UNIVERSIDAD AUTONOMA “BENITO JUÁREZ” DE OAXACA ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

7º SEMESTRE DE LA CARRERA DE MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA

NOMBRE DEL ALUMNO: ______________________________________________________________

CICLO ESCOLAR: ________________________________ MESA No. __________________

OAXACA, OAX. 2014

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

DE ENFERMEDADES PARASITARIAS

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MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE

ENFERMEDADES PARASITARIAS

MVZ. RICARDO CERVANTES VÁSQUEZ

CATEDRÁTICO TITULAR

C O N T E N I D O :

I.- INTRODUCCIÓN.................................................................................................................3

II.- OBJETIVOS GENERALES..................................................................................................4

III.- OBJETIVOS ESPECIFICOS...............................................................................................4

IV.- PRACTICAS DE LABORATORIO

Práctica No. 1 Conocimiento y uso del laboratorio de Parasitología.........................................5 Práctica No. 2 Medición y dibujo integral de parásitos………………………………………..….10 Práctica No. 3 Recolección y envío de muestras para el laboratorio de parasitología............14 Práctica No. 4 Examen postmortem de animales para diagnóstico parasitario…...................28 Práctica No. 5 Fijación, tinción y montaje de especimenes....................................................36 Práctica No. 6 Diagnóstico coproparasitoscópico, métodos macroscópicos...........................42 Práctica No. 7 Diagnóstico coproparasitoscópico, métodos cualitativos directos....................46 Práctica No. 8 Diagnóstico coproparasitoscópico, métodos cualitativos indirectos..................55 Práctica No. 9 Diagnóstico coproparasitoscópico, métodos de migración larvaria…………….59 Práctica No. 10 Diagnóstico coproparasitoscópico, métodos cuantitativos..............................63 Práctica No. 11 Técnicas de diagnóstico parasitario especiales ………………………………..70

V.- REVISIÓN Y CALIFICACIÓN DE PRÁCTICAS

VI.- APENDICES

Apéndice 1. Formatos. Apéndice 2. Preparación de reactivos y soluciones usadas en parasitología Apéndice 3. Catalogo de diferenciación de huevecillos de parásitos Apéndice 4. Claves gráficas para la identificación de parásitos. Apéndice 5. Guía de identificación de parásitos sanguíneos

VII.- BIBLIOGRAFÍA

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I.- INTRODUCCIÓN

Una enfermedad parasitaria o parasitosis es una enfermedad infecciosa causada por protozoos, vermes (cestodos, trematodos, nematodos) o artrópodos. Las parasitosis son estudiadas por la parasitología. No se consideran parasitosis las infecciones por hongos, bacterias o virus que, tradicionalmente, han sido estudiados por la microbiología.

Las enfermedades parasitarias pueden adquirirse a través de los alimentos o del agua contaminada (como la fasciolasis o la teniasis), por la picadura de un insecto (como el paludismo o la piroplasmosis) o por contacto sexual (como la tricomoniasis bovina), y pueden causar desde molestias leves hasta la muerte.

Las infecciones parasitarias causan enormes daños en las regiones tropicales y subtropicales, por lo que es importante la emisión del diagnóstico oportuno y eficaz.

El diagnóstico de las parasitosis en animales domésticos es una herramienta indispensable de trabajo para el médico veterinario, quien necesita conocer en forma precisa la situación parasitológica del ganado a fin de poder establecer el tratamiento adecuado y poder dar sugerencias y recomendaciones al ganadero. Uno de los principales problemas parasitarios que afectan a los animales domésticos son los causados por nematodos gastroentéricos (NGE). El diagnóstico para este grupo de parásitos se basa en el uso tradicional de técnicas coproparasitoscópicas cualitativas como son la técnica de flotación, la cual permite identificar la presencia de huevos de NGE; así como las técnicas de Baermann y coprocultivo, que permiten obtener estadios larvales de estos parásitos para finalmente poder identificar en forma específica el genero de algunos nematodos. Asimismo, se cuenta con técnicas coproparasitoscópicas cuantitativas con un rango de sensibilidad de 10 a 50 huevos por

gramo de heces (hpg), como ejemplo están la técnica Universal (10 hpg), la de Stoll (20 hpg); así

como la técnica de McMaster ( 50 hpg), siendo ésta última la más empleada debido a que es rápida y sencilla. Tanto las técnicas cualitativas como las cuantitativas son complementarias y conducen hacia un diagnóstico confiable de NGE. La metodología general para dichas técnicas se basa en la obtención de 2 a 10 g de muestra fresca de heces colectada directamente del recto (para evitar contaminación con nematodos del suelo), y posterior análisis del número de huevos, o bien para ser procesadas mediante un coprocultivo para la obtención e identificación de larvas infectantes de NGE, presentes en dicha muestra. La especificidad de las técnicas cualitativas es muy importante para determinar los estadios biológicos presentes, por ejemplo en la técnica de flotación se observarán huevos de NGE flotando, lo cual es debido a gradientes de densidad (1:05-1:15), quedando en el sedimento partículas de mayor peso específico. Asimismo, características de conducta como fototropismo y termotropismo son el fundamento de la técnica de Baermann, ya que las larvas son atraídas por la luz y la temperatura, ésta técnica es recomendada para el diagnóstico de nematodos pulmonares y para la colecta de larvas infectantes. Asimismo, para identificar NGE y colectar larvas se debe de proporcionar un medio que permita su desarrollo biológico, para ello se realizan coprocultivos con diferentes substratos como hule

espuma y serrín, para permitir la conservación de temperatura (25-30C) y humedad (80-100%), además de proporcionar nutrientes a las fases de desarrollo de huevo a larva infectante.

En los últimos años, con objeto de incrementar la sensibilidad y especificidad de diagnóstico en NGE, nuevos métodos de diagnóstico molecular como la reacción en cadena de la polimeraza (PCR), la técnica de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción en conjunto con PCR (PCR-RFLP), la técnica de hibridación y análisis de ADN, y la construcción de bibliotecas de expresión de ADN, entre otras, están siendo integradas en la identificación y cuantificación de NGE, así como para obtener genes de importancia en la interacción hospedero-parásito. Actualmente existen técnicas para procesar pequeños fragmentos de ADN con objeto de identificar las diferentes especies de un mismo

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genero como Haemonchus spp y Ostertagia spp. Asimismo, el diseño de iniciadores específicos y la presencia repetida de una plantilla de ADN dentro del espaciador interno (ITS) de el ADN ribosomal, han sido de gran utilidad para llevar a cabo estudios filogenéticos y semi-cuantitativos de NGE. Debido a la diferencia de tamaño de los productos generados en PCR del ADN de Ostertagia ostertagi y ADN de otros trichostrongylidos (Haemoncus contortus, Cooperia oncophora y Oesophagostomum radiatum), iniciadores específicos de PCR pueden ser usados en forma semi-cuantitativa, alcanzando una sensibilidad de 0.05 huevos de O. Ostertagi. Esta metodología tiene la gran ventaja de poderse aplicar a otros NGE, lo cual disminuiría el tiempo invertido en estudios coproparasitoscópicos cuantitativos y cualitativos. Asimismo, la secuenciación completa del genoma del nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans ha permitiendo identificar genes relacionados con resistencia a antihelmínticos y productos de genes con potencial como agentes inmunizantes contra Haemonchus contortus y Trichostrongylus colubriformis. Debido a la alta sensibilidad de estas pruebas es posible detectar individuos mutantes en los cuales este implicada la resistencia antihelmíntica con base en su ADN para poder determinar medidas preventivas de manejo. La técnica de alelos-específicos en conjunto con PCR ha sido de gran apoyo para estos estudios y parece indicar que grandes cantidades de muestras podrían ser procesadas y así apoyar estudios epidemiológicos. Otros estudios han podido predecir la posible función y localización de las proteínas expresadas por genes obtenidos de poblaciones resistentes a antihelmínticos en C. elegans transgénicos. Además, debido a la relación filogenética de este nematodo de vida libre con NGE, la secuencia de genes de C. elegans ha sido una importante fuente para estudiar genes relacionados con otros nematodos parásitos. Un interesante análisis molecular de nematodos parásitos y C.elegans fue realizado para determinar la diversidad y evolución con objeto de apoyar estudios morfológicos y filogenie. Otra importante herramienta molecular es la conducción de PCR usando uno de los iniciadores con un marcador fluorescente, esta prueba es usada en hibridación de ADN. La introducción de quimioluminiscencia para detectar ADN sustituye en muchos casos el uso de pruebas radioactivas (como es el uso de 32P radiactivo) las cuales requieren de equipo especial y personal capacitado. Si bien las nuevas técnicas sofisticadas de diagnóstico son costosas, el futuro que se observa con el uso de estas técnicas moleculares vislumbra un mejor panorama en el diagnóstico para un mejor control de los NGE, así

como un mecanismo preventivo y no correctivo de estas parasitosis. Sin embargo, los métodos

tradicionales de diagnóstico que siguen siendo sencillos, prácticos y económicos, no deben

descartarse pues son excelentes herramientas de diagnóstico. La utilización de ambas

metodologías deben ser consideradas como complementarias para lograr un mejor diagnóstico

y sirvan de apoyo al medico veterinario y al productor.

II.- OBJETIVOS GENERALES Al terminar el curso, el alumno será capaz de aplicar técnicas básicas de colección de muestras parasicológicas y desarrollar habilidades para la realización de exámenes parasitarios en el laboratorio, e integrar los datos clínicos y epidemiológicos para establecer el diagnóstico de las principales enfermedades parasitarias de los animales domésticos. Reconocerá la importancia de las enfermedades parasitarias, los factores ecológicos de adaptación parasitaria y señalará la distribución geográfica de los mismos. Así mismo, reconocerá la patología, sintomatología, diagnóstico, tratamiento y prevención de las enfermedades parasitarias mas frecuentes en el país, y establecerá las medidas preventivas de las zoonosis.

III.- OBJETIVOS ESPECIFICOS

Estos se señalan a continuación, al inicio de cada práctica

IV.- PRACTICAS DE LABORATORIO

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PRACTICA No. 1

“CONOCIMIENTO Y USO DEL LABORATORIO DE PARASITOLOGIA”. A. OBJETIVOS ESPECIFICOS

a.1.- Conocer y familiarizarse con el uso de los distintos elementos que se usan en el laboratorio de

parasitología.

a.2.- El alumno conocerá las reglas del laboratorio y se integrará a un subgrupo para desarrollar el

trabajo en equipo.

B. MAT ERIAL Y EQUIPO A UTILIZAR

b.1.-. Microscopio compuesto.

b.2. Microscopio esteroscópico.

b.3. Micrómetro ocular y micr6metro objetivo Cámara clara de Abbe.

b.4. Centrifuga eléctrica.

b.6. Tubos de centrífuga, ensaye y gradillas.

b.7. Porta objetos y cubreobjetos.

b.8. Agitadores de vidrio, asas do platino, espátulas, pipetas petas.

b.9. Vasos de precipitados de vidrio, plástico, cucharas y probetas.

b.10. Morteros de porcelana.

b.11. Coladeras de plástico, metálicas y embudos.

b.12. Gasa para filtrar, papel secante, papel filtro.

b.13. Copa de sedimentación.

b.14. Densímetros.

b.15. Balanza con marco de pesas.

b.16. Triquinescopio

b.17. Equipo fotográfico

b.18. Refrigerador y congelador.

b.19. Estufa de incubación.

b.20. Mechero de Bunsen.

b.21. Aparato do Baerman.

b.22. Cámaras de Mac Master.

b.23. Lupa.

b.24. Mangueras de hule látex.

b.25. Cubetas de plástico.

b.26. Cesto de basura.

b.27. Armario para equipo y productos químicos.

b.28. mesas de laboratorio.

b.29. Estuche de disecciones.

b.30. Frascos de boca ancha

b.31. Cajas de Petri y vidrios de reloj

b.32. Hisopos y agujas de disección

b.33. Soluciones, colorantes y reactivos

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C. PROCEDIMIENTOS:

c.1.- De acuerdo al número de alumnos el grupo se dividirá en 6 equipos de 5 o 6 alumnos, con un

representante, el cual será responsable del equipo y material usado en cada práctica.

c.2.- Se dará lectura a las siguientes reglas del laboratorio: * Cada alumno deberá presentarse con bata blanca de manga larga a las prácticas.

* Es indispensable observar puntualidad y buena conducta entre los alumnos.

* Los alumnos deberán traer el siguiente material individualmente: Manual de prácticas Lápices de colores. Estuche de disecciones. Un jabón personal para manos 40 porta objetos. 40 cubre objetos. Estos últimos materiales son para que el alumno se los puedan llevar a su casa, una vez concluido el ejercicio. * Los alumnos que no aporten el material que les sea solicitado para alguna de las prácticas no podrán entrar al laboratorio

* No se permitirá fumar ni comer en el laboratorio. Y los celulares deberán ser apagados.

* Después del uso de los microscopios y equipo, será obligación del representante de cada mesa,

recogerlo y guardarlo en su lugar.

* Cada alumno deberá recoger su banca y almacenarla o apilarla en el lugar de donde fueron

tomadas.

* Queda estrictamente prohibido extraer del laboratorio cualquier equipo, microscopio o material, sin

la autorización del responsable del laboratorio o autoridades administrativas de la Escuela.

* Los alumnos que tengan el pelo largo deben mantenerlo recogido para evitar accidentes, sobre

todo al trabajar con mecheros. Igualmente no deben entrar con cachuchas.

* Los accidentes durante las prácticas deberán ser reportados al instructor del laboratorio

para su debida atención. El laboratorio de parasitología no se hará responsable de los

accidentes.

* En las prácticas en que se manejen especies animales de laboratorio, los alumnos se encargarán

de conseguirlos directamente del bioterio o tiendas especializadas. No se deben usar animales

callejeros o de procedencia desconocida.

* Queda prohibida la vivisección.

* No almacenar material en el refrigerador, sin instrucciones del profesor

* Los excrementos, cadáveres y material orgánico utilizado deberá colocarse en bolsas de

papel dispuestas para ese fin, al término de la práctica.

* Se deben utilizar recipientes adecuados para depositar los residuos peligrosos, biológico -

infecciosos que se generen en la realización de la práctica. No tirar nada en los lavabos. El material

de desecho no contaminado como papeles de envoltura depositarlos en los recipientes de basura

común.

* Los representantes de cada equipo, harán entrega del material y equipo usado durante la

práctica al instructor del laboratorio. * Para poder retirarse del laboratorio, es obligatorio para todo alumno, presentar su práctica

debidamente elaborada y terminada, para que el instructor otorgue la firma, sello y

calificación individual. * Las violaciones al presente reglamento se podrá ver reflejadas en la calificación asignada al

aprovechamiento escolar del alumno, y por lo tanto poder afectarse el derecho a examen ordinario.

c.3.- El alumno distinguirá el quipo necesario con el que debe contar un laboratorio de parasitología.

c.4.- Manejo del microscopio. Un microscopio es una lente de aumento ordinario, con al cual se puede

observar multitud de objetos microscópicos, El microscopio compuesto, difiere del microscopio

simple porque tiene dos sistemas de lentes, uno conocido por objetivo y otro por ocular, usualmente

montados en un tubo o cuerpo del microscopio, la imagen que uno ve tiene un aumento igual al

producto de la multiplicación del aumento de los dos sistemas de lentes. El microscopio se

conforma de 3 sistemas básicos:

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Sistema óptico: El cual está formado por los oculares, objetivos y el condensador.

Sistema mecánico está formado por un soporte, el tubo el brazo, la platina, el revolver y el tornillo,

para subir o bajar el condensador do la luz.

Sistema de iluminación: formado por un espejo cóncavo o una fuente luminosa (opcional).

FIGURA No. 1.1 Microscopio esteroscópico

Max N. Silvernale

Una vez que ya se conocen las partes fundamentales del microscopio compuesto, se podrá

proceder al manejo y su uso. Primeramente los alumnos observarán el correcto traslado del

microscopio, utilizando para ello las dos manos, la mano derecha tomará firmemente el brazo del

microscopio, mientras que la mano izquierda lo sujetará por la base, teniendo especial cuidado en

no arrastrar el cable de enchufe. Ver figura 1.2.

FIGURA No. 1.2. Modo de transporte del microscopio

González R. y García S.

Para hacer una observación correcta, una vez quitado la funda y conectado el microscopio, primero se iluminará bien el campo microscópico; después se colocará la preparación para observar sobre la platina y se usará el objetivo seco débil para localizar la estructura a analizar. Si el material u objeto para observar es relativamente grande (100 micras o mas), quizá baste con este objetivo, pero si es mas pequeño, entonces se usará el seco fuerte (40X), o el de inmersión (100X). Se debe recordar que si se usa este último objetivo, se usará una gota de aceite de cedro entre la preparación y el lente objetivo, de manera que se aproveche al máximo los recursos de iluminación

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Una vez elegido el lente por usar, mediante movimientos más o menos rápidos, con el tornillo macrométrico, se aproximará el enfoque y posteriormente mediante el tornillo micrométrico se terminará de enfocar correctamente. Hay que recordar que algunos tipos de microscopios no tiene topes que detengan los objetivos antes de llegar a la preparación, llevando riesgos de estrellar o romper el lente. En estos casos es necesario mirar por un lado del microscopio con el objeto de

evitar que la lenta tenga contacto con la preparación. Mecánica de enfoque: Este procedimiento debe realizarse cuando el microscopio es de uso personal, ya que el enfoque se adapta al poder visual de quien usa el microscopio, aspecto que no podrá hacerse en el laboratorio de la escuela por haber varios usuarios (alumnos). Para iniciar el enfoque, el revolver debe estar colocado en el objetivo de menor

aumento, y subir la platina hasta el tope.

Encender el microscopio, observando que el regulador de voltaje se encuentre en cero.

Aumentar paulatinamente la intensidad de luz sin que esta moleste la vista.

En la parte frontal del cabezal del microscopio, existe una graduación que permite dar apertura angular de los ojos.

Observar que ésta esté en el número correcto para cada observador.

Colocar la preparación con cuidado, fijándose que el objeto a observar quede en el plano superior.

Cerrando ligeramente el ojo izquierdo, enfocar la preparación con el tornillo macrométrico hasta que quede en foco. (enfocar solo con el ojo derecho).

Cerrando el ojo derecho y utilizando el tornillo óptico que se encuentra en el tubo ocular izquierdo, enfocar la preparación hasta que se vea nítido. En este momento, el microscopio se encuentra calibrado a nuestra agudeza visual,

Colocando los dedos índice y medio en la cremallera del revolver, dar vuelta al mismo tiempo hasta poner el objetivo que le sigue en aumento, (10X). Si es necesario;

realizar un pequeño enfoque con el tornillo micrométrico.

c.5.- Iluminación del microscopio OLIMPUS de investigación (iluminación según Koehler). Para una mejor observación de las muestras en el microscopio, deberá seguirse los siguientes pasos:

Colocar el objetivo panorámico (4X)

Poner el botón de la lámpara en posición S

Cerrar el diafragma del condensador y subir este hasta el tope. (Quitar los filtros que tengan intercalados)

Encender la lámpara vía transformador y con luz muy tenue enfocar el filamento del foco.

Centrar el filamento con las perillas laterales colocadas en la parte posterior de la lámpara y regresar el botón de ésta a la posición L.

Cerrar el diafragma de la lámpara con la palanca que se encuentra en la parte anterior de la lámpara.

Abrir los diafragmas de la lámpara y del microscopio hasta que el campo esté perfectamente iluminado.

NOTA: La intensidad de la luz puede regularse con el transformador.

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D.- EJERCICIOS

d.1. El alumno identificará y dibujará 3 piezas de cristalería, 3 aparatos de laboratorio (excepto el microscopio compuesto) y 3 instrumentos de trabajo que se usan en el laboratorio de parasitología.

d.2. El alumno dibujará un microscopio compuesto con los nombres de los componentes que lo integran.

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PRACTICA No. 2

“MEDICION Y DIBUJO INTEGRAL DE PARASITOS”. A. OBJETIVOS ESPECIFICOS

a.1. Conocer y aplicar los medios por los cuales, se pueden medir los parásitos macroscópicos y

microscópicos, incluyendo la calibración del microscopio.

a.2.- Conocer y aplicar las técnicas para dibujar las estructuras de los parásitos.

B. MATERIAL Y EQUIPO A UTILIZAR

b.1. Microscopio compuesto.

b.2. Microscopio esteroscópico.

b.3. Cámara clara de Abbe. b.4. Regla graduada y Vernier. b.5.. Cámara fotográfica con equipo para microscopio.

b.6. Microproyector.

b.7. Escala micrométrica objetiva.

b.8. Escala micrométrica ocular.

b.9. Charola plana porcelanizada.

b.10 Cajas de Petri y asas de platino.

b.11 Preparaciones de parásitos en laminillas

b.12 Céstodos y ascáridos en formol al 1O%.

C. PROCEDIMIENTOS.

c.1. Introducción. Para el conocimiento y estudio de los parásitos, es necesario tomar en cuenta entre

otras características, las diferentes estructuras morfológicas de las partes que los constituyen, para tal

estudio, disponemos de varios recursos, entre ellos: la fotografía, la proyección y el dibujo. El dibujo

integral tiene ventaja al reproducir en un solo plano, los diferentes detalles que tiene una preparación

relativamente gruesa, además de reproducir la estructura y la forma de los parásitos en forma

proporcional y fielmente. Para obtener una imagen del parásito, podemos disponer de varios aparatos,

todos ellos con el objeto de reunir los rayos luminosos que vienen del microscopio. Los aparatos de que

se disponen son: Cámara fotográfica con aditamentos especiales para ajustar al microscopio, el

microproyector, que es un microscopio capaz de proyectar la imagen en una pantalla o la pared, y la

cámara Clara de Abbe, cuyo principio fundamental es la reflexión total que sufren ciertos prismas,

haciendo posible la desviación de los rayos luminosos del microscopio compuesto a una hoja de papel.

Así mismo, los procedimientos electrónicos modernos, a través de la computadora, como el scaneo de

imágenes, las cámaras de video, o cámaras digitales permiten insertar la figura del parásito en cualquier

documento.

c.2. Utilización de la cámara Clara de Abbe. Colocar sobre el ocular la cámara, haciendo coincidir la pupila de salida del microscopio de el orificio del cubo de Abbe; se le da al espejo de la cámara una inclinación de 45 grados para que quede paralelo a la superficie pulimentada del cubo.

Se iguala la iluminación de la preparación y la de la hoja de papel en que se va a dibujar, ya son por me-

dio de filtros, del diafragma del condensador o inclinando convenientemente el espejo del microscopio.

Una vez colocada la cámara de Abbe en el microscopio y colocada la laminilla preparada, se inicia el

dibujo según la imagen proyectada en la hoja de papel. Para el microscopio esteroscópico, colocar la

cámara clara de Abbe en el tubo ocular, poner una preparación en la platina y enfocar; se coloca una hoja

de papel del lado derecho del microscopio y observar a través de la cámara, dibujando la parte de

deseada del parásito. Ver figura 2.1.

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Figura 2.1 Mecanismo para dibujo desde el microscopio

Sin embargo los parásitos microscópicos y las estructuras microscópicas de estos, requieren de la ayuda del microscopio con una escala ocular conocida, para ello es necesario calibrar el microscopio.

TÉCNICA PARA MEDIR PARASITOS MACROSCOPICOS.

Colocar el parásito en una charola plana porcelanizada, o bien, sobre un vidrio. Colocar un regla paralela

por el eje longitudinal a transversal según lo que se quiera medir.

TECNICA PARA MEDICION DE PARASITOS MICROSC0PICOS.

Se coloca sobre la platina del microscopio una escala objetiva y enfocar con el objetivo de 10X las

divisiones centrales de la escala. (figura No. 2.2 A).

Ajustar el ocular micrométrico en el tubo del microscopio y comparar los marcos (figura No. 2.2 B).

c.3.- Fotografía. Para la fotografía se retira el cabezal del microscopio compuesto, se coloca un tubo recto monocular e introducir el adaptador de la cámara fotográfica y ajustarla. Se coloca en la platina una preparación a fotografiar. Se hacen los ajustes necesarios y se toma la fotografía.

c.4.- Microproyector. Se coloca en la platina del microproyector la preparación y se enfoca, observando la imagen proyectada en una hoja de papel o bien en la pantalla. El procedimiento es igual de sencillo cuando se usan los proyectores especiales que tiene conectado una cámara de video y de ésta a la computadora.

c.5.- Medición de parásitos. La mayor parte de los parásitos, macroscópicos resultan relativamente sencillo de tomar sus medidas totales, en general es necesario tomar una regla graduada en milímetros y diferentes utensilios para sostener fijo el parásito.

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En seguida se hace coincidir la primera raya de la escala objetiva con la primera raya de la escala ocular,

haciendo lo mismo con la escala objetiva hasta el punto donde vuelvan a coincidir las dos escalas (figura

No. 2.2 C ).

Figura No. 2.2 Instalación de la escala ocular y objetiva en el microscopio. A colocada la escala objetiva. B se

coloca la escala ocular. C se hace coincidir ambas escalas, rotando la escala ocular y moviendo la platina con sus

tornillos para mover la escala objetiva.

Una vez contado el número de rayas oculares y objetivas, se utiliza la siguiente fórmula:

Núm. de unidades de la escala objetiva X 10

= FACTOR EN MICRAS

El microscopio se ha calibrado para la medición microscópica de parásitos. La escala objetiva tiene un mm de longitud, el cual está dividido en 100 espacios, por lo que cada espacio equivale a diez micras. Para medir parásitos o huevecillos: *. Retirar la escala objetiva de la platina. *. Colocar la laminilla con el parásito que se va a medir y enfocarlo. *. Una vez colocado el parásito en la primera línea de la escala ocular, contar el número de espacios que abarca el objeto que se va a medir y multiplicar el resultado por el factor en micras obtenido con la

formula descrita anteriormente.

Núm. de unidades de la escala ocular.

A B C

ESCALA OCULAR ESCALA OCULAR ESCALA OCULAR

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D.- EJERCICIOS.

d.1 El alumno dibujará un parásito utilizando algunos de los métodos descritos.

d.2 El alumno medirá un parásito macroscópico, utilizando los métodos convencionales como son la regla y el vernier.

d.3 El alumno medirá un parásito microscópico, utilizando el microscopio compuesto y el micrómetro

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PRACTICA No. 3

“RECOLECCION Y ENVÍO DE MUESTRAS PARA EL LABORATORIO DE PARASITOLOGIA”.

A. OBJETIVOS ESPECIFICOS

a.1. El alumno será capaz de recolectar y enviar muestras líquidas y sólidas para el envío al laboratorio

de parasitología y contribuir al diagnóstico parasitario.

B. MATERIAL Y EQUIPO A UTILIZAR b.1. Frascos estériles de boca ancha. b.2. Vasos de precipitados varios tamaños. b.3. Bolsas de polietileno. b.4. Jeringas desechables estériles de 3 y 5 cm. b.5. Tijeras, pinzas. b.6. Ligadura (manguera hule látex) b.7. Alcohol. b.8. Algodón, gasas, estériles y torundas. b.9. Tubos vacuntainer con anticoagulante. b.10. Frasco con anticoagulante E.D.T.A. b.11. Sonda nasofaringea para rumiantes y otra para ovinos y caprinos. b.12. Embudos de plástico. b.13. Hisopos estériles. b.14. Tubos do ensaye con tapón estériles. b.15. .Equipo especial para colección do orina. b.16. Solución salina fisiológica y/o solución amortiguadora de Ringer b.17. Guantes desechables para inseminación artificial. b.18. Botes estériles de boca ancha, de vidrio y con tapa. b.19. Marcadores indelebles. b.20. Estuche de disecciones. b.21. Botas de hule. b.22. Bascula granataria b.23. Tubos de ensaye con tapón b.24. Pipetas con perilla de succión. b.25. Tubos de hule látex. b.26. Termo o caja de unicel con hielo b.27. Algodón, cartulina, corcho, gasas. b.28. Redes de pescar. b.29. Formol al 10% b.30. Etiquetas engomadas b.31. Glicerina neutra b.32. Portaobjetos y cubreobjetos. b.33. Alcohol, éter o cloroformo

C. PROCEDIMIENTOS.

c.1. Introducción: Muchos líquidos del organismo animal son el vehículo ideal para el desarrollo de parásitos, especialmente protozoarios. Dado los métodos especiales que se deben seguir para la recolección de líquidos, se mencionarán a continuación, algunos de ellos para el diagnóstico de: Sangre.- Piroplasmosis, tripanosomiasis, filariasis, leishmaniasis, haemoproteosis, plasmodiosis leucocitozoonosis, etc.

Bilis.- Coccidiosis (Eimeria stidae )

Heces diarreicas.- Coccidiosis, balantidiosis, giardiasis, hexamitosis, etc.

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Exudado vaginal. - Tricomoniasis, durina.

Exudado prepusial.- Tricomoniasis, durina. Exudado nasal y esputo.- Metastrongilosis larvaria, lavado ruminal o gástrico, tricomoniasis, giardiasis, amibiasis, paramfistomiasis, habronemosis, gastorofilosis, nematodosis gástrica. Orina.- Estefanuriosis, dioctofimosis, capillariasis. Líquido cefalorraquídeo.- Toxoplasmosis, piroplasmosis.

Las muestras sólidas corresponden a los siguientes materiales: Heces sólidas.- para diagnóstico de nematodos, céstodos gastroentéricos y larvas Órganos.- para su análisis histopatológico o digestión artificial. Parásitos internos y externos.- para diagnóstico morfológicos Huéspedes intermediarios.- para estudios epidemiológicos y de investigación.

c.2. Recolección de sangre.- La obtención de sangre deberá tomarse de preferencia en los accesos

febriles en cantidades de 3 a 5 ml según la especie animal, y se tomará de los siguientes lugares:

Bovinos.- Vena yugular, vena caudal, vena mamaria

Equinos. - Vena yugular.

Ovino y caprinos.- Vena yugular. rasurar y ligar abajo el cuello

Cerdos.- Vena yugular, vena auricular, vena caudal y punción directa al corazón.

Perros.- y gatos.- Vena safena, vena radial, vena lingual y punción directa al corazón.

Aves.- Vena del ala, punción de cresta, corte de uña o degolladura.

Ratas y ratones.- Vena caudal, subconjuntival y punción directa al corazón.

En todos los casos deberá hacerse una previa desinfección de la zona. Es importante utilizar la aguja de

tamaño correcto para el vaso que deba puncionar, ya que la sangre coagulará rápidamente en agujas

demasiado delgadas. Son recomendables los tubos al vacío ( tubos Vacuntainer). Si no se dispone de

ellos, no debe ejercerse presión fuerte al va ciar la sangre de la jeringa a un tubo con anticoagulante,

para evitar la hemólisis. Es importante recordar que los recipientes deben ser químicamente limpios y

secos, ya que el agua y material orgánico, producen hemólisis. (Ver figura No. 3.1).

Figura No. 3.1 Método de extracción de sangre en equinos y bovinos.

Marek y Mocsy 1973

Otros errores que se cometen en la extracción de sangre son:

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*. El uso de jeringas húmedas o el no retirar la aguja antes de llenar los tubos con anticoagulante

hemolizan los eritrocitos.

*. Cuando la concentración de hemoglobina es mayor de 0.02 g/dl, el suero se apreciará hemolizado

macroscópicamente, aunque en el suero ictérico pueden no detectarse niveles mucho mayores.

*. Los componentes de la sangre con frecuencia se encuentran presentes en concentraciones variables

entre el plasma y los eritrocitos. Si la concentración de los eritrocitos es menor que la del plasma, la

hemólisis producirá un efecto de dilución. Si la concentración de una sustancia es mayor en los

eritrocitos que en el plasma, la hemólisis será más importante.

*. Puede aparecer lipemia si el paciente no ha ayunado por un tiempo adecuado antes de la extracción

de la sangre.

*. Cuando se desea obtener suero, no debe colocarse la sangre en el refrigerador inmediatamente o

antes de la formación de un buen coágulo y de que ocurra la retracción, ya que con esto se retarda la

recolección del suero.

*. Se forma un coágulo de fibrina cuando se centrifuga la sangre después de que se tome la muestra o

cuando la velocidad de la centrífuga es muy rápida.

*. La sangre debe obtenerse cuando el animal está en reposo y sin que esté excitado para evitar

alteraciones en el hemograma y en algunos valores de la química sanguínea.

*. Entre más tiempo se deje la sangre antes de examinarla, mayor será su deterioro.

*. Cuando se toma mucho tiempo para obtener la sangre, de manera que la muestra empieza a

coagular antes de mezclarla con el anticoagulante.

*. Cuando no se agita la muestra de sangre inmediatamente después de colocarla en el tubo y cuando

el tubo se llena demasiado, se produce la coagulación, ya que el anticoagulante no se mezcla

adecuadamente con la sangre.

*. Cuando los tubos contienen solución anticoagulante concentrada, debe tenerse cuidado de agregar

una cantidad de sangre para minimizar el efecto de dilución.

En parasitología, generalmente se utiliza sangre con anticoagulante para la observación microscópica

de células plasmáticas.

c.3. Recolección de bilis.- En el caso particular de Eimeria stidae, se emplea la bilis de conejos

parasitados, recogiéndola con pipetas Pasteur, de la vesícula biliar de un animal necropsiado. Si la

parasitosis es intensa, puede observarse los ooquistes mediante examen microscópico directo; en caso

contrario se efectuará mediante enriquecimiento por sedimentación únicamente, pues la solución

saturado de cloruro de sodio (flotación), coagula la bilis.

c.4. Heces diarreicas o lavado intestinal.- Algunos protozoarios en su forma vegetativa, se recogen

de heces diarreicas o disentéricas, inmediatamente después de la emisión, ayudándose con uno asa de

platino; se toma un fragmento de la materia y se coloca entre dos laminillas con un poco de solución

salina fisiológica (S.S.F.) para hacer un frotis o realizar un cultivo parasitológico. (véase cultivos

parasitarios en apéndice No. 3)

Según la fluidés de los heces diarreicas, podrán recogerse en frascos estériles con pipeta y una ventosa

de hule. Sin embargo en la mayoría de los casos será necesaria la recolección del contenido intestinal

directamente de un animal necropsiado, sumergiendo el intestino en solución salina fisiológica (aves y

conejos) y raspando la mucosa.

Para otras especies (perros, gatos, ovinos y caprinos), se puede intentar el lavado intestinal,

introduciendo tres litros de agua destilada por vía rectal mediante una sonda y un embudo, de tal

manera de recolectar el liquido expulsado después de un masaje abdominal.

c.5. Recolección de exudado o lavado vaginal y prepusial.- En el macho se hace un lavado del

prepucio con solución salina fisiológica aproximadamente de 50 a 200 ml dando un masaje durante 4

minutos, se recolecta en un recipiente y se envía al laboratorio, donde se centrífuga el fluido durante 10

minutos a 2000 r.p.m. y se observa el sedimento al microscopio. En la hembra se puede recolectar

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exudados introduciendo una torunda seca y exprimiéndola en un recipiente con S.S.F. en solución

Ringer para trichomonas (véase apéndice No. 3), para su observación. También se pueden hacer

lavados con estas soluciones dando masaje de la vagina por vía rectal y recolectando el líquido en reci-

pientes estériles. Se pueden hacer recolecciones con el moca vaginal directamente tomado de la vagina

con guantes estériles.

c.6. Recolección de exudado nasal y esputo.- Se toma un hisopo estéril y se hace un raspado en el orificio nasal, se le agrega de 2 a 3 ml. de S.S.F. en un tubo de ensaye y se envía al laboratorio, en donde se exprimirá la punta del hisopo en un portaobjetos para observar al microscopio.

c.7. Lavado ruminal y lavado gástrico.- Para vaciar el contenido gástrico, basta un tubo de goma gruesa de 3 a 3.5 m. de largo por 28 a 31 mm de diámetro. Son también necesarios un abrebocas o espéculo para sonda de Gratal, un irrigador grande con tubo de goma, un narigón o acial, dos cubos y 50 a 100 l, de agua caliente. La introducción de la sonda se logra casi en todos los caballos sin grandes dificultades, siempre que se utilice la ayuda necesaria (2 ayudantes). Una vez colocado el abrebocas, los ayudantes levantan la cabeza del animal, y se introduce la sonda, cuyo extremo se ha lubricado con glicerina (el aceite o la vaselina perjudican la goma), y se procura que se deslice a lo largo del paladar duro, para alcanzar rápidamente la entrada del esófago. La sonda al ponerse en contacto con la pared esofágica, provoca el reflejo deglutorio, el cual permitirá que la sonda llegue al esófago y luego al

estómago. En ovinos, caprinos y equinos, la sonda será nasofaríngea, mientras que en bovinos, perros

y gatos será bucal. El vaciamiento del contenido gástrico se puede conseguir acelerar u ocluyendo el

extremo libre del tubo durante la inspiración (acción aspiradora de la presión intra torácica negativa), moviendo la sonda, introduciéndola y retirándola e inyectando de 2 a 4 l. de agua, para lo cual se baja la cabeza del animal. En todas las circunstancias, la introducción de la sonda requiere mucha prudencia, a fin de evitar lesiones graves o mortales en los troncos vasculares intra torácicos a en el esófago y la perforación de la pared gástrica. Si es necesario, se puede improvisar una sonda gástrica con una goma de las utilizadas para jardinería. Para descubrir algunos gusanos, Hndq Kyns y Ross, recomiendan, después de dos días de dieta con bebida y 35 hrs. de privación de alimento, lavar el estómago con 15 l. (equinos principalmente) de solución de bicarbonato sódico al 2% que son extraídos al cabo de 5 a 10 minutos y en la última porción, se investigan los vermes y huevos.

Es posible la observación de protozoarios, vermes y huevecillos en el vómito (especialmente perros y

gatos) el cual puede ser provocado con lentina (0,01 gr. por 25 kg de peso corporal en inyección

subcutánea), por ingestión súbita de cloruro de sodio, o por estímulos mecánicos de la laringe.

Todos estos líquidos deberán recolectarse en recipientes limpios y con tapa para evitar la

contaminación.

c.8. Recolección de orina.- Es poco frecuente el análisis de orina con fines parasitológicos, sin embargo, se pueden observar en el sedimento, huevecillos de Stefanurus spp. Dioctophyma renale,, Capillaria plica y raramente Dirofilaria immitis.

Generalmente la recolección de orina con fines químicos y bacterianos requiere de orina cateterizada y

colocarla en recipientes estériles. En parasitología se puede utilizar el catéter u orina procedente

directamente del chorro proveniente de la uretra. No obstante es conveniente tener presente:

*.- Deben usarse recipientes limpios.

*.- Una muestra de la mañana temprana de mascotas domésticas es muy probable que contenga los

constituyentes de importancia diagnóstica.

*.- La orina no cateterizada contendrá restos celulares, leucocitos y el flujo del exudado de la uretra,

prepucio y aparato genital.

*.- - La congelación de la orina destruye las células.

*.- La orina guardada en refrigeración puede examinarse a las 2 a 3 hrs.

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c.9 Recolección de heces fecales. Las muestras deben ser frescas, libres de piedras, tierra o paja; además se debe estar seguro de que el excremento pertenece al animal al que se le realiza el estudio. Por ello es preferible la toma del excremento directamente del ano, mediante estímulo anal o con la introducción de la mano enguantada directamente en el recto (bovinos y equinos). En pequeñas especies se debe recoger de superficies limpias, de acuerdo a las siguientes cantidades: Bovinos y equinos..................................................... 100 g Ovinos, caprinos y cerdos......................................... 30 g Perros, gatos y otros................................................. 10 a 15 g En pequeños rumiantes y cerdo, la colecta se realizará introduciendo uno o dos dedos en el recto del animal o bien dando un masaje en la región perineal para estimular la defecación.

En perros y gatos se recurre a Ia introducción de una varilla de vidrio, cuchara para muestreo de heces o bien

colocar a los animales en una superficie limpia, recogiendo las muestras inmediatamente después de la

defecación.

En aves y conejos, la colecta se realizará introduciendo una varilla de vidrio en la cloaca o bien, en la necropsia,

recogiendo el contenido intestinal en un fresco a en una bolsa de plástico.

En animales de laboratorio (ratas, ratones, hamster, cuyos y conejos), la colecta se hace en grupo, colocando a

los animales en jaulas.

A menos que el examen microscópico vaya a realizarse en el mismo lugar donde se toma la muestra, habrá que

poner una porción de la misma en recipientes adecuados para su traslado. Estos deberán ser pequeños frascos

de vidrio de cerca de un cuarto de litro, o bien cajas de cartón encerado con tapa hermética. Si de momento se

carece de recipientes para envolverse temporalmente, se deberá usar los guantes de inseminación artificial

(desechables), bolsas de polietileno o papel parafinado. El papel absorbente como el de periódicos o papel tisú no

son satisfactorios.

Si el examen ha de realizarse al siguiente día o bien si el laboratorio se encuentra a alguna distancia, es preciso

preservar la muestra, puesto que los huevecillos y los oocistos pueden experimentar cambios evolutivos que

hagan difícil su identificación. Ello se consigue por medio de refrigeración o bien por la adición de formol el 10%,

(véase práctica No. 5). Si se sospecha de parásitos pulmonares o cualquier otro proceso en que se encuentran

larvas, sólo se utilizará la refrigeración dado que los conservadores químicos, destruyen a las larvas. Tanto la

refrigeración como la adición de agentes químicos están proscritos cuando se piensa en la existencia de

protozoarios móviles.

c.10 Recolección de órganos.- La obtención de muestras de órganos internos se realiza mediante la punción de

éstos desde el exterior o bien durante la necropsia. (En la práctica No. 6 se realizará una necropsia con fines de

profundizar en la recolección de órganos y parásitos macroscópicos).

En estos casos, los procedimientos varían según se desee examinar el material en fresco o mediante preparados

histopatológicos, cultivos, enriquecimiento, etc. Para el examen histopatológico, los trozos de órganos (intestino,

pulmón, ganglios linfáticos, músculos, etc.) se colocarán en frascos conteniendo solución formulada al 10% u otro

líquido fijador, mientras que para el estudio parasitológico en fresco, se les colocará en solución fisiológica o en

glicerina al 50% con solución fisiológica (véase apéndice No. 3)

Los trozos de músculos destinados a la investigación de Trichinella spiralis, deberán tomarse del diafragma

intercostales y de la lengua, en la proximidad de sus inserciones tendinosas; los cysticercus se buscarán en la

pared cardiaca, la lengua, maseteros y los sarcocystis, en los músculos faríngeos, diafragma intercostales,

esofagianos, linguales y cardiaco. Las larvas de tenidios en el hígado y peritoneo; los nemátodos en intestino, las

larvas en los nódulos de la pared intestinal y en los pulmones, riñones, peritoneo, etc. En el apéndice No.2 se

enlistan los parásitos macroscópicos más comúnmente localizados para cada especie y por órgano.

La punción de órganos internos no exenta de peligro, puede ser necesaria en casos especiales y excepcionales,

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cuando no sea posible realizar el diagnóstico por los métodos de rutina, con el fin de obtener muestras para la

investigncl6n de endoparásitos.

Punción esplénica y hepática.- Se lleva a cabo para la investigación de Leishmaniosis visceral de las especies

humana, canina, felina, paludismo crónico humano; la babesiosis bov1na, canina, equina; tripanosomiasis equina,

toxoplasmosis, etc. La punción hepática exploradora, está absolutamente contra indicada en la hidatidosis de este

órgano, por el peligro de la diseminación de vesículas hijos en la cavidad peritoneal, así como la intoxicación por

el líquido de estas.

Trepanación de huesos.- Tiene por objeto la obtención de muestras de médula ósea, mediante la punción de

diversos huesos ( esternón, cresta iliaca, apófisis espinosas vertebrales en la especie humana; diáfisis tibial en

caninos; tuberosidad isquiática en equinos, etc.), para la investigación de Leishmania en especies animales

susceptibles a la enfermedad, toxoplasmosis, etc.

-Punción ganglionar.- La punción de ganglios linfáticos superficiales también puede proporcionar material para investigación de leishmania, treponemas, toxoplasma, tripanosoma, etc.

-Punción raquídea.- Tiene por objeto la extracción de líquido cefalorraquídeo donde es pasible investigar leismania, hematozoarios del paludismo en humanos; leishmania canina y felina; babesiosis y tripanosomiasls.

Las muestras obtenidas por medio de raspado de la piel y los folículos sebáceos, escamas, pelos, costras y

líquidos sebáceos, sospechosos de hallarse parasitados, se colocarán en tubos de ensayo limpios y secos, para

remitirlos al laboratorio, debidamente identificados. Para facilitar el desprendimiento del material cutáneo, se

deberá humedecer previamente la zona con gotas de glicerina neutra, aceite mineral o parafina líquida,

efectuando luego el raspado en forma moderada para la obtención de muestras conteniendo ácaros de la piel

(sarna, garrapatas), directamente de la superficie cutánea pudiendo emplearse una navaja o una hoja de bisturí

(véase más adelante).

Para el diagnóstico específico de sarna, las zonas de piel sospechosas en perros, ovinos, son aquellas con cordones, arrugas, caspa, alopecias, etc. Las lesiones de desarrollo reciente (periferia) son las más probables de albergar parásitos que las lesiones antiguas. Si se han aplicado medidas terapéuticas, los ácaros serán escasos y más difíciles de encontrar. Es necesario efectuar un raspado profundo mediante un bisturi sin filo hasta producir hemorragias puntiformes. Con esta actividad es posible alcanzar el estrato capilar. Se humedece el área que va a sen raspada con solución salina fisiológica para que se adhiera el material al bisturí. Benbrook (1929) aconseja el uso de un bisturí sumergido en aceite mineral haciendo más fácil el examen porque el aceite tiende a clarificar la muestra y evita la desecación del espécimen si es que se cree demorar en hacer la observación.

c11.- Recolección de parásitos internos.- Para la recolección de parásitos internos se deberá realizar el

análisis sistémico de un cadáver (necropsia), la cual se detalla en la práctica no. 6, o bien su búsqueda en los

excrementos recién emitidos. Para esto último, es necesario tomar en cuenta que muchos parásitos visibles a

simple vista pueden sufrir destrucción en las primeras horas de emitidas las heces, debido a la fermentación y

desecación de la materia fecal. Con unas pinzas de disección o una asa de platino se toman los especimenes

para introducirlos en un recipiente de vidrio de boca ancha con formol al 10%.

Figura No. 3.2 Recipientes para colecta de parásitos

20

Para colectar las formas adultas, larvarias y quísticas de protozoarios y helmintos en la necropsia, se deberán

revisar todos los órganos por aparatos y sistemas, efectuando cortes longitudinales de los mismos. En el

apéndice número 2, se enlistan los parásitos posibles a encontrar en la necropsia por órgano y especie.

Aparato respiratorio.- Para la búsqueda de parásitos pulmonares, se procederá a incidir longitudinalmente la

tráquea, siguiendo el curso de las ramificaciones bronquiales así mismo, incidir el parénquima pulmonar y

observar cuidadosamente los órganos y si existen parásitos se deberán separar con pinzas o agujas de

disección, los cuales se colocaran en cajas de Petri con S.S.F. tibia para quitar el exceso de moco, después se

pasa a otra caja de Petri con alcohol de 70 grados tibio para su fijación y estiramiento (en caso de nemátodos), y

posteriormente se colocarán en un frasco con formal al 10% para conservarlos, o si se quiere identificar, se

pasarán a lactofenol o bien se procederá a montarlos como se especificará en la práctica No. 7.

Aparato circulatorio.- Para recolección de parásitos del corazón, se procederá a revisar cuidadosamente el

órgano en busca de helmintos adultos o bien de protozoarios. Los parásitos macroscópicos se fijarán en alcohol

de 70° tibio o en formol al 10%.

Cavidad abdominal.- Una vez separadas las partes, se examinará en cada órgano por separado, con ayuda de

tijeras, incidiendo longitudinalmente los órganos, vaciando el contenido en charolas o cubetas de plástico,

haciendo una solución con agua corriente. Observar cuidadosamente la mucosa para ver si hay parásitos adultos

adheridos a la mucosa. Los parásitos adultos a porciones de éstos, se pasarán igualmente en una caja de Petri

con S.S.F. y posteriormente se fijarán en alcohol de 70° o en formol al 10% donde se conservarán para ser

identificados.

Hígado.- El hígado se separará de las demás vísceras y posteriormente se abrirán los conductos biliares en

cortes longitudinales en busca de gusanos adultos. Loa trematodos se deberán colocar entre 2 placas de vidrio,

ejerciendo una leve presión para que queden planos, evitándose que se contraigan a se doblen, después, serán

colocados en frascos con formal al 10%.

Figura No. 3.3 Parásito colocado entre dos placas de vidrio para su fijación

Aparato urinario.- Separar el aparato urinario e incidir longitudinalmente los riñones, pelvis renal, uréteres, vejiga y

grasa perirrenal en busca de protozoarios y de helmintos; en caso de que se encuentran depositarlos en cajas de

Petri con S.S.F. y después fijarlos y cuando se sospecha de protozoarios se hará una impronta de los uréteres.

Sistema nervioso.- Utilizando la técnica adecuada, se sacará el cerebro, se revisará cuidadosamente para buscar

fases larvarias de cestodos por ejemplo Cysticercus cellulosae en cerdos, en tal caso, se realizará la disección de

los cisticercos, depositándose en cajas de petri con S.S.F. Para llevar a cabo la identificación morfológica se

pondrán en 2 portaobjetos, ejerciendo una presión hasta que evagine el escólex, una vez hecho esto, se coloca

en el microscopio para ver sus estructuras.

Tejido muscular.- En la musculatura de los animales domésticos se pueden encontrar protozoarios v larvas de

helmintos. Cuando se trate de protozoarios por ejemplo de sarcosporidios, los tejidos a muestrear serán: Los

músculos del diafragma, corazón, etc. donde se realizaran cortes de aproximadamente 1 cm3, depositándolos en

frascos con formal al 10% o para su fijación, serán incluidos en pararafina para realizar cortes histológicos teñirlos

con hematoxilina-eosina e identificarlos al microscopio Cuando se trate de larvas de cestodos como los

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cisticercos, se buscarán en los músculos de la lengua, maseteros, intercostales, músculo del miocardio, etc. de

los cerdos; una vez detectados se cortará la porción afectada y se trasladará al laboratorio en bolsas de

polietileno, conservadas en refrigeración. Cuando, se sospecha de Trchinella spiralis la cual se localiza en los

músculos del diafragma, maseteros, lengua, etc. de cerdos y ratas, se harán cortes de estos músculos siguiendo

la longitud de las fibras musculares, depositándose en bolsas de plástico conservadas en refrigeración. (El

tamaño de la muestra de penderá de la especie animal por ejemplo: en cerdos se colectarán aproximadamente

80 gr. de carne).

Tejido conjuntivo y fibroso.- Para llevar a cabo la colecta del ligamento cervical de los bovinos y equinos, se hace la necropsia realizando una incisión para localizar el ligamento, depositándose en bolsas de plástico y conservadas en refrigeración para ser enviadas al laboratorio, en donde se buscarán nódulos, los cuales se separarán de los ligamentos, a continuación se pondrán en vasos de precipitados agregando jugo gástrico artificial (pepsina, ácido clorhídrico y agua destilada), manteniéndose a una temperatura de 37 centígrados durante 8 a 21. hrs. Una vez que se ha digerido el tejido conjuntivo, dejando en libertad a los parásitos, los cuales se lavarán con agua destilada y se fijarán en alcohol de 70° tibio o en formol para su conservación.

Los artrópodos de la sarna, garrapatas, piojos, pulgas, etc., pueden obtenerse directamente de la superficie corporal del animal parasitado. Las formas adultas de mosquitos, moscas, tábanos, simúlidos, flebotomus, chinches, etc., se capturan mediante cebos, de día o de noche, según los hábitos de cada especie. Cuando se desea capturarlos muertos, debe recurrirse a los anestésicos, insecticidas, etc., mientras que, cuando sea necesario mantenerlos vivos, se emplean redes trampas y carpas en habitaciones, establos, gallineros, etc.

Redes.- Formadas por una bolsa de 20 a 30 cm. de profundidad, adaptada a un aro de 14 a 15 cm. con un

mango de 40 cm de largo confeccionada en tul de color preferentemente verde. (figura No. 3.4).

Figura No. 3.4 Tipos de redes para entomología (A. Con anillo de lámina; B. Con aro de alambre; C. Forma de cerrarla con el insecto

capturado; D. Red de arrastre; E. Trasmallo. F. Papalote o pantalla; G. Paraguas para recolecta de caída.

Trampas.- Paralepípedo con armazón de alambre o madera, forrado de tela blanca traslúcida, abierta en la cara

inferior, suspendida en estacas o en la rama de un árbol con la parte inferior separada 30 a 40 cm. del suelo. Se

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utiliza también la denominada trampa cónica para moscas, con un cebo dentro y colocada en basurales,

estercoleros, o donde abundan estos insectos. (figura No. 3.4).

Carpa.- Confeccionada de tela blanca, sostenida por partes de madera separada del suelo igual que la trampa,

colocando en su interior un foco encendido. El operador debe colocarse dentro de ella. Como cebo puede

utilizarse también un equino o bovino manso, iluminados por un farol suspendido en la parte inferior, donde el

operador puede capturar los insectos voladores con una red a medida que los mismos se posen sobre el animal,

o bien mediante un tubo aspirador (ver figura No. 3.4). Debe tenerse presente que para la captura de moscas y

tábanos, estos desarrollan su mayor actividad durante las horas de luz solar. Los insectos capturados mediante

algunos de estos procedimientos, se colocarán en tubos de vidrio de 3 a 4 cm de diámetro y 15 a 20 cm de largo

a bien en frascos de boca ancha, colocando o no veneno en su interior, según se desee mantenerlos vivos a no.

Captura de larvas.- La captura de larvas de mosquitos, deberá efectuarse en aguas estancadas, charcos,

estanques, zanjas, y utilizando un cucharón largo. Para la captura de larvas de tábanos, debe recordarse que

éstas, a poco de nacer, se sumergen en el fango y las larvas de moscas deben capturarse en heridas, cavidades

naturales de animales vivos o muertos, pero las pupas en el suelo; los simúlidos en aguas limpias.

Tubos de captura.- Se utilizan tubos tóxicos y no tóxicos. Los primeros (figura No. 3.5) se emplean en los

artrópodos que no han de destinarse a cría, estudios biológicos, aislamiento de virus, bacterias a parásitos, como

probables portadores, pudiendo en este caso, colocar varios de ellos un mismo frasco o caja (figura No. 3.2);

mientras que, cuando han de destinarse al estudio de su biología, cría, etc., se deben remitir sin veneno a razón

de uno tubo. En todos estos casos, deberán obtenerse el tubo y roturarse debidamente.

Figura No. 3.5 Tipos de tubos para colecta de artrópodos (A. Pipeta aspiradora; B. Tubo de aspiración intermedio; C. Tubo vertical de

absorción.

Torundas y algodones impregnados de veneno.- Las pulgas y los piojos generalmente se colectan impregnando

una torunda o algodón con alcohol éter, la cual se pasa sobre el animal repetidas veces, para posteriormente ser

puestos en frascos con alcohol de 70° para su observación en el laboratorio.

Las sustancias tóxicas comúnmente utilizadas, son algunos insecticidas, en polvo a en grano, algodón embebido

en cloroformo, éter o en tetracloruro de carbono. Para la preparación de tubos tóxicos, se procede de la siguiente

manera:

Utilizar frascos limpios y secos, de 3 a 4 cm. de diámetro por 12 a 15 cm de largo. Colocar en el fondo del frasco, el veneno, en forma de capa de 1.5 cm de espesor apisonada cuando se tratare de polvo, o bien un algodón o pedacitos de corcho embebidos en cloroformo o en tetracloruro de carbono y sobre estos, un disco de cartón perforado o un papel filtro de diámetro, algo mayor que el frasco, colocándolos en forma forzada, para

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posteriormente cerrar el frasco con un tapón de corcho o algodón. (ver figura No. 3.2 C)

Finalmente, las garrapatas deberán colectarse procurando desprenderlas sin que las piezas bucales se queden

en la piel, para este propósito, se coloca un dedo debajo de la garrapata y haciendo presión en la parte superior,

se desprenden fácilmente haciendo un semicírculo para liberar los ganchos de la piel, para posteriormente

colocarlas en un frasco con un papel filtro impregnado con solución salina para conservar la humedad. También

se puede recoger garrapatas de las pieles de los animales sacrificados.

Los argásidos se pueden buscar en las perchas o en las paredes de los gallineros y palomares durante el día.

c.12 Recolección de huéspedes intermediarios invertebrados. La recolección de huéspedes intermediarios,

insectos y arácnidos se hará en la misma forma detallada en los párrafos anteriores.

Para la colección de huéspedes intermediarios acuáticos (Cyclops spp.), se buscarán muestras de agua

estancada preferentemente de lugares con vegetación abundante.

La colección de caracoles y babosas, principalmente de los géneros Lymnea, Physa, etc., atribuidos como

probables huéspedes intermediarios de Fasciola hepatica y otros parásitos, se procederá a recolectarlos de

charcos, canales de riego y lugares pantanosos del terreno. Los especimenes recogidos serán introducidos en

frascos de boca ancha, de 10 cm de alto y 5 cm de diámetro, en los que previamente se habrá introducido barro y

hojas de plantas acuáticas, procurando así acondicionar un medio similar al de su hábitat natural. Las bocas de

los frascos serán aseguradas con gasa u otros materiales que permitan la adecuada aireación del medio.

c.13 Conservación de muestras para el envío.- Una vez colectadas las muestras, deberán procederse a su

análisis en caso de disponer del equipo necesario con que cuenta un laboratorio. De no ser así, es necesario

preservar la muestra para que no sufra descomposición ni altere los resultados, así como utilizar la mejor manera

de envío al laboratorio. Las muestras colectadas pueden inutilizarse por numerosas causas. Estas dependen del

tipo de espécimen y de las condiciones bajo las cuales se colectó y empacó.

La hemólisis hace que numerosas muestras de sangre para exámenes serológicos o hemocitológicos se

inutilicen. Las causas más comunes para la presentación, de la hemólisis han sido ya mencionadas.

La descomposición bacteriana o inclusive el desarrollo bacteriano discreto inutiliza muchas muestras. Algunas

causas son:

- Contaminación con material fecal u otro tipo de contaminante.

- Temperaturas demasiado elevadas durante el transporte.

- Transporte de larga duración.

- Invasión bacteriana por aerosoles por recipientes mal conservados o mal empacados.

La autolisis es debida a la digestión de tejidos por sus propias enzimas. Se encuentran ocasionalmente en tejidos

que han sido empacados en bórax u otro antiséptico seco, ligero y de leve acción bacteriostática. La autolisjs es

también ocasionada por temperaturas muy elevadas durante el transporte. Su magnitud es directamente

proporcional a la temperatura y a la duración del traslado.

La desecación inutiliza algunas muestras, tales como las de parásitos, exudado, etc., y es causada por:

- Una muestra demasiado escasa.

- Un cerrado no hermético que permita la evaporación.

La fermentación es igualmente perjudicial y da por resultado un examen inadecuado, sus causas principales son:

- Empleo de un cuchillo sin filo o tijeras mal afiladas para cortes.

- Forzar una muestra en una botella de poca capacidad.

- La utilización de deshidratantes y conservadores en cantidad insuficiente o inadecuados, durante el transporte.

- Congelación del espécimen mediante hielo seco o en una unidad de congelación profunda.

Para evitar lo anterior, es necesario seguir las siguientes indicaciones:

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Existen dos grandes métodos de conservación:

- Conservadores físicos (refrigeración).

-Conservadores químicos.

Cada una tiene sus propias ventajas y limitaciones. Sin embargo, mediante una selección cuidadosa de la más

apropiada para el caso, no debe estropear ninguna muestra.

- Refrigeración: Es un conservador sumamente efectivo y es particularmente útil para muestras de tejido tales

como músculo hígado, cerebro, cuerpos enteros (aves) y excrementos para exámenes bacteriológicos, estudios

anatomopatológicos y parasitológicos. Para mayor seguridad debe utilizarse el hielo natural. Se coloca el

espécimen en un recipiente a prueba de fugas de agua. Este a su vez se encierra en otro recipiente también a

prueba de fuga de agua, y de dimensiones mucho mayores: se llena el espacio que queda entre ambos con

fragmentos de hielo. Son sumamente satisfactorios los envases o latas tales como los destinados a la manteca.

La caja de madera puede ser sustituida por una de cartón si se incluye suficiente cantidad de algún material

absorbente para captar agua proveniente de la fusión del hielo. El aserrín es excelente.

Puede prepararse pequeñas cantidades de hielo natural en tal forma que no gotee el agua conforme se va

fundiendo el hielo. Esto se logra mediante una cámara de hule o caucho con agua o bien llenando con agua una

lata o bote. El agua se congela entonces en la unidad de congelación de un refrigerador. La pieza debe ser

asegurada al recipiente que contiene el hielo por una liga de hule y empacada en una bolsa aislante que se

introduce finalmente en una caja de cartón cartulina, o madera y se procede a enviarla. Este método es

particularmente adecuado para la preservación de muestras de sangre total, que cuando son congeladas por

hielo seco se deterioran por completo. El hielo seco si es empacado adecuadamente puede evitar por 2 o 3 días

el que las muestras se descompongan.

El mejor recipiente en éste caso es la caja de cartón especialmente aislada que proporcionan los comerciantes de

hielo. Utilice una caja varias veces mayor que la muestra que va a enviarse. En primer lugar deben colocarse

varios periódicos arrugados en el fondo de la misma. A continuación se introduce una cantidad liberal de hielo

seco y se cubre con más papel arrugado, arriba de éste se coloca el espécimen y se cierra la caja con la tapa.

Nunca debe ponerse en contacto directo con el hielo seco la muestra enviada ya que esto produce una

congelación innecesaria. Asimismo no se utilizará para el hielo seco un recipiente (metal o vidrio) a prueba de

aire, ya que la presión generada al volatizarse el sólido puede provocar una pequeña explosión.

Cuando se carezca de los medios necesarios para la refrigeración, los tejidos podrán recolectarse con glicerina

neutra y alcohol en partes iguales, mezcla que evita la proliferación bacteriana evitando así la descomposición.

- Conservadores químicos. Se clasifican según sus efectos. Cada una de dichas clases tiene un lugar específico

como preservativo. Las soluciones deshidratantes y fijadoras se utilizan para la conservación de especimenes

destinados a estudios histopatológicos. La solución de formol al 10% que equivale aproximadamente a un 4% de

formaldehído gas, es la más comúnmente usada y es muy satisfactoria. El alcohol absoluto e incluso alcohol al

90% son así mismo útiles, si bien son inferiores a la formal, ir en la mayor parte de los casos. El alcohol ordinario para fricciones cuyo porcentaje oscila del 50 al 70% no es conveniente. Es importante emplear una cantidad adecuada de la solución conservadora, cualquiera que ésta sea de 8 a 10 veces el volumen de la muestra. Las soluciones bactericidas son utilizables cuando se van a realizar exámenes parasitológicos de rutina o exámenes bacteriológicos directos al microscopio. La formalina al 10% se emplea para la conservación de la materia fecal (siempre y cuando no se vaya a realizar el cultivo de larvas). El fenol al 0.5% y la solución de mertiolato al 1:10 000 son adecuadas para el suero sanguíneo destinadas a pruebas serológicas. Una capa de tolueno sobre una muestra de orina constituye un preservativo conveniente. La glicerina neutra al 50% es superior para el material sospechoso de albergar virus y es también utilizable para la conservación del material destinado a la inoculación animal con fines de diagnóstico. El ácido bórico o el bórax en su forma pulverizada es un producto menos satisfactorio, si bien puede ser empleado cuando no se cuenta con sustancias más adecuadas.

Figura 3.6 Procedimiento para el empacado de muestras para el laboratorio

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Estos se utilizan también para conservar pequeños órganos o porciones de tejido. Debe cubrirse completamente

el espécimen con el polvo y colocarse en un recipiente adecuado. El ácido bórico no evita la descomposición si el

material ha estado en contacto con el contenido intestinal o ha sido contaminado por materia fecal para la

conservación de sangre se pueden utilizar los anticoagulantes y la refrigeración. Es necesario la utilización de

sangre con anticoagulantes para la observación de hemoprotozoarios. Dentro los anticoagulantes tenemos:

Cuadro No. 3.1 Anticoagulantes

ANTICOAGULANTE MODO DE ACCION CANTIDAD NECESARIA (para 10 ml de

sangre)

EDTA. (sales de K o Na de

ácido tetracético de

etilendiamina, vernata,

versene, sequestrene)

Forma sales insolubles de Ca 10-20 mg (1 ml de solución al 1% secada a

temperatura ambiente o en incubadora.

Heparina Antitrombina y antitromboplastina 1-2 mg (0.2 ml de solución al 1% se puede humedecer

la jeringa y la aguja con la solución estéril concentrada

(mg por ml).

Citrato de sodio Se combina con Ca. para algunos para formar una

sal insoluble de citrato de calcio.

10-20 mg para algunos estudios de coagulación, una

parte de solución al 3.8% y 9 partes de sangre.

Oxalato de potasio Se une con el Ca para formar oxalato de calcio

insoluble

20 mg o 2 gotas de solución al 20% secada en

incubadora o en el horno a 55° (el sobrecalentamiento

convierte los oxalatos en carbonatos)

Oxalato de sodio Se une con el Ca para formar oxalatos de calcio

insoluble

20 mg para el tiempo de prottrombina se usan 0.5 ml

de oxalato de sodio de solución al 0.1% en 4.5 ml de

sangre

Oxalato de amonio y potasio

(oxalato de Heller y Paul)

Se une con el Ca para formar oxalatos de calcio

insoluble

1 ml o 20 mg secados a temperatura no mayor de 60°

C (1.2 g de oxalato de amonio u 8 g de oxalato de

potasio, y 100 ml de agua destilada).

Oxalato de litio Se une con el Ca para formar oxalatos de calcio

insoluble

20 mg ( 1ml de solución al 1.5% evaporado solo para

permitir la desecación en incubadora a 37° C)

Citrato de litio Inactiva los iones de Ca 30 mg

Fluoruro de sodio y timol (10:1) Forma un componente de Ca débilmente

disociado

100 mg de fluoruro de sodio y 10 mg de timol

Solución B de dextrosa de

citrato ácido

- Para transfusiones 25 ml por 100 ml de sangre. (14.7

g de dextrosa, 13.2 g de citrato trisódico, ácido cítrico,

anhídrico, 4.4 g; agua destilada c.b.p. 1000 ml; pasar

por autoclave)

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Las alteraciones más comunes causadas por los anticoagulantes son:

1. Mas de 2 mg de EDTEA/ml de sangre causará el arrugamiento (cremación) de los eritrocitos, lo que disminuirá el volumen del paquete celular (VPV) y el volumen corpuscular medio, pero incrementará la concentración de hemoglobina corpuscular media.

2. Un mg. De EDTA/ml de sangre aumentará el valor del nitrógeno no proteico en 7 mg/dl. 3. El EDTA no deberá usarse cuando se extrae sangre para la determinación de la fosfatasa

alcalina porque interfiere con el desarrollo del calor. 4. El EDTA disminuye el poder de combinación del bióxido de carbono de la sangre. 5. Cuando el EDTA se encuentra presente, se observará una gran interferencia en la reacción de

Jeffe para la creatinina. 6. La heparina es un anticoagulante débil para los estudios de las células sanguíneas porque

puede producir el apiñamiento de los leucocitos, lo que interfiere con la capacidad de los leucocitos para teñirse en los frotis.

7. Algunas enzimas como la colinesterasa deshidrogenasa láctica y la deshidrogenasa isocítrica puede tener una interferencia de ligera a marcada cuando se usa heparina.

8. El oxalato potásico produce dilución del plasma debido al arrugamiento de los eritrocitos. 9. El oxalato inhibe a la deshidrogenasa láctica, a las fosfatasas alcalina y ácida y la amilasa. 10. Los valores del ácido úrico se reducen con los oxalatos de sodio y de potasio. 11. El fluoruro se usa como conservador de la glucosa en plasma, aunque se ha demostrado que

su uso produce cierto grado de hemólisis y que hay una disminución concomitante del 10% en la concentración de glucosa.

12. El fluoruro inhiben algunas enzimas y estimula la actividad de la amilasa. 13. El fluoruro no puede usarse como conservador cuando se utiliza uricasa para la determinación

del ácido úrico.

No obstante al anticoagulante, es preferible realizar un frotis sanguíneo con una gota, para que el resto de la sangre sea analizado con otros fines (suero, bioquímica, conteo celular, etc.) El frotis sanguíneo tendrá la ventaja de que, una vez fijado y teñido se puede conservar por mucho tiempo, además de observar parásitos sanguíneos en forma directa e inmediata. Para la metodología en la elaboración del frotis sanguíneo se deberá realizar la práctica No. 9 c.3.14 Envío de las muestras al laboratorio de parasitología. Una vez conservadas las muestras estas deberán ser empacadas adecuadamente para que no se estropeen y lleguen al laboratorio en la mejor forma para ser utilizadas. Los frascos herméticos y bolsas de plástico deberán sellarse con tela adhesiva y depositarlos en recipientes de mayor tamaño (caja de madera o bote de metal) que contenga viruta o aserrín, con el objeto de amortiguar golpes y absorber la humedad. Si se incluye hielo, este deberá disponerse en la forma descrita anteriormente y cerrados convenientemente. Antes de cerrar el paquete, se deberán anexar los datos de la historia clínica y los estudios que se solicitan se realicen. Estos datos deben incluir: — Nombre, dirección y teléfonos del remitente y/o propietario. — Descripción del animal (especie, número, raza, edad, sexo, etc.) — Fecha y hora de la muerte. — Fecha y hora de la torna de la. muestra. — Conservador utilizado. — Órgano tomado y sus características. — Una breve reseña del caso (historia clínica) en la cual se indica la duraci6n de la enfermedad o

brote, número de animales afectados incidencia de mortalidad, clase de alimento, manejo, antecedentes y procedencia de los animales, signos, tratamientos aplicados, calendario de vacunación, resultados de la necropsia, diagnostico del que se sospecha y análisis deseados.

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Es importante mencionar que para derriengue o rabia se deberá reportar si es que hubo personas mordidas o no. También es conveniente identificar cada una de las muestras con el número, nombre o señas particulares de cada animal para saber el resultado individual de cada caso. Es muy importante que en la envoltura de los paquetes sean puestos con claridad, además de los datos del destinatario y remitente, así como la siguiente leyenda: “MATERIAL BIOLOGICO DE FACIL DESCOMPOSICION PARA ANALISIS, MANEJESE CON CUIDADO. FRÁGIL.” A fin de que el material de estudio llegue lo más pronto posible al laboratorio deberá considerarse la conveniencia de la forma de envío (aérea o por carretera, ya sea por flete en líneas comerciales o vehículos particulares). Además al remitir la muestra es conveniente comunicarse de inmediato al laboratorio, indicando el medio de transporte, línea comercial empleada y hora probable de arribo a su destino, así corno el número de guía de transporte. Es posible que el laboratorio proporcione los frascos, tubos estériles, hisopos, sustancias y anticoagulantes para que en esa forma puedan obtenerse y remitir las muestras en la mejor condición. Ver figura 3.6 D. EJERCICIOS d.1 El alumno realizará la toma de muestras de excrementos en los establos de la Escuela en las siguientes especies: bovino, caprino, ovino y cerdo. Anotará sus experiencias. d.3 El alumno visitará el Rastro Municipal, con el objeto de colectar órganos y parásitos visibles a simple vista. Dibujará los especimenes colectados y anotará sus experiencias.