble) presente en una muestra de 20 mL del medio Tardieux Roche previamente centrifugado, inmediatamente despus de la inoculacin y al trmino de la incubacin.

La resta de ambos valores corresponde al fosfato inmovilizado expresado en ppm.

3.5 Eficiencia de inmovilizacin de fosfatoDeterminar la eficiencia de inmovilizacin de fosfato de cada una de los cultivos puros bacterianas aplicando la siguiente ecuacin:

E = ___Ci Cf__ X 100

CiDonde:

E = Eficiencia de inmovilizacin de fosfato (%)

Ci = Concentracin de fosfatos a la entrada del biorreactor, despus de

la inoculacin (influente)

Cf = Concentracin de fosfatos a la salida del biorreactor, al trmino de

la incubacin (efluente)

3.6 Identificacin de las bacterias inmovilizadoras de fosfato

Realizar la identificacin de las bacterias inmovilizadoras de fosfato en funcin de las caractersticas culturales y fisiolgicas tomando como referencia el Manual de Bacteriologa Determinativa de Bergey, 1994.4.0 ANEXO

4.1 Composicin del agar fosfato

Agar agar

1.5 g

Peptona

0.5 g

NaCl

0.5 g

Extracto de carne

0.3 g

KH2PO4

0.15 g

K2HPO4

0.15 g

Agua destilada

100 mL

pH = 8.0

4.2 Composicin del medio Tardieux Roche

MgSO4. 7H2O

0.2500 g

NaCl

0.5000 g

NH4Fe(SO4)2. 12 H2O

0.0121 g

MnSO4. H2O

0.0050 g

NH4NO3

1.0000 g

Glucosa

5.0000 g

KH2PO4

0.1000 g

K2HPO4

0.1000 g

Extracto de tierra

50 mL

Agua Destilada

1000 mL

pH = 8.0

4.3 Preparacin del reactivo indicador de concentracin de fosfato (Para 100 mL)

H2SO4 5N 50 %

(7 mL H2SO4 / 43 mL de agua destilada)

Molibdato de Amonio 5 %

(0.6 g / 14.4 mL de agua destilada)

cido Ascrbico 30 %

(0.528 g / 29.472 mL de agua destilada)

Tartrato antimonial potsico 5 %(0.015 g / 4.985 mL de agua destilada)

4.4 Mtodo Colorimtrico para cuantificar fosfatos

Preparar una solucin madre patrn de KH2PO4 con 0.877 g de KH2PO4 y agua destilada hasta el enrase de 1 litro (correspondiente a 0.2 g P/L) Preparar una solucin hija patrn diluyendo 1 mL de la solucin madre en 99 mL de agua destilada (correspondiente a 2 mg P/L)4.4.1 Preparacin de la curva de calibradoIntroducir en una serie de matrices aforados de 25 mL:

Nmero de los matracesTIIIIII

Solucin salina de fsforo de 2 mg / L (mL)0125

Agua bidestilada (mL)20191815

Reactivo indicador (mL)4444

Agua destilada hasta enrase (mL)25252525

Correspondencia en miligramos por litro de fsforo00.10.20.5

Esperar 20 minutos y despus efectuar las lecturas en el espectrmetro a la longitud de onda de 690 nm en cubeta de 10 cm. Construir la curva de calibracin.

4.4.2 Procedimiento para cuantificar fosfatos en la muestraIntroducir 20 mL de la muestra a analizar en un matraz aforado de 25 mL. Aadir 4 mL de reactivo indicador, completar el volumen a 25 mL con agua destilada. Esperar 20 minutos y efectuar las lecturas en el espectrmetro a la longitud de onda de 690 nm en cubeta de 10 cm, Tener en cuenta el valor ledo para el testigo. Obtener los resultados en la curva de calibracin.

4.4.3 Expresin de los resultados

Para una muestra de 20 mL, la curva da el contenido de fsforo, expresado en miligramos por litro.

BACTERIAS DEGRADADORAS DE PETRLEO DIESEL1. INTRODUCCIN

La utilizacin masiva de combustibles fsiles genera anualmente 2 800 millones de toneladas de dixido de carbono de los 76 000 millones de toneladas existentes en la atmsfera. El dixido de carbono junto con otros gases como el dixido nitroso, el metano, los clorofluorocarbonados, compuestos halogenados y el vapor de agua constituyen el grupo de gases invernadero que absorven la radiacin reflejada provocando el calentamiento global de la atmsfera y cambiando dramticamente el clima del planeta.

Adicionalmente a los cambios climticos globales el uso masivo del petrleo como fuente de energa y como materia prima ha generado la contaminacin ambiental que ocasiona el deterioro progresivo de la calidad del medio ambiente y constituye una amenaza real a la salud pblica as como la extincin de gran cantidad de especies animales y vegetales.

El principal origen del crudo y productos del petrleo tales como BTX y PAHs liberados al medio ambiente son las prdidas de los tanques de almacenamiento, los vertidos y accidentes durante su transporte

Una de las herramientas para combatir la contaminacin ambiental generada por derrames de petrleo es la biodegradacin del petrleo o ruptura de los compuestos complejos a compuestos simples y menos txicos. Durante los ltimos aos el inters por la bsqueda de microorganismos con capacidad degradativa de petrleo como bacterias, mohos y levaduras se ha incrementado con miras a utilizarlos en la biorremediancin o recuperacin microbiana de los suelos y cuerpos de agua contaminados con petrleo.

2. OBJETIVOS

2.1. Aislar bacterias degradadoras de petrleo Diesel.2.2. Cuantificar el petrleo Diesel degradado por las bacterias aisladas.3. METODOLOGA 3.1 Muestra100 g de suelo de servicentro contaminado con petrleo Diesel

3.2 Enriquecimiento de las muestras de suelo y adaptacin de los microorganismos a concentraciones crecientes de petrleo.

Disear y acondicionar dos biorreactores tipo Tanque Batch con flujo descendente de 1 L de capacidad.

Pesar 50 g de la muestra de suelo previamente tamizada y llevarla hacia un biorreactor conteniendo 100 mL de caldo Bushnell Haas con 1 % de petrleo Diesel.

Incubar a 30 C durante 72 horas.

Tomar 10 mL de la muestra enriquecida y llevarla hacia un segundo biorreactor conteniendo 100 mL de caldo Bushnell Haas con 2% de petrleo Diesel. Lavar y esterilizar el primer biorreactor.

Incubar a 30 C durante 72 horas.

Tomar 10 mL de la muestra enriquecida y llevarla hacia el primer biorreactor conteniendo 100 mL de caldo Bushnell Haas con 4% de Petrleo Diesel.

Incubar a 30 C durante 72 horas.

3.3. Aislamiento de bacterias degradadoras de petrleo Diesel. A partir de la muestra de suelo enriquecida en caldo Bushnell Haas con 4 % de petrleo Diesel tomar una alcuota y sembrarla mediante la tcnica de agotamiento y estra sobre la superficie de placas de Petri conteniendo Agar Bushnell Haas con 4 % de petrleo Diesel.

Incubar a 30 C durante 48 horas.

Seleccionar y repicar las tres colonias que presenten mayor biomasa y mayor rapidez en el crecimiento hacia viales conteniendo agar Bushnell Haas con 4 % de petrleo Diesel y agar Tripticasa Soya (TSA).

Incubar a 30 C durante 48 horas.

Mantener en refrigeracin los cultivos puros de bacterias degradadoras de petrleo.

3.3 Cuantificacin de la actividad degradativa del petrleo Diesel de cada una de los cultivos puros de bacterias aisladas

La actividad degradativa sobre el petrleo Diesel de cada una de los cultivos bacterianos aislados ser cuantificada a travs del Tiempo requerido para la utilizacin del petrleo Diesel cono fuente de carbono y energa y del nmero de Unidades de Actividad Emulsificante (UAE) de cada uno de ellos.

3.3.1 Preparacin del inculo.

Reactivar cada una de los cultivos bacterianos degradadores de petrleo en 5 mL de caldo nutritivo a 30 C durante 24 horas.

Centrifugar el caldo nutritivo a 3500 rpm durante 15 minutos; eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento con solucin salina fisiolgica estril por dos veces consecutivas. Con el paquete celular obtenido preparar una suspensin de clulas en solucin salina fisiolgica estril y estandarizarla con el tubo N 3 del nefelmetro de Mc Farland (9 X 108 clulas/ mL)

3.3.2 Tiempo requerido para la utilizacin del petrleo Diesel como fuente de carbono y energa.

De cada inculo bacteriano previamente estandarizado tomar 1 mL e inocular por triplicado en tubos de prueba de 16 X 150 mm conteniendo 10 mL de caldo Bushnell Haas con 0,2 mL de resarzurina ( o prpura de bromocresol) y 0,1 mL de petrleo Diesel.

Dejar un tubo con medio de cultivo no inoculado como testigo.

Incubar a 30 C hasta por 5 das en agitacin constante (150 rpm). Observar diariamente en busca del cambio de coloracin del indicador resarzurina (azul a rosado brillante violeta a amarillo) que ser interpretado como positivo para la utilizacin del petrleo Diesel como fuente de carbono y energa3.3.3 Cuantificacin de las Unidades de Actividad Emulsificante (UAE)

Tomar 1 mL de cada inculo bacteriano previamente estandarizado e inocular por triplicado en tubos de prueba de 16 X 150 mm conteniendo 10 mL de caldo extracto de levadura ms 0.2 mL de etanol.

Dejar un tubo con medio de cultivo no inoculado como testigo.

Incubar a 30 C durante 3 das en agitacin constante (150 rpm). Diariamente observar en busca de la formacin de burbujas y turbidez del medio de cultivo. Centrifugar el contenido de cada uno de los tubos, a 2000 rpm durante 30 minutos. Tomar 1 mL de cada uno de los sobrenadantes y colocarlos en tubos de prueba conteniendo 9 mL de caldo levadura etanol ms 0.2 mL de Diesel. Tapar hermticamente cada uno de los tubos y agitarlos durante un minuto hasta lograr una emulsin. Calibrar a cero el espectrofotmetro con tubo blanco conteniendo caldo extracto de levadura con etanol y Diesel no inoculado (testigo) y leer la absorvancia de cada una de las muestras a 540 nm. Realizar la conversin de la absorvancia de cada una de las muestras a Unidades de Actividad Emulsificante considerando 0,816 de absorvancia como una Unidad de Actividad Emulsificante por mililitro (1 UAE / mL).

4. ANEXO

4.1 Caldo Bushnell Haas (g/L)KH2P04

1,0

K2HP04

1,0

(NH4)2S04

1,0

MgSO4

0,20

Cl2Ca

0,02

FeCl3

0,005

Agus destilada csp

1000 mLpH

7,04.2 Caldo Extracto de levadura etanol (g/L)KH2 P04

18,0

K2HP04

6,0

MgS04

0,2

(NH4)2SO4

4,0

Extracto de levadura

3,0Etanol

20,0 mLAgus destilada csp

1000 mLpH

7,0BACTERIAS DEGRADADORAS DE INSECTICIDAS

I. INTRODUCCION

Adems de los productos petroqumicos, el medioambiente puede ser contaminado por otros compuestos orgnicos que no son naturales. Estos compuestos orgnicos, esencialmente nuevos, son denominados xenobiticos, del griego xenos, que significa extranjero. Algunos de los productos mas comnmente encontrados en el medio ambiente son los plaguicidas que se han comercializado como insecticidas, herbicidas y fungicidas

Existen plaguicidas de muy diversos tipos qumicos como los cidos clorofenoxialquilcarboxlicos, reas sustitudas, nitrofenoles, triacinas, fenilcarbamatos, compuestos organoclorados y organofosforados. Sin embargo , algunos son adecuados como fuentes de carbono y como donadores de electrones para determinados microorganismos que incluyen bacterias , hongos y algas, particularmente provenientes de lugares contaminados.

La tasa de degradacin de los xenobiticos en el suelo y en el agua depende de la presencia de los microorganismos con capacidad enzimtica para degradar las molculas. Debido a que los xenobiticos no se encuentran normalmente en la naturaleza, el nivel de microorganismos capaces de degradarlos puede ser muy bajo. en muchos casos se requiere de un perodo de adaptacin antes que ocurra la degradacin.

II. OBJETIVOS

2.1 Aislar bacterias degradadoras de insecticidas a partir de suelos agrcolas.2.2 Cuantificar el insecticida degradado por las bacterias aisladas de suelos agrcolas.III. METODOLOGA 3.1 Muestra 1 g de suelo agrcola3.2 Enriquecimiento de las muestras de suelo y adaptacin de los microorganismos a concentraciones crecientes de carbofurn.

Disear y acondicionar dos biorreactores tipo Tanque Batch con flujo descendente de 1 L de capacidad.

Pesar 50 g de la muestra de suelo previamente tamizada y llevarla hacia un primer biorreactor conteniendo 100 mL de caldo sales minerales con carbofurn a 1,25 ppm.

Incubar a 30 C durante 72 horas con aireacin continua.

Tomar 10 mL de la muestra enriquecida y llevarla hacia un segundo biorreactor conteniendo 100 mL de caldo sales minerales ms carbofurn 2.50 ppm. Lavar y esterilizar el primer biorreactor.

Incubar a 30 C durante 72 horas con aireacin continua.

Continuar con el proceso de enriquecimiento a concentraciones crecientes de carbofurn (5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm).

Incubar a 30 C durante 72 horas.3.3 Aislamiento de bacterias degradadoras de insecticidas.

A partir de la muestra de suelo enriquecida en caldo sales minerales ms carbofurn 40 ppm tomar una alcuota y sembrarla mediante la tcnica de estra sobre la superficie de dos placas de Petri conteniendo Agar sales minerales ms carbofurn 40 ppm.

Incubar a 30 C durante 7 das.

Seleccionar y repicar las tres colonias que presenten mayor biomasa y mayor rapidez en el crecimiento, hacia viales conteniendo agar sales minerales ms carbofurn 40 ppm y agar Tripticasa Soya (TSA).

Incubar a 30 C hasta por 7 das.

Mantener en refrigeracin los cultivos puros de bacterias degradadoras de insecticidas.

3.4 Cuantificacin del insecticida degradado por las bacterias aisladas

El insecticida degradado por cada una de las bacterias seleccionadas ser cuantificado indirectamente a travs de la produccin de biomasa bacteriana. Obtener una suspensin bacteriana de una de los tres cultivos puros ( en solucin salina fisiolgica estril ) y estandarizarla con el tubo N 3 del nefelmetro de Mc Farland.

Inocular 1 mL de cada una de las suspensiones bacterianas en matraces de 250 mL de capacidad conteniendo 50 mL de caldo sales minerales ms carbofurn 40 ppm. Preparar un cuarto matraz con medio de cultivo no inoculado (testigo).

Incubar todos los matraces a 30 C hasta por 7 das en agitacin constante (150 rpm).

Pesar cuatro tubos de prueba serolgicos (peso inicial).

En cada uno de los tres primeros tubos colocar 1 mL del caldo proveniente de cada uno de .los matraces inoculados y en el cuarto tubo de prueba colocar 1 mL del caldo no inoculado (testigo).

Llevar todos los tubos de prueba a estufa a 60 C durante 24 horas.

Pesar cada uno de los cuatro tubos (Peso final). A cada uno de los pesos finales restarle el peso inicial correspondiente. Posteriormente restar el peso del testigo al peso de cada una de los tres cultivos bacterianos evaluados. Expresar los resultados como peso de biomasa seca (mg/mL).IV. ANEXO4.1 Caldo sales minerales

K2H P04

0,80KH2P04

0,20

CaSO4.H20

0,05

MgS04.7 H20

0,50FeS04.7 H20

0,01g

(NH4)2SO4

1,0

H20 csp

1000 mLpH

7,0

4.2 Agar sales mineralesAgar

20,0K2H P04

0,80KH2P04

0,20

CaSO4.H20

0,05

MgS04.7 H20

0,50

FeS04.7 H20

0,01g

(NH4)2SO4

1,0

H20 csp

1000 mLpH

7,0

MICROORGANISMOS FERMENTADORES EN LA ELABORACIN DE ENSILADO DE RESIDUOS DE PESCADO1. INTRODUCCION

Uno de los factores ms importantes en la produccin animal es la alimentacin, pues representa entre el 50 y 80% de los costos de produccin. Un problema particular es la provisin de protenas debido a la limitada disponibilidad de insumos proteicos y su relativo alto costo. En tal sentido se hace necesaria la bsqueda de fuentes alternas de protenas de diferentes orgenes.

Una de las alternativas viables la constituye el ensilado biolgico de pescado. Este es un producto de fcil elaboracin y de bajo costo que aprovecha los residuos de la industria pesquera tales como cabezas, colas, huesos, piel, escamas, vsceras y pescado entero no apto para consumo humano. Mediante un proceso de fermentacin biolgica se obtiene un producto acidificado, estable, con buenas cualidades nutritivas y controladoras de bacterias patgenas y putrefactivas.

El Instituto Tecnolgico Pesquero del Callao (Per) ha desarrollado el proceso de ensilado biolgico con residuos de pescado utilizado bacterias del yogurt (Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgarcius y Streptococcus thermophylus). Sin embargo tambin es factible el uso de Lactobacillus plantarum, levaduras como Candida sp y mohos como Aspergillus niger.

2. OBJETIVOS2.1 Elaborar ensilado de residuos de pescado utilizando bacterias del yogurt (si se desea utilizar Lactobacillus plantarum, Candida sp o Aspergillus niger).

2.2 Evaluar nutricionalmente en pollos el ensilado elaborado.3. METODOLOGIA 3.1 Muestra

2 Kg de vsceras de pescado o residuos de pescado (cabezas, vsceras, huesos, aletas, piel, escamas) provenientes de las plantas de procesamiento industrial o de los centros de expendio

3.2 Elaboracin del ensilado de pescado Lavar los residuos con agua de cao.

Cocinar los residuos a 100 C durante 35 minutos.

Dejar escurrir los residuos hasta que tengan un 65% de humedad (6 a 8 horas).

Moler los residuos.

Adicionar 84 g de melaza para 516 g de residuos: 14% (p/p), mezclar y colocar dentro de un biorreactor tipo tanque anaerobio.

Ajustar el pH a 6,2.

Agregar 30 mL de yogurt (5% del inculo correspondiente previamente preparado).

Incubar a 40 C durante 48 horas si el inculo utilizado son bacterias lcticas y a 35C con agitacin manual cada 8 horas durante 68 horas si el inculo utilizado son hongos.

3.2 Evaluacin nutricional del ensilado de pescado en pollos.

Seleccionar 10 pollos y en la etapa de inicio (0 - 3 semanas) separarlos en dos grupos de cinco pollos en jaulas metlicas provistas de comedero, bebedero y lmpara de calefaccin. En la etapa de acabado (4-7 semanas) reducir la calefaccin y ubicar los pollos en un lugar abierto con luz natural.

Formular y administrar una dieta de acuerdo a los requerimientos de los pollos segn la National Research Council (1984). Las dietas empleadas sern D 1 (control) con harina de pescado como fuente proteica animal y D2 con ensilado de residuos de pescado

.

Tabla 1. Composicin de las dietas por etapa

INICIO

ACABADO

---------------------

---------------------

INGREDIENTES (%) D1

D2

D1

D2

Maz

58.60

47.69

70.50

56.90

Torta de soya

30.00

26.20

18.90

16.70

Aceite vegetal

2.50

1.75

1.00

0.40

Premezcla

0.15

0.13

0.15

0.15

Carbonato de calcio

0.90

0.79

0.90

0.80

Sal

0.20

0.17

0.30

0.20

DL Metionina

0.15

0.13

0.15

0.15

Fosfato diclcico

1.30

1.14

0.90

0.50

Cloruro de colina

0.10

0.09

0.10

0.10

Antifngico

0.10

0.09

0.10

0.10

Harina de pescado

6.00

----

7.00

-----

Ensilado de pescado

-----

21.83

-----

24.00

Costo $ Kg

0.32

0.28

0.20

0.25

3.3 Registro de datos

a. De los animalePeso corporal del animal semanalmente

b. Del ensiladopH : Porcentaje de acidez titulable

Porcentaje de humedad

Porcentaje de protena, grasa cruda, cenizas, carbohidrat

Recuento de coliformes totales y fecales

Recuento de microorganismos aerobios mesfilos

Deteccin de Salmonella, Staphylococcus aureus y Bacillus cereus

c. ClculosConsumo diario de alimento

Incremento de peso corporal semanal y mensual

Eficiencia de Conversin alimenticia HONGOS FILAMENTOSOS PRODUCTORES DE EXOGLUCaNASASI. INTRODUCCIN

La celulosa es sin duda el material orgnico ms abundante en la tierra con un estimado de velocidad de sntesis de 4 X 107 4 X 1010 toneladas por ao. Corresponde por lo menos a un tercio de toda la materia vegetal de la tierra y del 40 60 % del material de la pared celular de la madera y plantas herbceas.

Sin embargo, este material no es digerido por los carnvoros y en el caso de los herbvoros slo se realiza su descomposicin parcial con ayuda de las enzimas de los microorganismos que habitan el tracto digestivo. Por esta razn y a pesar de constituir una fuente inagotable de hidratos de carbono y energa, la biomasa lignocelulsica (residuos agrcolas, subproductos de las industrias agroalimentarias, forrajes, maderas no explotadas y residuos de actividades municipales) es considerada como desperdicio celulsico y es mal valorizado.

En la naturaleza existen microorganismos y entre ellos los mohos que degradan la celulosa a travs de un complejo de enzimas denominados genricamente celulasas y que son utilizadas en la industria alimenticia, textil, papelera, sector de produccin ganadera, energtica y proteccin ambiental (elaboracin de zumos, pulido de fibras de algodn, blanqueado y refinado de la pasta celulsica, aditivos en piensos para aves y cerdos, produccin de bioalcohol y tratamiento de basura).

El hongo Trichoderma reesei es el mayor productor de celulasa extracelular; por lo que la mayora de los estudios concernientes a la naturaleza, modo de accin y aspectos en general de las celulasas han sido realizados usando este microorganismo. Sin embargo, la bsqueda de una eficiente y posiblemente mejor fuente de celulasa contina debido a la baja actividad de ( - glucosidasas en T. reesei lo que limita la velocidad y extensin en la hidrlisis.

II. OBJETIVOS

2.1 Aislar e identificar mohos productores de exoglucanasas a partir de suelos agrcolas.

2.2 Medir cualitativamente la actividad exoglucanasa de los mohos aislados.

III. METODOLOGA

3.1 Muestra100 de suelo agrcola

3.2 Aislamiento de mohos productores de exoglucanasas en caldo Czapeck con papel filtro como fuente de carbono.

Llevar 5 g de cada una de las muestras de suelo previamente tamizado hacia frascos de vidrio conteniendo 25 mL de caldo Czapeck y dos tiras de papel filtro Whatman N 1 (6 cm X 1 cm) como fuente de carbono.

Incubar los frascos a 28 C por 15 das, con agitacin manual diariamente durante 15 minutos.

Realizar observaciones macroscpicas para la determinacin del crecimiento fungoso. La positividad estar dada por la presencia de micelio y/o pigmentacin sobre el papel filtro. En este caso extraer el papel filtro, realizar un raspado del micelio adherido y con ayuda del asa bacteriolgica en anillo sembrarlo mediante la tcnica de estra sobre discos de papel filtro de 9 cm de dimetro embebidos con 1 mL de caldo Czapeck y depositados sobre placas de Petri previamente esterilizadas.

Incubar las placas de Petri a 28 C hasta evidenciar la presencia de micelio sobre el papel filtro. A continuacin con el asa micolgica tomar una porcin del micelio y sembrar sobre placas de Petri conteniendo agar papa dextrosa mas cloranfenicol. Incubar a 28 C hasta por 5 das.

A partir de cada una de las colonias desarrolladas realizar una observacin microscpica y posteriormente repicar por duplicado hacia tubos de prueba conteniendo PDA. Despus que el micelio cubra totalmente el medio de cultivo conservar un tubo en refrigeracin y utilizar el otro tubo para realizar la identificacin.

Identificar los mohos mediante la evaluacin de las colonias desarrolladas sobre PDA y observaciones microscpicas de microcultivos para determinar la morfologa del micelio vegetativo y las estructuras reproductivas de cada uno de ellos.

3.3 Medicin cualitativa de la actividad exoglucanasa

Determinar cualitativamente la actividad exoglucanasa de cada una de las cepas de mohos aisladas a travs del crecimiento de los mohos sobre el papel filtro, la degradacin del papel filtro (%) y la prdida de peso del papel filtro (g).

3.3.1 Obtencin del inculo de mohos productores de exoglucanasas

A partir de cada una de las cepas de mohos productores de exoglucanasas preparar obtener una suspensin de conidias en solucin salina fisiolgica ms Tween 80 y estandarizarla a 107 clulas/ mL con ayuda de la cmara de contaje de Levy con el rayado de Neubauer.

3.3.2 Siembra de mohos productores de exoglucanasas

Tomar 1 mL del inculo previamente estandarizado y sembrarlo en 10 mL de caldo Czapeck contenidos en tubos de ensayo de 20 mL de capacidad con un papel filtro Whatman N 1 como fuente de carbono de 6 cm X 1 cm y un peso aproximado de 0.020g.

Incubar durante 25 das a 28 C con agitacin diaria durante 15 minutos.

3.3.3 Crecimiento de los mohos productores de exoglucanasas sobre papel filtro

Transcurridos los 25 das de incubacin extraer cada papel filtro y determinar el porcentaje de su rea colonizada por el moho. Utilizar la escala convencional elaborada para tal fin.

Escala convencional para determinar el tipo de crecimiento de mohos sobre papel filtro

Tipo de CrecimientoArea del papel filtro con micelio (%)

Abundante

Regular

Escaso81 100

51 80

0 50

3.3.4 Degradacin del papel filtro por mohos productores de exoglucanasas

Con ayuda del asa bacteriolgica en anillo y con una piseta retirar cuidadosamente el micelio adherido al papel filtro.

A continuacin colocar cada papel filtro sobre una placa de Petri y llevarlo a estufa a 60 C durante 24 horas.

Determinar el tipo de degradacin del papel filtro de acuerdo a la escala convencional elaborada para tal fin.

Escala convencional para determinar el tipo de degradacin del papel filtro

Tipo de degradacinArea degradada del papel filtro (%)

Muy buena

Buena

Regular

No observable81 100

41 80

1 40

0

3.3.5 Prdida de peso del papel filtro por la actividad de mohos productores de exoglucanasas

Una vez determinado el tipo de degradacin del papel filtro, pesar cada uno de ellos considerando los resultados como peso final.

Encontrar la diferencia entre peso inicial y peso final y expresarlo como porcentaje de peso perdido.

IV. ANEXO4.1 Medio de cultivo para aislamientoCaldo Czapeck

Composicin: 3 g de Nitrato sdico, 1 g de Fosfato dipotsico, 0.5 g de Sulfato de magnesio, 0.5 g de Cloruro potsico, 0.01 g de Sulfato ferroso, agua destilada c.s.p. 1000 mL, pH 5.5.Preparacin:

En un matraz conteniendo 1000 mL de agua destilada incorporar 49 g del caldo Czapeck y calentar hasta ebullicin para disolver el medio. Posteriormente distribuir en frascos y esterilizar en autoclave a 15 libras de presin, 121 C durante 15 minutos.

4.2 Agar Papa Dextrosa (PDA)

Composicin: 250 g de papa, 20 g de dextrosa, 18 g de agar, agua destilada c.s.p. 1000 mL, pH 5.5.

Preparacin:

En un matraz conteniendo 1000 mL de agua destilada, incorporar 39 g de agar, mezclar bien agitando frecuentemente; hervir por 1 minuto. Distribuir en tubos y frascos. Posteriormente esterilizar en autoclave a 15 libras de presin, 121 C durante 15 minutos.

4.3 Antibitico: (Cloramfenicol)

Disolver una cpsula de cloranfenicol de 250 mg en 10 mL de alcohol al 95 %. Agregar 2 mL del antibitico disuelto en un litro de PDA.

Se utiliza para inhibir el crecimiento bacteriano.

4.4 Azul de lactofenol:

20 g de Cristales de fenol; 20 mL de cido lctico; 40 mL de glicerol; 20 mL de agua destilada; 2 mL de azul de algodn solucin acuosa al 1 %.

Se utiliza para la observacin microscpica de los mohos productores de exoglucanasas.

BIODEGRADACIN AEROBIA DE DESECHOS ORGNICOS SOLIDOS: COMPOSTAJE1. INTRODUCCIN

La generacin de residuos slidos urbanos ha experimentado un incremento progresivo que ha dado lugar a que se haya doblado la produccin en los ltimos 15-20 aos. Las causas han sido, entre otras, la mayor concentracin de la poblacin en ncleos urbanos, incremento del nivel de vida de los ciudadanos y el uso creciente de nuevos productos y envases desechables.

El grado de mecanizacin logrado en la agricultura y la modernizacin generalizada de todas las explotaciones ganaderas ha tenido un marcado efecto en la desaparicin de numerosas actividades que tradicionalmente se venan desarrollando en el campo , tales como, animales de trabajo, pastoreo, labores culturales, barbechos, explotaciones ganaderas complementarias , a partir de las cuales se entraba en el ciclo biolgico reincorporando importantes cantidades de materia orgnica al suelo.

El empleo de semillas seleccionadas, la aparicin de variedades nuevas y el mejor conocimiento de tcnicas de cultivo ha permitido obtener mayores rendimientos en las cosechas. Este incremento de la produccin exige una mayor demanda de la materia orgnica contenida en el suelo que origina un descenso continuo de su contenido situndose actualmente en una media entorno al 1 % que representa la mitad de la cantidad que correspondera para un suelo de una fertilidad agrcola normal.

Para dar respuesta a esta doble problemtica, es decir, mineralizacin progresiva del suelo y eliminacin del gran volumen de residuos slidos urbanos que se generan, la alternativa ms aconsejable es el reciclaje y recuperacin de una parte de stos residuos y la elaboracin de Compost a partir de la propia materia orgnica que actualmente se desecha.

Puede definirse el Compost como el producto que se obtiene al someter a un proceso de fermentacin aerobia los desechos slidos orgnicos tales como residuos domsticos, desechos de corte y limpieza de parques , jardines, y huertos, desechos de industrias agroalimentarias, desechos del sector ganadero y lodos de depuradoras de aguas residuales mezclados con residuos vegetales.

2. OBJETIVO

Determinar el efecto de las proporciones de materia orgnica vegetal y animal en el tiempo de maduracin y concentracin de nutrientes del compost.3. MATERIALES

30 kg de desechos slidos orgnicos animales (DOA): pelo de cuy, estircol de vacuno, estircol de pollo, etc. 30 kg de desechos slidos orgnicos vegetales (DOV): tallos, hojas, ramas, cscaras de naranja, limn, papaya, maracuy, pltano, manzana, papa, yuca, etc.4. METODOLOGIA4.1 Triturar o desmenuzar los restos orgnicos de tal manera que el tamao no sobrepase los 5 cm.

4.2 Combinar los desechos en las siguientes proporciones hasta completar 12 kg:

a. 100% DOV

b. 75% DOV + 25% DOA

c. 50% DOV + 50% DOA

d. 25% DOV + 75% DOA

e. 100% DOA

4.3 Colocar el material pesado (12 kg) sobre un plstico ubicado sobre el suelo y adicionar aproximadamente 300 mL de agua. Mezclar los desechos entre s con una palana y un rastrillo.

4.4 Llevar cada una de las mezclas a un balde plstico (cuya base presenta agujeros) de 16 litros de capacidad formando una primera capa de aproximadamente 14 cm de altura, posteriormente aplicar 50 g de ceniza (o cal) formando una delgada capa.

A continuacin colocar otra capa de la correspondiente mezcla y finalmente espolvorear otra capa delgada de ceniza (50 g).

4.5 Ubicar cada compostera en un ambiente bajo techo a fin de evitar su saturacin con agua durante las lluvias o su desecacin excesiva en las horas de sol. Diariamente registrar la temperatura interna de cada compostera (20 cm de profundidad).

4.6 Cada 4 das hasta por 90 das vaciar el contenido de la compostera hacia un plstico ubicado sobre el suelo y con el rastrillo remover cuidadosamente durante 5 minutos procurando que no queden masas compactas. Con una palana volver a colocar los desechos en la compostera procurando que los que estuvieron encima queden abajo y viceversa a fin de que toda la masa se biodegrade uniformemente.

4.7 Considerar como final del proceso (maduracin) el momento cuando existe dificultad para identificar los materiales orgnicos originales y stos presenten un color caf oscuro, casi negro, olor a tierra mojada o enmohecida, textura desmenuzable e imposibilidad de calentarse nuevamente al humedecerlos o voltearlos.

4.8 Anotar el tiempo requerido para la maduracin de cada uno de los tratamientos.

4.9 Determinar la concentracin de nitrgeno mineral, fsforo disponible y potasio de cada uno de los compost obtenidos.

PRODUCCION DE SEMILLA O BLANCO DEL HONGO LIGNOCELULOLITICO

Agaricus blazei (Murill)I. INTRODUCCIN

Los hongos lignocelulolticos son organismos que para su crecimiento utilizan selectivamente la lignina, compuesto que acta como una barrera para la degradacin biolgica de los residuos lignocelulsicos, provocando que se acumulen en grandes cantidades y contaminen el medio ambiente.

La mayora de los hongos lignocelulolticos son basidiomicetos caracterizados por formar una estructura fructificante o basidiocarpo, con alto valor nutritivo adems de que pueden crecer en desechos silvo agrcolas, por lo que constituyen una buena alternativa para la produccin de protena vegetal de consumo humano.

El cultivo comercial de hongos comestibles comprende de tres etapas principales: Preparacin del sustrato o composteo, produccin del blanco o semilla y produccin de basidiocarpos. Una fase determinante es la calidad del blanco o semilla que se utiliza para inocular el compost previamente preparado e inducir la formacin del basidiocarpo.

Blanco es el sustrato slido colonizado por un micelio puro y fresco que se utiliza como semilla para la produccin comercial de hongos comestibles como Agaricus bisporus, Agaricus blazei (Murill), ambos del tipo de los championes, Flammulina velutipes (Pata de terciopelo), Lentinus edodes (shiitake japons) y Pleurotus ostreatus (Girgola u hongo ostra)sajor caju (Pleurotus).

Un laboratorio especializado en la produccin de semilla o blanco de Agaricus sp. inicia el proceso a partir de tejidos del basidiocarpo, obtiene un cultivo puro de micelio sobre un medio nutritivo solidificado con agar, realiza varios cultivos intermedios y despus transfiere algunos fragmentos de este cultivo a un medio nutritivo previamente esterilizado.II. OBJETIVOS

Obtener cepas madre a partir de basidiocarpos de Agaricus blazei (Murill).

Producir blanco o semilla de Agaricus blazei (Murill).

III. METODOLOGA

3.1. Preparacin de medios de cultivo

a. Agar papa dextrosa (PDA)Hervir 250 g de papas (peladas y picadas) en 500 mL de agua destilada durante 20 minutos. Filtrar a travs de una gasa. Recepcionar el filtrado en un vaso de precipitacin y aadir 20 g de dextrosa y 20 g de agar disueltos en 500 mL de agua destilada (bao mara).Completar a 1 litro con agua destilada yDistribuir en matraces. Esterilizar a 15 libras de presin, 121 C durante 20 minutos. b. Sustrato de granoSeleccionar el trigo para eliminar los granos manchados y deteriorados. Lavar aproximadamente cinco veces con agua de cao (hasta que no se detecte residuos que enturbien el agua de lavado).

Hervir en una olla durante 20 minutos con agua en cantidad suficiente como para que cubra totalmente el trigo hasta unos 10 cm por encima de la superficie. (El tiempo se toma desde que la olla es colocada en el fuego. Una olla de 40 cm de dimetro permite una buena coccin de 10 kg de trigo).Con un cernidor tomar el trigo, eliminar el agua y colocarlo sobre una superficie slida, extendiendo de tal manera que permita su aireacin. Mezclar con 4,5 g de carbonato de calcio y 17,5 de yeso/ kg de trigo.

c. Sustrato de grano en frascosColocar el sustrato de grano en frascos de vidrio de boca ancha, los que no deben ser llenados hasta ms de la mitad de su capacidad.Tapar con papel aluminio y encima con papel sujetado con una pita. Esterilizar a 15 libras de presin a 121 C durante 3 horas. Dejar enfriar 12 horas antes de sembrar el hongo.d. Sustrato de grano en bolsas

Colocar sustrato de grano en bolsas de polipropileno, a razn de 1 kilo por bolsa. Ubicar un tapn de algodn en el extremo abierto de la bolsa y sujetarlo con una pita. A continuacin cubrir el algodn con papel.Acondicionar las bolsas en canastillas dentro del autoclave para permitir una mejor distribucin del vapor y por lo tanto una buena esterilizacin.Esterilizar a 15 libras de presin a 121 C durante 3 horas.Enfriar 12 horas antes de sembrar el hongo. 3.2. Obtencin de Cepas madre de Agaricus blazei (Murill)A partir de basidiocarpos desinfectados superficialmente con hipoclorito de sodio al 1 %, tomar porciones triangulares de aproximadamente 1 cm y colocarlas sobre medio agar papa dextrosa (PDA) ms antibitico Cloranfenicol (cuatro porciones por placa de Petri).Incubar a 28 29 C durante 10 das o hasta que el micelio colonice completamente la placa.Tomar pequeas porciones de PDA conteniendo el micelio (1 cm2) y transferirlas a tubos conteniendo PDA inclinado (tubos de 150 X 25 mm).Incubar a 28 29 C durante 10 das o hasta que el micelio colonice completamente el medio de cultivo del tubo. Cada uno de ellos constituir una cepa madre. Mantener en refrigeracin (4 C) hasta por 3 meses.3.3. Produccin de blanco o semilla de Agaricus blazei (Murill)a. Fase I: Incremento del hongo en placas con PDATomar un tubo con cepa madre de A. blazei y transferir pequeos fragmentos del micelio (1 cm2) a placas de Petri conteniendo PDA (2 fragmentos por placa). Un tubo alcanza aproximadamente para cinco placas. Incubar a 28 29 C hasta por 15 das.

b. Fase II: Inoculacin del sustratoDependiendo de la calidad del trigo con el que se va a trabajar. Proceder a la inoculacin del sustrato por uno de los dos mtodos descritos a continuacin;

Primer Mtodo: Inoculacin de sustrato de grano en frascos y posteriormente sustrato de grano en bolsas.

Sobre el trigo contenido en frascos de vidrio colocar una porcin de PDA de aproximadamente 2 cm2. Sobreponer una porcin de PDA con micelio del hongo A. blazei (proveniente de placas de Petri de la fase I).

Incubar a 28 29 C. Transcurridos los 15 das o cuando el micelio ha colonizado totalmente la superficie de los granos de trigo, homogenizar el medio para permitir que el micelio se distribuya en todo el frasco (30 das). Posteriormente sobre el trigo contenido en bolsas de polipropileno colocar una cucharada (30 g) del blanco de Agaricus blazei (Murill): cultivado en frascos de vidrio.

Este mtodo se recomienda cuando el trigo es de muy buena calidad y los ventaja de que el micelio invade con mayor rapidez el sustrato de la bolsa debido al mayor nmero de puntos de siembra (cada semilla de cereal representa un punto). Un frasco conteniendo aproximadamente 300 g de blanco alcanza para inocular diez bolsas. Sin embargo se corre el riesgo de contaminacin durante el manipuleo en los dos pasos involucrados.

Segundo Mtodo: Inoculacin de sustrato de grano en bolsas

Sobre el trigo contenido en bolsas de polipropileno colocar una porcin del PDA de aproximadamente 3 cm2. Sobreponer una procin de PDA con micelio de A. blazei (Murill) proveniente de placas de Petri de la Fase I. Incubar a 28 29 C.

Este mtodo se recomienda cuando el trigo no es de buena calidad o las condiciones de almacenamiento no han sido las adecuadas.

Una placa conteniendo A. blazei (Murill) alcanza para inocular ocho bolsas.

c. Fase III: Incubacin de sustrato inoculado

Incubar las bolsas inoculadas a temperatura de 28 29 C. Cuando el micelio ha colonizado la superficie (a los 20 25 das luego de la siembra) homogenizar el contenido de las bolsas para que el hongo se distribuya en todo el medio (30 45 das para el primer y segundo mtodo respectivamente).3.4. Control de calidad del blanco o semillaLos productores de blanco o semilla estn comprometidos con la calidad, y solo produciendo basidiocarpos a partir de ella se puede asegurar que es la adecuada. Seleccionar al azar blanco de cada lote producido y preparar un experimento de cuatro muestras con su respectivo testigo para cada cepa. Utilizar los diseos experimentales factoriales. Empleando el mismo compost que el de la produccin comercial el que previamente se ha evaluado visualmente, por el olor, el tacto, y luego se analiza la humedad, amonio, nitrgeno, pH, conductividad y contenido de cenizas. Utilizar 0,2 Kg (200 g) de semilla por 100 Kg de compost.Realizar las evaluaciones de crecimiento diariamente y tambin controlar las condiciones ambientales del cuarto de crecimiento e incluso realizar el riego para minimizar el error experimental.

La cosecha permite obtener datos como peso, nmero y condicin de los basidiocarpos de cada bandeja diariamente. Adems se anota la presencia de enfermedades o deformaciones. Las pruebas rigurosas toman tiempo, dinero y energa. Lo descrito es prueba rutinaria para las variedades comerciales.

obtencin DE BIOGAS A PARTIR DE desechos agropecuarios1. INTRODUCCION

Con el trmino biogas se designa a la mezcla de gases resultantes de la descomposicin de la materia orgnica, realizada por accin bacteriana en condiciones anaerobias.

El biogas es producido en un recipiente cerrado o tanque denominado biodigestor, el cual puede ser construido con diversos materiales como ladrillo, cemento, metal o plstico. El biodigestor de forma cilndrica posee un ducto de entrada a travs del cual se suministra la materia orgnica (estircol animal o de humano, aguas sucias de las ciudades, residuos del matadero), en forma conjunta con agua (afluente) y un ducto de salida en el cual el material ya digerido por accin bacteriana abandona el biodigestor (efluente).

El proceso de digestin que ocurre en el interior del biodigestor libera energa qumica contenida en la materia orgnica la cual es convertida en biogas.

Los principales componentes del biogas son el metano (CH4) y el dixido de carbono (CO2). Tambin se encuentran pequeas cantidades de sulfuro de hidrgeno, hidrgeno y nitrgeno.

El metano; que es el principal componente del biogas, es el gas que le confiere las caractersticas combustibles al mismo. El valor energtico del biogas, por lo tanto estar determinado por la concentracin de metano, alrededor de 20 25 MJ/m3, comparado con 33 38 MJ/m3 del gas natural.

A pequea y mediana escala, el biogas ha sido utilizado para cocinar en combustin directa en estufas simples. Sin embargo, tambin puede ser utilizado para la iluminacin, calefaccin y como reemplazo de la gasolina o el combustible Diesel en motores de combustin interna.

Adicionalmente al beneficio energtico, en la produccin del biogas, se logra la transformacin de los vertimientos y biodegradables que constituyen hoy en da en su conjunto, uno de las principales fuentes de contaminacin del ambiente, originando un biofertilizante rico en potasio y activo como mejorador de suelos que tambin puede ser aprovechado como alimento de peces y aves de corral. Rendimiento de biogas (m3/kg fresco)

Estircol vacuno

0,0372

Estircol equino

0,0573

Estircol porcino

0,0520

Estircol ovino

0,152

Estircol de aves

0,091

Estircol humano

0,042

Desechos de maz

0,190

Desechos de arroz

0,190

Composicin de biogas

Metano (CH4)

55 a 70 %

Anhidrido carbnico (CO2)35 a 40%

Nitrgeno (N2)

0,5 a 5 %

Sulfuro de hidrgeno (H2S)0,1 %

Hidrgeno (H2)

1 a 3 %

Vapor de agua

Trazas

1.1 Parmetros de operacin en la produccin de biogsLos parmetros de operacin son quellos que se fijan antes del inicio del proceso y sealan las condiciones en las cuales va a trabajar el sistema.

Temperatura

La produccin de biogas puede ser mesoflica (28 38 C) o puede ser termoflico (40 60 C).

SustratoEl contenido de materia orgnica del sustrato para la produccin de biogas deber tener una relacin C : N de 25 a 30.

Dilucin o contenido de slidos totalesLos slidos totales estn constituidos por el porcentaje de material seco que queda despus del secado de la muestra a 104 C y estn formados por los slidos digeribles y los slidos no digeribles.En un sistema Batch el porcentaje de slidos totales ser de 25 35 % y en un sistema continuo o semicontinuo ser de 6 10 % de solidos totales.

pH

El pH ptimo est entre 6.6 7.6.

Tiempo de retencin

Depende de la temperatura en la que se lleve a cabo la produccin de biogas. Si es termoflica sern 6 a 10 das y si es mesoflica sern 15 a 60 das.

1.2 Parmetros de control

Son aquellos que permiten evaluar el desarrollo del proceso. Previenen y/o explican fenmenos que afectan el normal desenvolvimiento del digestor, as como permiten calcular la eficiencia. Estos son contenido de cidos voltiles, alcalinidad, pH, nitrgeno amoniacal, produccin y composicin del biogas, degradacin de la materia orgnica.

Contenido de cidos voltiles (slidos voltiles)

Representan en gran parte a los slidos biolgicamente digeribles. Son los cidos orgnicos de cadena corta que presentan alta presin de vapor a 104 C. Incluyen el cido actico, propinico, butrico, frmico, valrico, caproico; son producidos durante la acidognesis y constituyen un factor limitante cuando una alta concentracin de ellos origina un descenso del pH afectando la actividad de las bacterias metanognicas.

El lmite mximo es 2000 ppm, aunque este valor depende mucho de la capacidad de amortiguamiento del sistema.

Alcalinidad

Es la capacidad de amortiguamiento que presenta el sistema generada por los aniones de cidos dbiles y bases fuertes como bicarbonatos, carbonatos e iones hidroxilo formados durante la digestin aanerobia . Los valores pueden fluctuar entre 1500 5000 ppm como cido actico.

pH

Es la funcin de la relacin entre el contenido de cidos voltiles y la acalinidad. Cuando no existe equilibrio entre estos dos parmetros se manifiestan cambios en el valor del pH. El rango de operacin est entre 6.6 7.6.

Produccin y composicin del biogas

Es un parmetro que permite evaluar el comportamiento del proceso y a la vez calcular su eficiencia.

Es conveniente expresar la produccin del biogas en trminos d eslidos voltiles introducidos porque expresan la forma directa cmo la poblacin bacteriana los est utilizando.

Normalmente en un proceso de digestin se dan fluctuaciones en la produccin y composicin del gas. Sin embargo si los descensos en la produccin del gas persisten por 4 o 5 das se debe pensar que existe algn problema.

En cuanto al contenido de metano, cuando se trabaja con estircol de vacuno y pajas, fluctuan entre 50 60 % con un 40 a 50 % de CO2. Durante los primeros das de iniciado el proceso el contenido de metano es muy bajo pero luego se va incrementando.

Degradacin de la materia orgnica

Permite evaluar la eficiencia de la actividad bacteriana en la transformacin del material orgnico al biogas.

El contenido de materia orgnica se puede expresar como slidos voltiles. Estos son aquellos que desaparecen cuando se somete la muestra seca a ignicin a 550 C.

2. Metodologa para la produccin de Biogas

2.1 Diseo y acondicionamiento de biorreactores anaerobios con sistema de purificacin

Acondicionar un biorreactor anaerobio, constituido por un depsito rectangular, cerrados de latn de 1/16 pulgadas (utilizado para el transporte de aceites) con capacidad de 18 L y cuyas dimensiones son de 0,24m de largo y ancho por 0,36 m de altura.

Sobre el extremo superior el biorreactor presentar una abertura de 10 cm de dimetro, cubierta con una tapa rosca plstica provista de un agujero (0.5 cm) en la parte central. La abertura servir para realizar la carga y descarga del biorreactor y el agujero central permitir la salida del biogas a travs de una manguera plstica de 0,5 cm de dimetro y 60 cm de longitud.

Anexo al biorreactor se encontrar el sistema de purificacin que estar constituido por un frasco lavador de CO2, de vidrio y de 500 mL de capacidad, conteniendo 200 mL de una solucin de cal 2%.

El frasco lavador ser cerrado hermticamente con una tapa rosca plstica que presentar un agujero en la parte central por donde ingresar el extremo final de la manguera de plstico (0.5 cm de dimetro y 60 cm de longitud) llevando el biogas desde el biorreactor y saldr una manguera de plstico (1 cm de dimetro y 50 cm de longitud) sacando el biogas para su almacenamiento en un globo fuertemente sujeto a su extremo final (gasmetro).

2.2 Recoleccin de la materia prima para la produccin de biogas

En un centro de engorde de porcinos recolectar estircol fresco y en campos agrcolas recolectar residuos celulsicos (tallos, races, malezas, corontas) en las cantidades de 20 kg y 5 kg respectivamente.

2.3 Preparacin de la carga inicial para la produccin de biogas (fermentacin aerobia o pre-fermentacin)

Para lograr una relacin de C : N de 25 a 30 : 1 mezclar 9 kg de estircol de cerdo previamente desmenuzados por trituracin con 2 kg de residuos celulsicos, cortados en pedazos de ms o menos 3 5 cm. Mezclar el material resultante con agua de cal al 2 %, en la proporcin de 1 : 2, equivalente a 11 Kg de residuos y 22 L de agua de cal al 2 %.

Colocar la mezcla sobre un plstico ubicado en el suelo, homogeneizarla y airearla durante 15 minutos interdiariamente en un total de 16 das.

2.4 Fermentacin anaerobia para la produccin de biogas

Al sustrato previamente sometido a una fermentacin aerobia se le determinar el contenido de slidos totales. Este ser aproximadamente de 50 %. Debido a que para la produccin de biogas en sistema Batch se requiere 25 35 % de slidos totales, el sustrato ser pesado y diluido con agua de cal 2 %, en la proporcin 1: 1 (9 kg de sustrato mas 9 L de agua de cal al 2 %).

Posteriormente el sustrato pesado y humedecido ser mezclado con 200 mL de lquido ruminal y ser colocado inmediatamente dentro del biorreactor (4/5 del volumen) con llenado intermitente o tipo Batch, lo cual significa que ser cerrado hermticamente y no se abrir hasta que cese la produccin del biogas.

El tiempo de retencin ser aproximadamente de 30 das.2.5 Parmetros de control de la produccin de biogas:

En el desarrollo de la presente prctica durante la produccin de biogas se determinar los valores de los siguientes parmetros:

Diariamente se registrar la temperatura, el pH y el volumen del gas producido.

Al inicio y al final de la produccin de biogas se determinar:

Slidos totales (%)

Slidos voltiles (%)

Antes de la pre fermentacin y despus de la digestin del sustrato se determinar:

Nitrgeno (%)

Carbono (%)

Fsforo (%)

2.6 Purificacin del biogas para la obtencin del metano

El biogas que sale del biorreactor y que es conducido a travs de la manguera plstica ser llevado hacia un frasco lavador conteniendo 200 mL de agua de cal 2% para eliminar el CO2 y posteriormente ser almacenado en el globo de polietileno (gasmetro).

De ser posible acondicionar tambin un filtro para la captacin del sulfuro de hidrgeno, que deber ser instalado en la manguera de conduccin del biogas desde el lavador de CO2 hacia el reservorio de biogas o gasmetro; constituido por un tubo de PVC relleno en las 2/3 partes con limadura de hierro y el tercio restante con esponjilla de hierro utilizada para la limpieza domstica de utensilios domsticos.

El biogas ingresar por un extremo del filtro y lo abandonar por el extremo opuesto. El sulfuro de hidrgeno ser atrapado por el material ferroso formndose sulfuro de hierro.

2.7 Descarga total de lodos

Terminado el proceso de produccin de biogas con un determinado tipo de sustrato, sacar totalmente el contenido del digestor (bioabono), limpiar y preparar el biorreactor para la siguiente etapa de produccin.

2.8 Ejemplo de valores obtenidos en la produccin de biogas en un biodigestor

Constituido por un cilindro de 55 galones de capacidad (dimetro = 0.56; altura = 0.87 m; volumen total = 0.214 m3)

Mayo Junio con una T promedio de 28.7 C

Volumen de sustrato : 4/5 del biodigestor = 0.172 m3 Sutrato : 70 kg de estircol (conejos, cuyes, gallinas, vacuno) mas

restos vegetales mas 70 kg de agua (dilucin 1:1)

Fecha de carga

: 20_04

S.T. (%) Inicial

: 47.5

S.V. (%) Inicial

: 85.45

pH inicial

: 6.9

Fecha de trmino: 09_06

S.T.

: 64.27

S.V.

: 54.22

pH final

: 7.2

Buffer

: 2% (1.4 kg de CaO)

Fecha de inicio de la produccin del biogas: 30/04

Da de mxima produccin diaria

: 26avo Tiempo de retencin

: 40das

Antes de la pre fermentacinDespus de la Pre fermentacinDespus de la digestin

Slidos totales (%)

Slidos voltiles (%)

pH

Alcalinidad (%)

Nitrgeno (%)

Carbono (%)

Fsforo (%)

Tiempo de retencin (das)

Produccin de biogas / m3

90.77

79.58

6.7

0.21

0.68

20.37

0.6847.5

85.45

6.9

0.86

1464.27

54.22

7.2

1.9

1.79

0.173

1.79

40

0.7407 m3

3. Anexo

3.1 Mtodo Gravimtrico para determinar los slidos totales

a) Pesar una muestra de sustrato.

b) Colocar la muestra en un crisol y llevarla a la estufa a una temperatura de 105 C durante 24 horas.c) Sacar la muestra de la estufa y llevarla a un desecador durante 15 minutos.

d) Pesar la muestra seca.e) Calcular el porcentaje de slidos totales.

S.T.(%) = PS_ X 100

PT

Donde:

ST = Slidos totales (%)

PS = Peso de la muestra seca

PT = Peso total inicial de la muestra

3.2 Mtodo Gravimtrico para determinar los slidos voltiles

a) Calcular el peso de los slidos totales.

b) Llevar la muestra seca a un horno de incineracin o mufla a una temperatura de 550 C durante tres horas.c) Sacar la muestra del horno de incineracin y llevarla a un desecador durante 15 minutos.d) Pesar la muestra (cenizas) y calcular el porcentaje de slidos totales.

S.V.(%) = (P.S.T - PC)_ X 100

P.S.T

Donde:

S.V = Slidos voltiles (%)

P.S.T = Peso de slidos totales

P.C = Peso de las cenizas

Obtencin de biomasa microbiana a partir de desechos industriales

1. Introduccion

Los mtodos convencionales para producir alimentos ricos en protenas no son suficientes para cubrir la alta demanda de stos a nivel mundial. La deficiencia alimenticia de los animales, en cuanto a protenas se refiere, as como la contaminacin por desechos agroindustriales por la falta de educacin y gestin ambiental conlleva a que las nuevas tecnologas como la Biotecnologa aprovechen en el plano tecnolgico las propiedades y posibilidades de los microorganismos para hacer un uso mas eficiente y racional de los desechos y subproductos renovables.

La protena microbiana representa un alternativa de importancia fundamental para complementar dietas en la alimentacin animal. De todos los microorganismos estudiados para la produccin de biomasa microbiana los mas recomendados son las levaduras como Candida utilis, C. lipolytica. C. rugosa, Saccharomyces cerevisiae y K. marxianus. Los valores promedio de protena varan entre 33 y 45 %, con un elevado porcentaje de lisina (7 a 9 %), un bajo porcentaje de aminocidos azufrados (0,7 a 1,7 % de cistena y de 1 a 2 % de metionina), un contenido insignificante de cidos nucleicos y adicionalmente vitamina B y minerales.

Los sustratos utilizados para la produccin de protena microbiana incluyen fuentes de carbono fsil (hidrocarburos lquidos y gaseosos), fuentes de carbono renovables como melaza, suero e hidrolizados de polisacridos y fuentes de nitrgeno como las vinazas. La melaza es un subproducto de la elaboracin de azcar de caa y constituye el jarabe residual de jugo concentrado de azcar de caa una vez separados los cristales de azcar. Contiene del 48 al 55 % de azcares especialmente sacarosa y es de de fcil adquisicin y econmico, resultando ser muy efectivo como fuente de energa y minerales para el desarrollo de microorganismos como las levaduras. La vinaza es el subproducto de la fermentacin industrial de la melaza para la obtencin de alcohol, levaduras, cido ctrico, lisina o antibiticos. El contenido de azcares de las vinazas es sensiblemente inferior al de las melazas, aumentando en cambio la proporcin de protena bruta y cenizas. La vinaza es eliminada como agua residual, con alto contenido de materia orgnica con DBO5 de 15 000 a 20 000 mg/L y tradicionalmente ha sido eliminada directamente a la alcantarilla con consecuencias nefastas de contaminacin porque constituye un caldo de cultivo para la proliferacin de una diversidad de microorganismos.2. OBJETIVOS

2.1 Producir biomasa microbiana de S. cerevisiae en sustrato vinaza - melaza3. METODOLOGIA 3.1 Preparacin del caldo de fermentacinSe prepararn 2 L de caldo de fermentacin en base a una mezcla de vinaza y melaza con 5.13% de AR, 12 Bx y 4.5 de pH. La mezcla ser suplementada con rea (9.30 g/L), fosfato diamnico (0.94 g/L), sulfato amnico (4.72 g/L). El pH del caldo de fermentacin ser ajustado a 4.5 (con cido sulfrico) y posteriormente ser autoclavado a 121 C y 15 libras de presin durante 20 minutos.

3.2 Diseo y acondicionamiento del Biorreactor tipo tanque Batch con flujo descendenteEl biorreactor tipo tanque Batch con flujo descendente, estar constituido por un frasco de vidrio con 1 litro de capacidad cuyo extremo superior estar cubierto por una tapa de goma que presenta dos orificios. El primero de ellos tendr una cnula tapada con algodn para permitir la salida de gases y el segundo de ellos ubicado en el centro permitir la entrada del difusor de aire. El aire ser insuflado por una bomba y posteriormente ser esterilizado a travs del burbujeo en NaCl al 20 %.

Previamente el biorreactor deber se enjuagado con leja al 1 % durante 24 horas y posteriormente ser irradiado con luz ultravioleta durante 30 minutos.

3.3 Obtencin del inculo La cepa de S. cerevisiae seleccionada y mantenida en agar papa dextrosa (PDA) ser reactivada en un tubo conteniendo PDA inclinado a 30 C durante 24 horas.

Posteriormente la cepa ser propagada sobre dos placas de Petri conteniendo PDA, las que sern incubadas a 30 C durante 48 horas. A partir de las colonias desarrolladas se obtendr una suspensin de clulas en solucin salina fisiolgica y de ella se inocular 0.5 mL en un matraz conteniendo 5 mL de caldo de fermentacin vinaza melaza el que ser incubado a 30 C, en agitacin constante (150 rpm) durante 10 horas.

Transcurrido el tiempo los 5 mL del caldo fermentado sern vertidos hacia un matraz conteniendo 50 mL del caldo de fermentacin vinaza melaza, el que ser incubado a 30 C, en agitacin constante (150 rpm) durante 10 horas.

A continuacin se determinar la concentracin de clulas la cual debe estar entre 6 18 X 106 clulas viables / mL (con ayuda de la cmara de Neubauer).

3.4 Multiplicacin de S. cerevisiae en biorreactor tipo tanque Batch con flujo descendente para determinar el tiempo ptimo de incubacinEn el biorreactor tipo tanque Batch con flujo descendente conteniendo 500 mL del caldo de fermentacin; mezcla vinaza melaza se colocarn los 50 mL del inculo previamente estandarizado (10 % del contenido del biorreactor) y se dejar en incubacin a 30 C durante 20 horas.

Durante todo el proceso, cada 2 horas y a partir del momento de la inoculacin se tomarn muestras de 0,5 mL del caldo de fermentacin para realizar el conteo de clulas viables.

Con los datos obtenidos se preparar la curva de crecimiento y se determinar el tiempo requerido para alcanzar el final de la fase exponencial o tiempo ptimo de incubacin.

3.5 Produccin de biomasa de S. cerevisiae en biorreactor tipo tanque Batch con flujo descendenteDe manera similar a lo explicado en el item 3 y 4, se llevar a cabo la obtencin del inculo y la multiplicacin de S. cerevisiae en el biorreactor tipo Batch con flujo descendente con la diferencia de que ya no se tomarn muestras de caldo de fermentacin cada dos horas. Slo se tomar una muestra de 0.5 mL despus de la inoculacin y al final del tiempo ptimo de incubacin para determinar el nmero de clulas viables por mL del caldo de fermentacin.

Terminado el proceso se proseguir con la centrifugacin y lavado del producto.

3.6 Centrifugacin y lavado del productoCuando se ha terminado la fermentacin en el sistema Batch, despus de 20 horas se centrifugar todo el material fermentado a 2500 rpm durante 8 minutos para eliminar la parte lquida : romanaza (aproximadamente 800 a 860 mL/L de vinaza melaza, con 10 Brix y pH 5).

El sedimento o producto es la crema de la levadura (aproximadamente 140 a 200 mL) y deber ser lavada con 500 mL de solucin salina fisiolgica estril, y con movimientos rotatorios durante 20 minutos.

Posteriormente se centrifugar por segunda vez a una velocidad de 3100 rpm, durante 3 minutos. Se eliminar el sobrenadante y el sedimento constituir la crema de la levadura lavada (aproximadamente 140 a 200 mL).

3.7 Secado de la crema de levaduraLa crema de levadura lavada ser depositada sobre la base de una placa de Petri resistente al calor y ser deshidratada en la estufa a 60 C durante 3 horas. El producto resultante tendr la apariencia de una champa de barro ligera seca.

3.8 Producto terminadoInmediatamente despus de salir de la estufa a 60 C, la crema de levadura seca ser depositada en un recipiente metlico y ser llevada a congelacin (0 C) durante 15 minutos.

El choque trmico permitir la ruptura de la pared celular de las levaduras para que su contenido sea ms digerible por los animales.

La levadura saliente de la nevera ser sometida a un pulverizado utilizando un mortero hasta tener un polvillo de grnulos finos de color pardo.

Finalmente la levadura deber ser pesada (aproximadamente 29,38 g de levadura forrajera seca y bruta por litro de sustrato vinaza melaza, lo que significa un 42% de rendimiento sobre los azcares reductores iniciales y sobre una base de conversin del 98%).

3.9 Anlisis de la Biomasa Microbiana

Determinar

% de humedad

% de ceniza total

% de nitrgeno total

ANEXOMetodologa a seguir para determinar las caractersticas de la mezcla vinaza melaza que permite el crecimiento ptimo de S. cerevisiae

a. Preparar tres mezclas de vinaza melaza con 12 Bx, 14 Bx y 16 Bx.

b. Inocular S. cerevisiae en cada una de las mezclas. Inmediatamente despus tomar una muestra para determinar el nmero de clulas viables por mililitro.

c. Despus de 20 horas de incubacin, en agitacin constante a 30C, determinar el nmero de clulas viables por mililitro.

d. Determinar el porcentaje de azcares reductores de la mezcla vinaza melaza que permiti el mayor incremento de S. cerevisiae.

e. Preparar la mezcla vinaza melaza con el porcentaje de azcares reductores requeridos por S. cerevisiae.1. Medicin del Brix

1.1 Colocar en una probeta 250 mL de una mezcla de vinaza melaza.

1.2 Dejar reposar durante 30 minutos.

1.3 Medir el Brix con el brixmetro y siultaneamente tomar la temperatura para hallar el Brix corregido mediante las tablas correspondientes.2. Anlisis del contenido de azcares reductores (Mtodo de Lane - Eynon)

2.1 Pesar 20 g de la mezcla vinaza melaza con el Brix seleccionado.

2.2 Verter en un baln de 100 mL.

2.3 Aadir 0,5 de fenolftalena (0,5%) y posteriormente titular con NaOH 1 N hasta que aparezca una coloracin grosella estable.

2.4 Aadir HCl 0, 2 N hasta eliminar el color grosella.

2.5 Agregar 15 mL de EDTA 4 % y posteriormente completar con agua hasta los 100 mL.

2.6 Filtrar, tomar aproximadamente 15 mL y titular con la solucin Soxhlet (en un Erlenmeyer mezclar 5 mL de Fehling A ms 5 mL de Fehling B).

2.7 Poner a ebullicin durante 2 minutos, adicionar 2 gotas de azul de metileno al 1% y seguir titulando.

2.8 Detener la titulacin y anotar el gasto en el momento del viraje de azul a rojizo.

Ejemplo:

Se tomaron 20 g de la mezcla vinaza- melaza en 100 mL de agua.

V1 = Gasto titulado equivalente a 22, 30 mL.

Buscar en la Tabla de Spencer el porcentaje de azcares reductores que le corresponde al gasto en la titulacin (F). En este caso F = 51,0.

% AR = F x 10 = 51,0 x 10

V1 x g 22,3 x 20

% AR = 1,14%

3. Ejemplo de resultados en la seleccin del Brix ptimo de la mezcla vinaza melaza para el crecimiento de S. cerevisiaeMuestra de mezcla123

Brix inicial

Brix final

Densidad inicial

Densidad final

pH inicial

pH final

% de Azcares reductores inicial

% de Azcares reductores

final

N de clulas / mL inicial

N de clulas/ mL final 12 Bx

8,55 Bx

1,04541

1,03113

4,5

4,5

5,7

1,19

10 X 106

4,5 X 10814 Bx

9,73 Bx

1,05385

1,03597

4,0

4,0

6,14

1,80

21 X 1062,67 X 10816 Bx

9,94 Bx

1,06241

1,03684

4,5

4,5

7,46

1,70

16 X 106

6,75 X 108

La mezcla seleccionada ser la 1 porque con ella se logr el mayor incremento en el nmero de clulas de levaduras con respecto al nmero inicial. Una vez determinado el Brix de la mezcla vinaza melaza ptimo, se determina la cantidad de azcares reductores que en este caso para la mezcla 1 fue de 5, 7%.

4. Obtencin de 100 mL de una mezcla de vinaza melaza con el porcentaje de azcares reductores requeridos.

4.1 Caractersticas de los sustratos

Vinaza no clarificada a 5.27 Brix

Densidad 1,021 g/mL

20 C

0.65 % de AR

Melaza a 89.16 Brix

Densidad 1,48 g/mL

20 C

56.18 de AR

4.2 Gramos de slidos totales de la mezcla vinaza melaza:Sean x los mL de melaza

Sean 1000 X los mL. de vinaza

Entonces:

g de melaza = (x mL ) (densidad de melaza, g/mL).................................(1)

de melaza = (1000 x mL) (densidad de vinaza, g/mL)........................(2)

Reemplazando valores en las ecuaciones (1) y (2)

g de melaza = (x mL ) (1.480 g/mL) = 1.480x g de melaza

g de melaza = (1000 x mL) (1.021 g/mL) = 1021 1.021x g de vinaza

Sumando ambas ecuaciones:

(1021 + 0.459x) g de slidos totales de la mezcla vinaza melaza

4.3 Gramos de azcares reductores de la mezcla vinaza melaza:

Sean las fracciones de los Azcares reductores (AR):

Melaza = % AR/100 = 56.18/100 = 0.56

Vinaza = % AR/100 = 0.65/100 = 0.0065

Sea el total de AR:

Melaza:(g de melaza) (fraccin en peso)

(1.48x g) (0.56) = 0.83x g de AR

Vinaza:(g de vinaza) (fraccin en peso)

(1021 1.021x g) (0.0065) = (6.64 0.00664x) g de AR

Total de AR de la mezcla vinaza melaza

(AR de melaza) + (AR de vinaza)

(0.83x g) + (6.64 0.00664x) g

(6.64 + 0.8293x) g de AR totales de la mezcla vinaza melaza

4.4 Igualando con el porcentaje de AR totales requerido (5.13 %)

5.13% = g de ART de la mezcla vinaza melaza_____ 100 g deslidos totales de la mezcla vinaza - melaza

5.13% = (6.64 + 0.8293x) g (100)__

(1021 + 0.459x) g

5237.73 + 2.354x = 664.0 + 82.93x

457.73 = 80.576x

x = 56.76

Redondeandox = 57 mL. de melaza

4.5 Reemplazando valores

Vinaza = 1000 x

= 1000 57

= 9443 g de vinaza

Para la obtencin de 1000 m de una mezcla vinaza melaza que contenga 5.13% de AR Totales se necesitarn 943 mL de vinaza con 57 mL de melaza a las condiciones dadas al principio (caractersticas de los sustratos). Esto corresponde a una mezcla / vinaza con 12 Brix y una proporcin de 17:1.

5. Clculo de los grados Brix y de la razn de la mezcla vinaza melaza

943 mL de vinaza con 5.27 Brix y 1.021 g / mL de densidad

57 mL de melaza con 89.16 Brix y 1.48 g / mL de densidad

5.1 Grados Brix de la mezcla vinaza melaza

5.1.1 Balance en pesoFrmula: A + B = C............................................(1)

Donde : A = gramos de melaza

B = gramos de vinaza

C = gramos de producto

Entonces: A = (mL de A) (densidad de A)

B = (mL de B) (densidad de B)

5.1.2 Balanceando con respecto del Brix

A(BxA) + B (BxB) = C (BxC)..(2)

Reemplazando (1) en (2) tenemos:

A(BxA) + B (BxB) = (A + B) (BxC).(3)

Reemplazando valores numricos en (3):

((57)(1.48)((89.16Bx) + ((943)(1.021)((5.27Bx) = (A + B) (BxC)

(84.36)(89.16Bx) + (962.80)(5.27Bx) = (84.36 + 962.80)g(BxC)

7521.54 + 5073.96 = 1047.16 (BxC)

BxC = 12.03 = 12

5.2 Razn (en unidades de volumen) de la mezcla vinaza melaza

Vinaza = 943 mL = 16.5

Melaza 57 mL

Redondeando = 17

Vinaza: Melaza = 17: 1

6. Control Qumico de una muestra de vinaza

ANALISISVINAZA

Brix Refractomtrico, 20 C

Grado Alcohlico, GL

Nitrgeno, %

Protenas, %

Slidos totales por desecacin % (P/V)

Cenizas por Ignicin, %

Fosfatos, % PO4-3Dureza total, % CaCO3Dureza clcica, % CaCO3Reductores, %

Oxido de Calcio, % CaO

Acidez Sulfrica, %5,27 5,4

0,00

0,15

0,98

5,04

1,14

2,35

28,36

13,38

0,70

0,21

0,25

7. Control Qumico de una muestra de melaza

ANALISISMELAZA

Grado Alcohlico, GL

Brix Hidromtrico, 20 C

Polarizacin, 20 C

Pureza aparente, %

Sacarosa, %

Pureza real, %

pH

Acidez, mg cido/ 100 gr melaza

Oxido de Calcio, %

Reductores, %

Lodos, %0

86,60

32,0

36,95

36,86

42,56

5,6

1,593

1,4

52,55

8

BIOPLASTICOS: BACTERIAS PRODUCTORAS DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHAS)

1. INTRODUCCION

La industria del plstico produce alrededor de 165 millones de kilos, y un 40 % de dicha cantidad inmediatamente despus de su uso es desechado. Los residuos slidos incluyen polmeros sintticos como polietileno, polipropileno, poliuretano, policloruro de vinilo, poliestireno, tefln, acetato de celulosa, siliconas, todos polmeros sintticos muy recalcitrantes a la degradacin microbiana y que permanecen sin alterarse durante dcadas en los lugares de acumulacin de residuos.

El problema es un incentivo para la bsqueda de alternativas biodegradables, que se empleen normalmente y se han conseguidos plsticos fotodegradables (material cuya estructura polimrica se altera mediante exposicin a los rayos ultravioleta produciendo polmeros modificados susceptibles al ataque microbiano), plsticos que llevan incorporadas molculas de almidn y plsticos de origen microbiano.

Los bioplsticos o poli B hidroxialcanoatos son sintetizados por microorganismos a partir de sustratos agrcolas, pueden ser degradadados a dixido de carbono y agua en condiciones aerobias o a metano en condiciones anaerobias, en hbitats diversos como suelo, mares, aguas residuales. Los poli B hidroxialcanoatos (PHAs) se presentan como los candidatos ideales para reemplazar los plsticos de origen petroqumico. Bajo este ttulo se conocen ms de 90 polmeros y constituyen una serie de polisteres sintetizados como materiales de reserva por algunos gneros bacterianos, cuando el medio de cultivo se encuentra desbalanceado con limitacin en nitrgeno, fsforo, azufre, magnesio y/o con oxgeno y con exceso de fuentes de carbono.

Aunque se ha detectado la acumulacin de PHAs en cerca de 300 especies bacterianas, el porcentaje de acumulacin en muchas de ellas es muy bajo por lo cual se rechazan