Introducción

En la naturaleza, la mayoría de los microorganis-

mos no se encuentran aislados, sino integrados

en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estu-

dio de estos microorganismos y de sus propieda-

des, es necesario separar unos de otros y trabajar

con especies aisladas, obteniendo cultivos axéni-

cos o puros.

Un cultivo axénico o puro es aquel que contiene

un sólo tipo de microorganismo y que procede

generalmente de una sola célula; el crecimiento

de ésta origina, en medio sólido, una masa de

células fácilmente visible que recibe el nombre de

colonia.

Para obtener cultivos axénicos o puros a partir de

una población microbiana mixta, se utilizan las

denominadas técnicas de aislamiento, que fueron

desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio,

Lister utilizó diluciones seriadas en medio líquido

con esta finalidad, pero la presencia de contami-

nación, es decir, de microorganismos no desea-

dos, dificultó el aislamiento. La escuela de Robert

Koch introdujo los medios sólidos, complementa-

dos con agar, y las placas de Petri en

Bacteriología, permitiendo así la separación física

de las colonias sobre la superficie del medio de

cultivo o en el interior del mismo.

El aspecto de las colonias sirve para diferenciar

distintas especies microbianas.

Objetivos

- Familiarizarse con el manejo de microorganis-

mos y con las técnicas de aislamiento en placa de Petri.

- Obtener colonias separadas, utilizando uno o

más métodos.

- Estudiar la morfología de cada colonia.

Material

Asa de siembra, cayado, pipeta graduada, placas

de Petri con medio de cultivo sólido y cultivo de

microorganismos.

Técnicas

Existen distintas técnicas que pueden utilizarse:

a) Extensión en superficie con cayado

Depositar sobre la superficie de una placa con

agar nutritivo una gota ó 0,1 ml de una determina-

da dilución del cultivo de microorganismos proble-

ma y extenderlo con ayuda del cayado, previa-

mente esterilizado, en todas las direcciones hasta

Cayado

Serie de

diluciones

conocidas de

la muestra

Figura 5.1. Siembra por extensión en

superficie para recuento.

Carga (1ª Primera diseminación

(2ª estría) Segunda diseminación

(3ª estría) Última diseminación

(4ª estría)

Figura 5.2. Técnica de aislamiento por estría en superficie.

estría)

PRÁCTICA 5

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

23

que esté completamente seco. Incubar la placa,

en posición invertida, a la temperatura deseada

(durante 24, 48 ó 72 horas) según el tipo de micro-

organismo. La posición invertida evitará que el

agua de condensación se deposite sobre la super-

ficie del medio, dificultando la obtención de colo-

nias aisladas.

Es una técnica usada para el aislamiento de colo-

nias, que permite igualmente el recuento de bac-

terias viables en la muestra, si conocemos exac-

tamente el volumen de muestra sembrado.

b) Estría múltiple en superficieCon un asa de siembra, previamente esterilizada,

se toma una muestra del cultivo de microorganis-

mos y se extiende sobre un área pequeña de la

superficie de la placa con agar nutritivo, en forma

de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para

no dañar el agar.

Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la

siembra realizada previamente, se extiende de

nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas

estrías. Este proceso se repite sucesivamente, fla-

meando y enfriando el asa al comienzo de las

sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa a

incubar, a la temperatura adecuada, siempre en

posición invertida.

Mediante esta técnica se obtienen colonias aisla-

das a partir de una muestra que contenga un ele-

vado número de bacterias.

c) Dilución en masaEn una placa de Petri vacía se deposita un

pequeño volumen conocido de muestra y a conti-

nuación se añade el medio de cultivo (agar nutriti-

vo) fundido y atemperado aproximadamente a

45ºC. Se mezclan ambos por rotación suave de la

placa. De esta forma los microorganismos se dis-

tribuirán de forma homogénea en el medio de cul-

tivo, permitiendo el desarrollo de colonias separa-

das por todo el agar.

Otra variación de esta técnica consiste en inocular

el medio de cultivo, fundido y atemperado, conte-

nido en un tubo, con un determinado volumen de

la muestra. La homogeneización de la muestra y

el medio de cultivo se realiza por rotación del tubo

entre las manos, antes de verterlo sobre la placa.

En ambos casos, trás homogeneización, se dejan

enfriar las placas hasta que se solidifique el medio

y posteriormente se incuban a la temperatura ade-

cuada (siempre en posición invertida).

Aunque con esta técnica se obtienen colonias ais-

ladas, generalmente sólo se utiliza para determi-

nar el número de microorganismos viables en una

muestra, cuando éstos son anaerobios facultati-

vos o microaerófilos.

Resultados

a) Extensión en superficie: Tras el período de

incubación se examinarán las placas. Las colonias

aparecen sobre la superficie, distribuidas unifor-

memente si la siembra se ha realizado de forma

correcta. Podrán diferenciarse las colonias de

acuerdo a su tamaño, forma, color, textura, etc.

Esta técnica de siembra, además de permitir que

se distingan las colonias por su morfología, permi-

te el recuento de microorganismos viables. La

expresión de este recuento se hace en "unidades

formadoras de colonias" (UFC) ya que cada una

procede de un sólo microorganismo (o de un

grupo de microorganismos, pues en algunos

casos éstos tienden a formar agregados). A partir

de las colonias aisladas, los microorganismos

pueden transferirse a otros medios de cultivo para

su estudio.

b) Por estría múltiple en superficie: Tras la incuba-

ción, se observarán las colonias aisladas en algu-

na región de la placa inoculada. Con esta técnica

se logra la separación de los microorganismos

que se encuentran

en un cultivo

mixto, o bien que

proceden de

m u e s t r a s

h o m o g é n e a s ,

pero en las que

existe un elevado

número.

En las zonas

donde existen

colonias aisladas

se puede estudiar

la morfología colo-

nial.

c) Dilución en masa: Aparecen las colonias distri-

buidas por toda la masa del agar. Aquellas que

están en la superficie tendrán distintas caracterís-

Inóculo calibrado

Mediofundidoatempera

HomogeneizHomogeneizar

Medio fundido

atemperado

Inóculo

calibrado

Figura 5.3. Siembra por dilución en masa

o inclusión en agar.

Figura 5.4. Aislamiento

por estría en superficie.

24

ticas, dependiendo del tipo microbiano, mientras

que las colonias que se desarrollan en el interior,

bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular,

aunque los microorganismos que formen las dis-

tintas colonias sean de distinto tipo. Por tanto, las

colonias que aparecen en la profundidad del agar

son siempre biconvexas y no se diferencian unas

de otras por su morfología.

Figura 5.5.

Aislamiento por dilución en masa.

Puntifor

me

Forma

Circular

Rizoide

Irregular

Filamentos

a

Entero

Borde

Ondulad

o

Lobulad

o

Filamentoso

Elevación Superficie

Plana

Elevad

Convex

Crateriform

Acumina

d

Lisa o

Mate o

Seca o

Invasiva o

Figura 5.6.

Aspectos más comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio

sólido.

Puntiforme

Circular

Rizoide

Irregular

Filamentosa

Entero

Ondulado

Lobulado

Filamentoso

Plana

Elevada

Convexa

Crateriforme

Acuminada

Lisa o rugosa

Mate o brillante

Seca o cremosa

Invasiva o superficial

25

Objetivos

- Aprender a inocular distintos medios de cultivo

contenidos en tubo: Caldo, agar inclinado y medio

semisólido sembrado en profundidad.

- Observar el crecimiento bacteriano en los distin-

tos medios de cultivo.

- Comprobar la movilidad de determinados micro-

organismos.

Material

Asa de siembra, hilo de siembra, pipetas Pasteur

o pipetas graduadas, suspensión de microorganis-

mos y tubos con medio de cultivo líquido, sólido

inclinado y semisólido.

Técnica

a) En medio líquido con asa: Transferir aséptica-

mente, con el asa de siembra, una pequeña mues-

tra de los microorganismos, desde el tubo que

contiene el material problema al tubo con medio

de cultivo estéril. Sumergir el asa en el líquido y

agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar

el tubo recién sembrado en estufa, durante 24-48

horas a la temperatura óptima de crecimiento.

b) En medio líquido con pipeta: Introducir asép-

ticamente la pipeta Pasteur o la pipeta graduada

en el medio líquido que contiene los microorganis-

mos y, aspirando de forma adecuada, sacar una

cantidad establecida de material que se transfiere

al tubo con medio de cultivo estéril. Incubar en

estufa durante 24-48 horas a la temperatura más

adecuada.

c) En medio sólido (agar inclinado): Con el asa

de siembra estéril tomar los microorganismos de

la muestra e inocular el tubo realizando un movi-

miento de zig-zag en la superficie. El proceso se

inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba

por el área inclinada.

Incubar en estufa durante 28-48 horas a la tempe-

ratura más adecuada.

d) En medio semisólido: La siembra en este tipo

de medio, que contiene una proporción menor de

agar que los medios sólidos y que se envasa en

tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra este-

rilizado, con el cual se toma la muestra. El medio

queda inoculado al introducir el hilo en profundi-

dad hasta el fondo del tubo, retirándolo posterior-

mente por la misma trayectoria utilizada al realizar

Muestra Inoculaci IncubacióMuestra Inoculación Incubación

FlameadoFlameado

Figura 6.1.

Inoculación de un caldo de cultivo (ver también figura III, pág. 4).

Muestra Medio (agar

Asa desiembra

Siembra en zig-zag en la

Siembra en

zig-zag

Muestra Medio (agar inclinado)

Figura 6.2.

Siembra en un tubo de agar inclinado.

Muestra Medio (agar

Filamento

Punciónlimpia

Filamento

Punción

limpia

Muestra Medio (agar semisólido)

Figura 6.3.

Inoculación de un medio semisólido por

picadura con hilo de siembra.

PRÁCTICA 6

SIEMBRAS

27

la picadura. Una siembra con asa o con un cierto

movimiento de vaivén podría originar un patrón de

crecimiento que se interpretaría erróneamente

como movilidad bacteriana.

Incubar durante 24-48 horas a la temperatura ópti-

ma de crecimiento.

Resultados

a y b) En los cultivos líquidos

no tiene lugar la formación

de colonias, por lo tanto se

examinará la existencia de

enturbiamiento más o menos

intenso, la formación de una

película o velo sobre la

superficie, la aparición de

sedimento en el fondo del

tubo, etc. La utilización de

medios de cultivo líquidos

permite la obtención de una

población microbiana gran-

de, con un elevado número

de microorganismos, para

ser utilizados posteriormen-

te.

c) En medio sólido (agar

inclinado) se observará el

aspecto general del medio y

la aparición de crecimiento

sobre su superficie. Este tipo de siembra permite

el cultivo de microorganismos aerobios o anaero-

bios facultativos. Además, se utiliza para almace-

nar cultivos durante cortos períodos de tiempo, a

temperaturas de 4ºC.

d) En medio semisólido se podrá comprobar si el

microorganismo es o no móvil, ya que en el primer

caso se observará que el crecimiento difunde alre-

dedor de la zona donde se hizo la picadura,

detectándose turbidez. Por eso es tan importante

que, cuando se inocula el medio de cultivo, no se

distorsione el agar y se vuelva a sacar el hilo por

el mismo sitio de inoculación. Los microorganis-

mos inmóviles crecerán únicamente a lo largo de

la picadura.

Este tipo de siembra en picadura sirve, también,

como otro de método de conservación de microor-

ganismos anaerobios facultativos.

Figura 6.4.

Aspecto de cul-

tivos en agar

inclinado (A) y

semisólido (B)

tras la

incubación.

A B

Figura 6.5.

Prueba de movilidad en agar semisólido.1. Microorganismo móvil.

2. Microorganismo inmóvil.

3. Tubo control sin inocular.

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