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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN TESIS
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
PRESENTA:
ITZEL URIBE GONZALEZ
Asesor: Dr. Rogelio Jiménez Juárez
Co-asesora: Dra. Blanca Estela García Pérez
MEXICO D.F. 2013
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
Agradecimientos:
Al Dr. Rogelio Jiménez Juárez por su conocimiento y por darme la oportunidad de
pertenecer a este trabajo de investigación, por tenerme paciencia y creer en mí en
cada tropiezo, que fueron aprendizajes que marcaron mi vida.
Al Dr. Javier Peralta Cruz por darme la oportunidad de trabajar con él y por sus
conocimientos brindados ante las dudas, por su apoyo incondicional y sobre todo por
ser un asesor más en el transcurso del trabajo de investigación.
A la Dra. Blanca Estela García Pérez por darme la confianza y facilitarme lo
necesario para realizar las pruebas biológicas de dichos compuestos.
A los Doctores Héctor Jaime Salgado Zamora y Adela Astudillo Vázquez por las
correcciones y mejoras para este trabajo de investigación.
A mis padres, hermanas y compañeros que se convirtieron en mi apoyo
incondicional y me brindaron su cariño que fue para mí un sostén para seguir con
alegría este proyecto de investigación.
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
Al apoyo analítico recibido de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN,
Instituto de Química y USAI de la Facultad de Química de la UNAM. RMN (Dr. Javier
Peralta Cruz, Q. Ma. de los Ángeles Peña, Dra. Beatriz Ortiz, M.C. Elizabeth Huerta
y M.C. Héctor Ríos), EM (Dr. Javier Peralta Cruz, I.Q. Luis Velasco y Dr. F. Javier
Pérez), IR (Q. Marisela Gutiérrez)
Parte de los resultados de la tesis ha sido presentado en el marco de las actividades científicas del
48° CONGRESO MEXICANO DE QUÍMICA
Celebrado en la ciudad de Guanajuato, Gto., del 31 de agosto al 4 de septiembre del
2013.
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
Dedicatoria:
A dios mi gran sostén y fortaleza.
A mi padre Fernando Uribe Cano por darme la confianza y creer en mis
conocimientos y apoyarme incondicionalmente en las buenas y en las malas.
A mi madre Juana González García por darme consejos que en mi quedaron como
aprendizajes y sobre todo por preocuparse por mí.
A mis hermanas Dulce María y Nallely por darme su cariño, amor, comprensión y
aliento de seguir adelante, por quererme con mis defectos y virtudes, por apoyarme
en cada paso y tropiezo que nos marcaron y sirvieron para superar los fracasos y
seguir con los éxitos.
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
EL TRABAJO FUE DESARROLLADO EN LOS DEPARTAMENTOS DE
INMUNOLOGÍA Y QUÍMICA ORGÁNICA DE LA ESCUELA NACIONAL DE
CIENCIAS BIOLÓGICAS DEL IPN, BAJO LA ASESORIA DE LA DRA. BLANCA
ESTELA GARCÍA PÉREZ Y DEL DR. ROGELIO JIMÉNEZ JUÁREZ,
RESPECIVAMENTE Y CONTO CON EL APOYO FINANCIERO DE LOS
PROYECTOS: SIP 20120756, SIP 20130724, SIP 20130933 Y DEL CENTRO DE
INVESTIGACIÓN E INNOVACIÓN TECNOLÓGICA DEL DISTRITO FEDERAL
PROYECTO ICYTDF/325/2011.
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
Índice
Índice de tablas..…………………………………………………………..………..I
Índice de figuras.……………………………………………………………...…....I
Índice de esquemas………………………………………………………….........II
Resumen…..……………………………………………………………………….III
1.- Introducción………………………………………………………………….....1
1.1.- Bencimidazoles.…………………………………………………………...1
1.1.1.- Métodos de síntesis..…………………………………………………...1
1.1.2.-Actividad biológica...………………………………………………….....4
1.2.- Mycobacterium tuberculosis……...……………………………………...4
1.2.1.-Etiologia...………………………...……………………………………....5
1.2.2.-Tratamiento..……………………...………………………………….......6
2.- Justificación….…………………………………………………………………..9
3.- Objetivos………………………………………………………………..……....10
3.1.- Objetivo general….………………..………………………….…………10
3.2.- Objetivos particulares…..………...……………………….………….....10
4.- Hipótesis…..………………………………………………….…………….…..11
5.- Metodología..…………………….……………………………………………..12
5.1.- Síntesis de (2-(3´- nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol…………...…...14
5.2.- Síntesis de (2-(2´-pirido)-5(6)-cloro bencimidazol…….………………15
5.3.- Síntesis de 1((Tien-2´-il) metil)) -2-(tien-2´-il) bencimidazol..………..16
5.4.- Síntesis de metasulfonato de hexadecilo…...…………………………17
5.5.- Síntesis de 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol..….18
5.6.- Micro ensayo Fluorométrico Alamar Azul…………………………...…19
6.- Análisis y discusión de resultados...…………………………………...…….23
7.- Conclusiones………………………………………………………….…..........35
8.- Referencias bibliográficas……………………………………………………..36
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
Índice de tablas
Tabla 1.- MICs de los bencimidazoles 5a, 5b, 4a y 4b frente a la cepa de referencia y cepas mono-resistentes
de M. tuberculosis…………………………………………………………………………………………..32
Índice de figuras
Figura 1: Anillo del bencimidazol…………………………………………………………….………………….…….…1
Figura 2: Estructura química de los medicamentos antituberculosos de primera línea….……………….…….…6
Figura 3: Estructura química de algunos medicamentos antituberculosos de segunda línea…………….…..….8
Figura 4: Conversión de resarzurina a resofurina por células viables………………….………………….….…...20 Figura 5: 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a,…………………………………….………………….….…..23
Figura 6: Espectro IR del compuesto 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a……………………….………23
Figura 7: Espectro de RMN 1H para (2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a…….……………….………...24
Figura 8: Espectro de RMN 13C del 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a……….……………….………..25
Figura 9: Espectro de masas del 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a………….…………………………25
Figura 10: 1-(Tien-2’-il) metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b…………………………………………….……………26
Figura 11: Espectro IR del compuesto 1-(Tien-2’-il) metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b………….……………26
Figura 12: Espectro de RMN 1H del 1-(Tien-2’-il) metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b………...…………………27
Figura 13: Espectro de RMN 13C del 1-(Tien-2’-il) metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b…………………………..27
Figura 14. 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 5a………………………………………………..28
Figura 15: Espectro de RMN 1H de 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 5a…………………..29
Figura 16: Espectro de RMN 13C de 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 5a……..…………..29
Figura 17: Espectro de masas de 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 5a………...…………..30
Figura 18: (2-(2´-pirido)-5(6)-cloro bencimidazol 4b…………………………………………………..……………30
Figura 19: Espectro de RMN 1H del (2-(2´-pirido)-5(6)-cloro bencimidazol 4b……………………...…………..31 Figura 20: Espectro de RMN 13C para 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b……………………………….31
I QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
Índice de esquemas
Esquema 1: Métodos usuales para la preparación de bencimidazoles……………………………..……2
Esquema 2: In (OTf)3 catalizador, formación de sales………………………………………………………2
Esquema 3: Síntesis de bencimidazoles 2-sustituidos con o-fenilendiamina y aldehídos en presencia
de ácido sulfónico funcionalizado sobre silicio……………………………………………………………….3
Esquema 4: Síntesis de bencimidazoles 2-sustituidos a partir de 2-nitroanilinas………………………-3
Esquema 5: Síntesis de bencimidazoles disustituidos (4a, 4b) y trisustuidos 5a a partir de 2-nitro-4-
cloroanilina 1 y aldehídos aromáticos 3……………………………………………………………………..13
Esquema 6: Síntesis de 2-(3´-nitrofenil)-5(6) cloro bencimidazol 4a a partir de la 4-cloro-2-nitroanilina
1 y meta-nitrobenzaldheído 3a………………………………………………………………………………..14
Esquema 7: (2-(2´-pirido)-5(6)-cloro bencimidazol 4b a partir de 2-nitro-4-cloroanilina 1 y 2-
piridincarboxaldheído 3b……………………………………………………………………………………….15
Esquema 8: Síntesis de 2-tien-2’-il) bencimidazol 4c y 1-(tien-2’-il) metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b
…...…………………………………..……………….…………………………………………………………..16
Esquema 9: Síntesis de metasulfonato de hexadecilo 7 a partir de alcohol cetílico 6 y cloruro de
metansulfunilo…………………………………………………………………………………..…………..…..17
Esquema 10: Síntesis del 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 5a a partir de 4a y
metansulfonato de hexadecilo 7………………………………………………………………………………18
II QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
RESUMEN En la actualidad, la tuberculosis cobra la vida de aproximadamente dos millones de
personas cada año. La necesidad de alternativas en el tratamiento efectivo contra
Mycobacterium tuberculosis resistente a los fármacos, ha promovido la búsqueda de
nuevos compuestos elaborados por síntesis química o derivados de plantas y
microorganismos.
Los bencimidazoles se han utilizado en diversos tratamientos farmacológicos como
antibacterianos, antivirales, anticancerígenos, antihelmínticos, etc. La potencia de
éstos farmoquímicos son utilizados en el tratamiento de infecciones microbianas.
Así, los bencimidazoles son compuestos muy eficaces en los tratamientos contra
diversas cepas de bacterias, debido a su similitud estructural con las purinas, se ha
propuesto como posible mecanismo de acción la competencia con estas moléculas,
dando como resultado la inhibición de la síntesis de los ácidos nucleicos y proteínas
en las bacterias. Por ello en este trabajo se realizó la síntesis orgánica de
bencimidazoles con sustituyentes en la posición 1, 2, y 5(6) y se analizó su actividad
in vitro en cepas sensibles y mono-resistentes de Mycobacterium tuberculosis
mediante ensayo fluorométrico empleando como indicador Alamar Azul. Todos los
ensayos se evaluaron por fluorometria y por interpretación visual de la microplaca,
se consideró la concentración mínima inhibitoria (MIC) a aquella concentración
correspondiente al último pozo que permaneció azul y cuya intensidad de color fue
igual o menor a la obtenida en el control. Dos de los compuestos analizados
presentaron actividad relevante contra Mycobacterium tuberculosis, destacaron los
compuestos; (2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol y (2-(2´-pirido)-5(6)-cloro
bencimidazol, lo cual en el ensayo in vitro inhibieron el crecimiento de M.
tuberculosis MtbH37-Rv a concentraciones de 3.125 y 12.5µg/mL respectivamente.
Los compuestos: 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol y 1-(tien-2’-il)
metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol no mostraron actividad relevante contra M.
tuberculosis, dando una CMI de 50 µg/mL. La adición de la cadena hidrocarbonada
en la posición 1 del (2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol disminuye su actividad
antimicobacteriana y los resultados señalan el papel potencial de los bencimidazoles
contra M. tuberculosis.
III QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
1.-INTRODUCCIÓN
1.1-Bencimidazoles.
El Bencimidazol (Figura 1) es un sistema aromático fusionado de benceno e
imidazol.1 Este núcleo posee características ácidas y básicas y tiene la capacidad
de formar sales, además, presenta tautomería debido al cambio prototrópico rápido
del grupo NH, lo que conduce a las mezclas en equilibrio dinámico de compuestos
sustituidos asimétricamente.2
NH
N
Figura 1. Anillo del bencimidazol.
El bencimidazol está en la estructura de la vitamina B12. Otros bencimidazoles están
disponibles comercialmente en productos farmacéuticos para uso veterinario y en
humanos.3
1.1.1-Métodos de síntesis
Se han reportado gran variedad de métodos para la preparación de bencimidazoles.
La primera estrategia fue descrita por Philips.6 Las estrategias más comunes para la
síntesis de bencimidazoles contemplan la condensación de o-fenilendiamina con
ácidos carboxílicos o sus derivados4 bajo condiciones severas de deshidratación
utilizando ácidos fuertes para tal fin, como ácido polifosfórico, ácido clorhídrico, ácido
bórico o ácido p-toluenosulfónico,7 y la condensación con aldehídos bajo condiciones
de oxidación (Esquema 1).5
1 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
NH2
NH
X
RR´CHO-H2O
R´COOH-H2O
NH
NH
X
X
R
O
R´
N
HN
R´
R
O
-H2O
X
N
N
R´
R
Esquema 1: Métodos usuales para la preparación de bencimidazoles5
Recientemente se han reportado protocolos de preparación de bencimidazoles
usando catalizadores más suaves, como ácidos de Lewis (In (OTf)3) (Esquema 2) 9 y
arcillas inorgánicas, las cuales han permitido realizar la síntesis de bencimidazoles
bajo condiciones más suaves y mejorando tanto el rendimiento de conversión como
la pureza de los productos obtenidos.2
NH2
NH2
+R H
O
NH
N
R
In(OTf)3
Esquema 2: In (OTf)3 – catalizador, formación de bencimidazoles9.
Una síntesis reportada de bencimidazoles por reacción de o-fenilendiamina con
aldehídos fue en presencia de silica gel funcionalizada con ácido sulfónico como un
catalizador heterogéneo de interface en la síntesis de bencimidazoles (Esquema 3) a
temperatura ambiente.8
2 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
NH2
NH2
+Ar H
O
NH
N
Ar
silica gel funcionalizada con ácido sulfónico
CH2Cl2, 02t.a., 1-2 h
72 - 88 %
Esquema 3: Síntesis de bencimidazoles 2-sustituidos con o-fenilendiamina y aldehídos en presencia
de silica tratada con ácido sulfónico.8
Varios de los últimos procedimientos son llevados a cabo por la condensación de
1,2-diaminobencenos con aldehídos aromáticos en la presencia de un reactivo
oxidante para generar el núcleo del bencimidazol.8 Usando este protocolo, los
aldehídos aromáticos y alifáticos han sido convertidos convenientemente en los
correspondientes bencimidazoles 2-sustituidos con rendimientos buenos.
Alternativamente, los bencimidazoles también se han preparado a partir de 2-
nitroanilidas, en un proceso de dos pasos: en la primera etapa, el grupo nitro se
reduce utilizando reductores conocidos (Esquema 4)2 y en segundo paso se
condensa la 2-aminoanilida obtenida con un ácido carboxílico (o alguno de sus
derivados) o un aldehído utilizando los procedimientos mencionados anteriormente.
NO2
NH2R1
SnCl2 . 2H2O
R2COOHmicroondas,130°C,5 min.
R1
NH2
NH R2
ONH
N
R1
R2
R1= H, 4,5-dimetil, 5-OH, 5-OH, 5-OMe, 5-COOH, 5-CN, 5-CF3, 4,6-dicloroR2= H, Me, CF3
Esquema 4: Síntesis de bencimidazoles 2-sustituidos a partir de 2-nitroanilinas2
3 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
1.1.2 Actividad biológica
Los bencimidazoles tienen presencia relevante en medicina humana utilizados en
diversos tratamientos farmacológicos como antibacteriales,11 antivirales,10
anticancerígenos,12 antihelmínticos en la medicina veterinaria,13 etc. La potencia de
estos farmoquímicos son utilizados en el tratamiento de infecciones microbianas.16
Así, los bencimidazoles son compuestos muy eficaces en los tratamientos contra
diversas cepas de bacterias.14 Debido a la similitud estructural con las purinas, la
actividad antibacteriana de los bencimidazoles son explicados por su competencia
con las purinas, teniendo como resultando la inhibición de la síntesis de los ácidos
nucleícos y proteínas en bacterias.15 Los bencimidazoles aril ó heteroaril 2-
sustituidos, son considerados bioisósteros estructurales de nucleótidos, que podrían
interaccionar con los biopolímeros y tener actividad farmacológica posiblemente con
menos efectos secundarios.15
1.2.-Mycobacterium tuberculosis
El agente causal de la tuberculosis es Mycobacterium tuberculosis, fue descrito en
1882 por Robert Koch,17 esta bacteria es de forma bacilar pequeño con forma de
bastón delgado, presenta una capa serosa externa, es un bacilo aerobio, inmóvil,
que mide de 0,8 a 4 micras de longitud y no forma esporas; su temperatura óptima
de crecimiento es de 34-37 ºC, es resistente al frío y a la desecación. La tuberculosis
es una enfermedad respiratoria de transmisión que afecta a casi el 32% de la
población mundial, más que cualquier otra enfermedad infecciosa.18 La transmisión
de los bacilos de la tuberculosis se produce casi exclusivamente por medio de los
núcleos suspendidos en pequeñas gotas de saliva que son expulsadas con la
expectoración de las personas afectadas por tuberculosis pulmonar.19 Los bacilos
inhalados se alojan en los espacios de la terminal aérea del pulmón donde entran y
se replican dentro de los macrófagos alveolares.17 La infección inicial o primaria, por
M. tuberculosis consiste en la replicación del microorganismo en el lugar inicial de la
infección pulmonar pudiendo diseminarse a los ganglios linfáticos dentro del pulmón
y de ahí diseminarse a sitios remotos del cuerpo. La infección primaria es casi
siempre asintomática en adultos.20, 21
4 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
M. tuberculosis es la bacteria más destacada entre los patógenos por su capacidad
para establecer y mantener un estado de latencia, período durante el cual la persona
infectada no tiene tuberculosis clínicamente aparente, pero alberga organismos
viables de M. tuberculosis que pueden reactivarse en una fecha posterior.22 La
reactivación de la infección latente por M. tuberculosis suele ocurrir en personas
aparentemente sanas, y con mucha frecuencia en las personas con supresión del
sistema inmunitario, como sucede en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA) o en la diabetes, 23 etc.
1.2.1 Etiología
La tuberculosis por Mycobacterium tuberculosis es una de las causas globales de
muertes, responsable de 9.4 millones de casos en el 2009 y resultaron 1.6 millones
de muertes.24 En Latinoamérica, aproximadamente 253,000 casos nuevos de
tuberculosis se registraron en 2010, de los cuales 19000 fueron reportados en
México.25 De acuerdo a la organización mundial de la salud en 2011 se estimaron
8.7 millones de nuevos casos y 1.4 millones de muertes.26
Además, personas en el mundo están contrayendo la tuberculosis debido a que sus
sistemas inmunológicos están comprometidos por los fármacos inmunosupresores,
abuso de sustancias, o el SIDA.23 La distribución de la tuberculosis no es uniforme
en todo mundo, así, la población de países asiáticos y africanos dan resultado
positivo en las pruebas de tuberculina aproximadamente el 80%, mientras que sólo
el 5-10% de la población de los EE.UU dan la prueba positiva.27
La aparición de esta enfermedad está relacionada con la falta de higiene, la
densidad de población, la mala nutrición y bajos recursos.28
5 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
1.2.2 Tratamiento El tratamiento de la tuberculosis requiere varios antibióticos durante por lo menos
seis meses,30 y la administración de medicamentos de segunda línea hasta 2 años,29
lo cual causa un elevado grado de incumplimiento. Esta situación favorece la
aparición de cepas clínicas resistentes a una o más drogas.30 El tratamiento de
Mycobacterium tuberculosis es prolongado y requiere combinar varios fármacos, ya
que existen poblaciones de bacilos diferentes en cuanto a su actividad metabólica
puesto que tienen lugar mutaciones cromosómicas espontáneas que producen
resistencia.31
Fármacos empleados en el tratamiento contra M. tuberculosis
El éxito del tratamiento se basa en la asociación de fármacos de primera línea.31
N
NH
O
NH2
IsoniazidaN
NNH2
O
Pirazinamida
HOH2CHN
C2H5
NH
CH2OH
C2H5
Etambutol
OO
NH
HO
HO
HO
CH3
OHO
CH3HO
O
OH
OH
N
HO
N
NH2
H2NNH2
H2NEstreptomicinaOH
NHOH
O
H3COH
N
O
NN
CH3
OCH3
CH3
OH
CH3
HO
O
O
OH3C
O
CH3
H3CCH3
Rifampicina
Figura 2. Estructura química de los medicamentos antituberculosos de primera línea: Isoniazida,
Rifampicina, Pirazinamida, Etambutol y Estreptomicina. 32
6 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
Todos actúan sobre la síntesis de ácidos grasos complejos de las micobacterias,
excepto la rifampicina que es un inhibidor de RNA polimerasas de células
procariotas y la estreptomicina que es un inhibidor de la síntesis de proteínas.33
Rifampicina (RIF); es un potente inhibidor de la síntesis de RNA mensajero (ARNm)
y, por tanto, de la transcripción genética, al unirse a la polimerasa de ARN
dependiente de ADN de las células procariotas. La inhibición de la transcripción
tiene lugar porque la RIF se fija a la subunidad β. Tiene un efecto bactericida sobre
las células de M. tuberculosis metabólicamente activas. La RIF, en combinación con
la pirazinamida (PZA) en los esquemas terapéuticos, ha permitido acortar el
tratamiento de la tuberculosis no complicada a 6 meses.31, 32
La Pirazinamida (PZA); posee un potente efecto esterilizante sobre los bacilos
tuberculosos latentes en el interior de los macrófagos, cuando se usa asociada a la
RIF permite acortar la duración del tratamiento de la tuberculosis no complicada a 6
meses. No obstante, carece de actividad frente a las demás micobacterias,
incluyendo otros componentes del complejo tuberculosis.34 Es fundamentalmente
bacteriostático aunque también puede actuar como bactericida. Se desconoce su
mecanismo de acción pero se sabe que actúa mejor en los bacilos que se
encuentran dentro de macrófagos en medio ácido. Interrumpe la membrana
plasmática y altera el metabolismo energético.35
La Isoniacida (INH) inhibe una serie de enzimas que las micobacterias necesitan
para sintetizar ácidos micólicos impidiendo la formación de la pared bacteriana. Sin
embargo, se desconoce el mecanismo exacto de su acción.36 La Isoniazida es
bactericida o bacteriostática dependiendo de la concentración del fármaco en el
lugar infectado y de la susceptibilidad del microorganismo.37 La Isoniazida es
bactericida frente a microorganismos en fase de división rápida como los que se
encuentran extracelularmente en las lesiones cavitarias y bacteriostático frente a los
que se encuentran en fase de división lenta como los que se están en los
macrófagos. Frente a estos, la rifampina o la pirazinamida son más efectivos.38
7 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
El Etambutol (ETB) es un bacteriostático, aunque también muestra efectos
bactericidas si las concentraciones son lo suficientemente elevadas. Actúa
inhibiendo la transferencia de los ácidos micólicos a la pared celular e inhibe la
síntesis de arabinogalactano, un polisacárido clave en la estructura de la pared
celular de las micobacterias y en donde se forman las moléculas de ácido micólico.39
La Estreptomicina (STR); es un antibiótico aminoglucósido que interfiere en la
síntesis proteica bloqueando la traducción del ARNm tanto en su inicio como en la
incorporación de nuevos aminoácidos a la cadena polipeptídica.39
Los fármacos de segunda línea (figura 3) se clasifican de acuerdo con su
actividad.40, 31
bactericida; los aminoglucósidos (amikasina/kanamicina).
bactericida baja; fluoroquinolonas (ciprobloxacina, afloxacina).
bacteriostático; cicloserina, etionamida, acido para-aminosalicílico.
HN
O
O
NH2
CicloserinaN
CH3
S NH2
Etionamida
F
N
NH
N
O
OH
O
Ciprofloxacina
OHH2N
OH
O
Ácido p-amino salicílico
HN
O
ONH2
O
H2N
OH
O
O
OHHO
OH
OH
NH2
OH
H2NOH
Amikacina
Figura 3. Estructura química de algunos medicamentos antituberculosos de segunda línea:
cicloserina, etionamida ácido p-amino salicílico, ciprofloxacino, amikacina.31
8 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
2.- JUSTIFICACIÓN
En la actualidad, la tuberculosis cobra la vida de aproximadamente dos millones de
personas cada año y es una enfermedad que causa un alto número de muertes en el
mundo. Las estadísticas recientes de la organización mundial de la salud estiman
que hay aproximadamente 8.4 millones de casos nuevos cada año con una tasa de
mortalidad global de 23% o aproximadamente 2 millones de muertes al año.
Además, los tratamientos de la tuberculosis son de periodo largo (seis meses o
más), por lo que mucha gente no llega a concluirlos.
Como consecuencia, han aumentado las cepas multidrogo-resitentes y cepas
extremadamente resistentes de Mycobacterium tuberculosis. Aunado a esto, también
se ha observado el resurgimiento de la tuberculosis en individuos inmunosuprimidos
e infectados por VIH o enfermos con diabetes.
Por estos motivos existe la necesidad urgente de buscar nuevos fármacos que
contribuyan al control y a la erradicación de la enfermedad. Diversas son las fuentes
para la obtención de nuevos compuestos: extracción de fuentes naturales y por
síntesis química. En el presente trabajo se planteó la preparación de compuestos
químicos y el estudio de la actividad contra Mycobacterium tuberculosis.
9 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
3.- OBJETIVOS
3.1.- Objetivo general
Sintetizar bencimidazoles disustituidos y trisustituidos mediante la
condensación de 4-cloro-1,2-fenilendiamina con aldehídos aromáticos y
heteroaromáticos y determinar su potencial actividad sobre Mycobacterium
tuberculosis.
3.2.- Objetivos particulares
Sintetizar el 2-(3’-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol como una mezcla de
tautómeros en equilibrio dinámico.
Sintetizar el 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol como una mezcla de
tautómeros en equilibrio dinámico.
Sintetizar el 1-(Tien-2’-il) metil)-2-(tien-2’-il) bencimidazol como una mezcla de
regioisómeros.
Sintetizar el 1-hexadecil-2-(3’-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol como una
mezcla de regioisómeros.
Evaluar la potencial actividad antimicobacteriana de los bencimidazoles
preparados usando como indicador Alamar azul en el ensayo colorimétrico.
10 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
4.-HIPOTESIS
Los bencimidazoles disustituidos y trisustituidos tienen actividad biológica sobre
cepas de Mycobacterium tuberculosis.
11 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
5.-METODOLOGÍA
Material y métodos
Los reactivos y disolventes utilizados fueron grado reactivo y en algunas ocasiones
las materias primas fueron sintetizadas y purificadas por métodos usuales como
cromatografía en columna. Los disolventes fueron purificados por destilación
fraccionada, previo tratamiento de los mismos como se indica: Acetato de Etilo (3%
en peso NaHCO3 y calentamiento a reflujo durante 3h), Hexano (3% en peso de CaO
y calentamiento a reflujo durante 4h), CH2Cl2 (3% en peso de CaCl2 y calentamiento
a reflujo durante 2h), Acetonitrilo Seco (3% de P2O5 y agitación a temperatura
ambiente durante 24h).
El progreso de las reacciones fue seguido por cromatografía en capa fina (ccf)
usando cromatofolios de gel de sílice 60 con indicador fluorescente F254. Las
cromatoplacas fueron observadas con una lámpara de luz ultravioleta MODEL UVG-
11, MINERALIGHT LAMP con 115 volts, 60 Hz, 0.16 amperes y 254 nm. Las
mezclas de reacción fueron separadas por cromatografía en columna usando gel de
sílice 60 (0.003-0.200mm) HERKC KGA/64271.
Los puntos de fusión fueron determinados en un aparato ELECTROTHERMAL
A29003MB. Los espectros de resonancia magnética nuclear de protón (RMN1H) y
carbono (RMN13C) fueron obtenidos de espectrofotómetro Varian mercury 500 con
una radiofrecuencia de 300 y 500 MHz para RMN 1H y 125 MHz para RMN 13C,
Varian Gemini 200 y Varian Eclipse 300. Fueron disueltas en dimetilsulfóxido
deuterado (DMSO-d6), cloroformo deuterado (CDCl3). La referencia interna fue
tetrametilsilano (TMS).
Los espectros de masas fueron obtenidos del equipo Jeol JMS-AX505HA, utilizando
impacto electrónico directo con voltaje de ionización de 70 Ev. Los espectros de
infrarrojo (IR, pastilla de KBr) se obtuvieron de un espectrofotómetro FT-IR Perkin
Elmer 1605 y FT-IR Nicolet Magna 750.
12 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
Obtención de bencimidazoles disustituidos y trisustituidos
Las síntesis de los compuestos 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a, 2-(piridin-
2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b, 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol
5a, se realizó como se muestra en el esquema 1.
Esquema 5: Síntesis de bencimidazoles disustituidos (4a, 4b) y trisustuido (5a) a partir de 2-nitro-4-
cloroanilina 1 con los aldehídos aromáticos 3.
Así, la 4-cloro-2-nitroanilina 1 se hizo reaccionar con ditionito de sodio en medio
acuoso y calentamiento a reflujo (alrededor de 2 a 4 horas) para reducir el grupo
nitro y obtener la 4-cloro-1,2-fenilendiamina 2, la cual sin purificar fue condensada
con meta-nitrobenzaldheído 3a o el 2-piridincarboxaldehido 3b promoviendo la
reacción con bentonita activada como catalizador heterogéneo en acetonitrilo seco y
agitación a temperatura ambiente y aire como agente oxidante para formar el
bencimidazol disustituido: 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a y el 2-(piridin-2’-
il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b. Finalmente el compuesto disustituido 4a se hizo
reaccionar con metasulfonato de hexadecilo 7 en medio básico y calentamiento a
reflujo para obtener el bencimidazol trisustituido, 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)
cloro bencimidazol 5a.
13 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
A continuación se describen los procedimientos para realizar la síntesis de cada uno
de los compuestos.
5.1.- Síntesis de (2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a
Cl NO2
NH2
Na2S2SO4
H2O, Reflujo
1
Cl NH2
NH2
2
CH3CN Anh., bentonitat.a.
HO
3a
4a
NO2
NH
NClNO2
3a4
5
67
7a
2´
4´
5´6´
Esquema 6: Síntesis de (2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a a partir de la 4-cloro-2-nitroanilina
1 y meta-nitrobenzaldehido 3a.
Procedimiento:
En un matraz balón se colocaron: 0.50 g (2.90 mmoles) de 4-cloro-2-nitroanilina 1, 2.02g (11.60 mmoles, 4 equivalentes molar) de ditionito de sodio (Na2S2SO4) y se
suspendieron en 5 mL de agua. La mezcla de reacción se colocó a reflujo con
agitación magnética vigorosa durante 2 horas aproximadamente. La mezcla de
reacción cambió de color amarilla a café oscuro. El avance de reacción se monitoreó
por cromatografía en capa fina (ccf) usando como fase móvil un sistema
AcOEt/Hexano 1:3, las cromatoplacas se observaron con lámpara luz UV.
Posteriormente se realizó una extracción líquido-líquido AcOEt/H2O (3x20 mL). Se
juntaron los extractos orgánicos, se secaron (Na2SO4 anhidro), filtraron y el
disolvente se evaporó a presión reducida. Al extracto obtenido se agregó 0.35 g
(2.26 mmoles, 0.9 equivalente molar) de 3a y 0.34 g de bentonita activada. Se
suspendieron en acetonitrilo (15 mL) y se agitaron a temperatura ambiente durante 4
horas, aproximadamente. Cuando se observó el término de la reacción, la mezcla de
reacción se filtró al vacío y se lavó muy bien el filtro con acetona y volvió a filtrarse
por gravedad, el disolvente se evaporó a presión reducida. El producto crudo 4a se
purificó por cromatografía en columna usando como fase móvil: AcOEt/hexano 5:95
(100 mL) y AcOEt/hexano 40:60 (100 mL). Las fracciones que contenían al
compuesto 4a se juntaron y el disolvente se evaporó a presión reducida. Se obtuvo
14 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
4a como un sólido amarillo crema. Rendimiento de 64 % (0.5055 g) y p.f. 210 °C
(Lit.20 pf 208 oC). Rf 0.45 (AcOEt/hexano). IR (KBr): 3322 (N-H), 1513 (NO2) cm-1.
RMN1H δ: 13.4 (sa, 1H, NH), 8.9 (t, 1H, J=1.2 Hz, H2’), 8.5 (dt, 1H, J=7.8, 1.2 Hz,
H6’), 8.3 (dt, 1H, J=7.8, 1.2 Hz, H4’), 7.8 (t, 1H, J=7.8 Hz, H5’), 7.6 (t, 2H, J=8.4 Hz,
H4, H7), 7.2 (dd, 1H, J=8.4, 2.1 Hz, H6). RMN 13C δ: 151.1, 149.0, 133.2, 131.9,
131.4, 125.2, 123.6, 121.6. MS (m/z, %): 275 (M++2, 33), 273 (M+, 100), 243 (M+-NO,
4), 227 (M+-NO2, 45), 192 (M+-NO2 y Cl, 30).
5.2.- Síntesis de 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b
Cl NO2
NH2
Na2S2SO4
H2O, Reflujo
1
Cl NH2
NH2
2
CH3CN Anh., bentonitat.a.
HO
3b N
4b
NH
NCl
N
3a4
5
67
7a
2´
4´
5´
6´
3´
Esquema 7: 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b a partir de la 4-cloro-2-nitroanilina 1 y 2-
piridincarboxaldheído 3b.
Procedimiento:
En un matraz balón se adicionan 0.5 g (2.90 mmoles, 1 equivalente molar) de la 4-
cloro-2-nitroanilina 1 y 5.05 g (29.07 mmoles, 10 equivalentes molar) de ditionito de
sodio (Na2S2SO4), se suspendieron en 20 ml de agua y se calentó a reflujo
aproximadamente 6 horas con agitación vigorosa. Se observa un cambio de color
amarillo a café marrón oscuro. La reacción se monitoreó por ccf en un sistema
AcOEt/hexano 1:2. Posteriormente se pasó a un embudo de separación y se realizó
una extracción líquido-líquido AcOEt/H2O (3X20). Se reunieron las fases orgánicas y
se secaron con sulfato de sodio anhidro, se filtró a presión reducida, posteriormente
el disolvente se evaporó a presión reducida. Al producto obtenido se le adicionó el 2-
piridincarboxaldehído 3b (0.26 mL, 2.80 mmoles, 0.8 equivalentes molar) de
(densidad 1.12 g/mL) y 0.34 g de bentonita activada, se suspendieron con la mínima
cantidad de acetonitrilo (4 mL) y se dejó en agitación a temperatura ambiente
15 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
aproximadamente 24 horas. La reacción se monitoreó por ccf sistema AcOEt/hexano
1:3, observando el compuesto 4b en la cromatoplaca como una mancha morada
fluorescente con la lámpara UV. Se filtró la mezcla de reacción al vacío lavando el
filtro con acetona y después se evaporó el disolvente al vacío. El producto de
reacción obtenido se purificó por cromatografía en columna, usando como fase
móvil: AcOEt/hexano 10/90, se obtuvo un líquido viscoso marrón con un rendimiento
de 25%. Rf 0.19 (AcOEt/hexano). RMN1H δ: 13.2 (sa, 1H, NH), 8.7 (m, 1H, H3’), 8.5
(d, 1H, J=7.9 Hz, H4’), 8.0 (t, 1H, J=1.9 Hz, H6’), 7.8 (m, 1H, H4), 7.6 (m,1H, H6), 7.5
(t, 1H, J=6 Hz, H5’), 7.3 (d, 1H, J=8 Hz, H7). RMN 13C δ: 167, 166.5, 144.5, 144, 141,
129.5, 129, 128.6, 128.3, 125.1.
5. 3.- Síntesis de 2-(tien-2’-il) bencimidazol 4c
NH2
NH2
SCHO
CH3CN Anh, bentonitaagitacion, t.a
2´
NH
N S+
3c
4c
N
N S
S
4
5
67
7a
3a
3"
4"
5"
3´4´
5´
5b
Esquema 8: Síntesis de 2-(tien-2’-il) bencimidazol 4c y 1-[(Tien-2’-il) metil]-2-(tien-2’-il) bencimidazol
5b
Procedimiento:
El bencimidazol 4c se preparó de acuerdo el procedimiento general usando las
cantidades de reactivos siguientes: o-fenilendiamina 2´ (434 mg, 4,02 mmol), 2-
tiofencarboxaldehido 3c (500 mg, 4,46 mmol), bentonita (500 mg) y acetonitrilo
anhidro (15mL). El producto obtenido se purificó por cromatografía en columna,
usando como fase móvil acetato de etilo/hexano (30:70). Se obtuvo un sólido amorfo
beige en 63 % de rendimiento; p.f. 333-334 ºC (Lit. 21 Pf 330-332 °C). IR (KBr):
3431 (NH), 1621 (N=C) cm-1. RMN 1H (200 MHz, Acetona-d6) δ: 7.82 (dd, 1H, J=3.6
y 1.2 Hz, H3’), 7.65 (dd, 1H, J=4.8 y 1,2 Hz, H5’), 7.56 (m, 2H, H4 y H7), 7.20 (m,
3H, H5, H6 H4’). RMN 13C (50 MHz, Acetona-d6) δ: 148.1, 147.7, 1351, 129.0,
128.8, 127.0, 123.1, 115.8.
16 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
Adicionalmente se obtuvo el bencimidazol 5b, como un sólido amorfo de color café
en 23% rendimiento; p.f. 120-123 ºC (Lit. 22 pf 124-128 °C). IR (KBr): 1611 (N=C)
cm-1. RMN 1H (200 MHz, CdCl3) δ: 7.83 (m, 1H, H4), 7.50 (m, 2H, H5’ y H3’), 7.29
(m, 4H, H6, H7, H5’ y H4’), 7.14 (dd, 1H, J=5 y 3.6 Hz, H5’’), 7.94 (dd, 1H, J=5 y 3.6
Hz, H3’’), 6.86 (m, 1H, H4’’), 5.70 (s, 2H, CH2). RMN 13C (50 MHz, CdCl3) δ: 147.5,
142.7, 138.7, 135.8, 133.8, 131.6, 128.9, 128.1, 127.9, 127.2, 125.5, 125.4, 123.3,
123.0, 119.8, 44.1.
5.4.- Síntesis del metasulfonato de hexadecilo 7
OH14CH3SO2Cl
CH2Cl2/Et3N/K2CO30°C, 24 hr.
O14S
O
O
CH3
6 7
Esquema 9: Síntesis de metasulfonato de hexadecilo 7 a partir de alcohol cetílico 6 y cloruro de
metánsulfunilo.
Procedimiento:
Se pesaron 5 g (2.06 mmoles) de alcohol cetílico 6 y se disolvió con diclorometano
seco (10 mL). Posteriormente se adicionó 1.4 mL (13.83 mmoles, 1.04 g, 0.5
equivalentes molar) de trietanolamina (Et3N), (densidad 0.72 g/mL) y 2.84g (20.54
mmoles, 1 equivalente molar) de carbonato de potasio (K2CO3). La mezcla de
reacción se enfrió con hielo y se agitó magnéticamente. Enseguida 1.95 mL (25.23
mmoles, 1.2 equivalentes molar) del cloruro de mecilo (CH3SO2Cl) se adicionaron
durante 10 minutos. Terminando la adición se tapó el matraz balón y se dejó en
baño de hielo durante 24 horas bajo agitación magnética. Después de evaporar el
disolvente se obtuvo un producto cristalino que se dejó secar 24 horas.
Posteriormente se realizó una extracción líquido-líquido de agua/hexano (3x20 mL).
Se juntaron las fases orgánicas, se secaron (Na2SO4 anhidro), se filtró a gravedad,
seguido de evaporación del disolvente a presión reducida. Se obtuvo 7 como un
sólido blanco cristalino con un punto de fusión de 45 °C, un rendimiento de 79.99 %
17 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
(5.29 g). Las propiedades espectroscópicas son consistentes con los de la
literatura.41
5.5.- Síntesis del 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 5a.
Cl
N
NNO2
H
O14S
O
O CH3
NaHCO3, CH3CN anhReflujo 120°C 17 hrs
N
N
N
N
Cl
ClNO2
15
NO2
154a
5a
5a´
2´
4´
5´6´
4
67
7a
3a
7
Esquema 10: Síntesis del 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol (5a, 5a’) a partir de 4a
y metansulfonato de hexadecilo 7
Procedimiento:
En un matraz balón se colocó el bencimidazol 4a 0.11 g (0.42 mmoles) y bicarbonato
de sodio (NaHCO3) (0.08 g, 0.98 mmoles, 2 equivalentes molar) y se suspendieron
en acetonitrilo anhidro (20 mL) y se agitaron a temperatura ambiente durante 30
minutos. Transcurrido este tiempo se adicionó el metasulfonato de hexadecilo 7 (0.16g, 0.51 mmoles 1.2 equivalente molar) y se calentó a reflujo durante 17 horas.
El avance de reacción se monitoreó por ccf eluyendo 1 vez con el sistema
AcOEt/hexano 1:3 y se observó la cromatoplaca con una lámpara UV. Terminada la
reacción se quitó el reflujo y el disolvente se evaporó bajo presión reducida. El crudo
de reacción obtenido se repartió en hexano/agua (60x20 mL).Se reunieron las fases
orgánicas, se secaron (Na2SO4 anhidro), se filtraron por gravedad y el filtrado de
color guinda claro se evaporó a presión reducida. El producto obtenido se cargó en
una columna cromatográfica de gel de sílice 60 (0.063-0.200 mm) con el propósito
de separar la mezcla de regioisómeros eluyendo la columna con AcOEt/hexano
10:90. Los eluatos fueron monitoreados por ccf utilizando el sistema AcOEt/hexano
18
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
1:3. Se obtuvo 5a como un sólido-viscoso guinda, Rf 0.4186 Rendimiento 18 %
(0.03g). RMN1H δ: 8.53 (s, 1H, H2’), 8.38 (d, 1H, J=8 Hz, H4’), 8.22 (d, 1H, J=7.5 Hz,
H6’), 7.8 (t, 1H, J=8 Hz, H5’), 7.73 (s, 1H, H4), 7.68 (d, 1H, J=8.5 Hz, H6), 7.3 (d, 1H,
J= 8.5 Hz, H7) 4.1 (t, 2H, J=10 y 5 Hz, -H2CN), 1.2 (m, 28H, 14 CH2), 0.8 (t, 3H, J=5
Hz, -CH3). RMN 13C δ: 152.4, 148.4, 143.75, 135.7, 135.08, 135.04, 131.05, 127.3,
125, 124, 123.5, 119.3, 113, 70.8, 33, 31.5, 30.2, 29.3, 29.3, 29.17, 28.97, 28.93,
28.91, 28.7, 26.2, 25.96, 25.34, 22. 53, 14.3.
5.6.- Microensayo Fluorométrico empleando como indicador alamar azul
Se utilizó el microensayo fluorométrico del alamar azul para la evaluación de la
actividad antimicobacteriana de los compuestos: 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro
bencimidazol 4a, 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b, 1-hexadecil-2-(3´-
nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 5a y 1-(tien-2’-il)metil]-2-(tien-2’-il)bencimidazol 5b.
Es un método desarrollado para determinar la actividad antimicobacteriana de
fármacos. El ensayo se realiza en una microplaca de cultivo de 96 pozos que ofrece
las ventajas de la miniaturización con el consecuente ahorro de reactivos,
compuestos a probar, tiempo de obtención de resultados y se basa en la utilización
del colorante alamar azul.42
El alamar azul es un indicador de óxido-reducción que bajo un ambiente de
crecimiento bacteriano cambia de su forma oxidada a su forma reducida (figura 4).
Este indicador cambia de color azul (no fluorescente) cuando está en su estado
oxidado a rosa intenso (fluorescente) frente a un ambiente reductor como el
generado durante el metabolismo celular, el cambio de color puede detectarse
visualmente. Esta propiedad ha sido utilizada para medir la viabilidad de
Mycobacterium tuberculosis luego de la exposición a las drogas antituberculosas. Es
un método simple, rápido y de bajo costo que no requiere de un equipamiento
especial para su utilización.44, 48, 49
19
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
Figura 4. Conversión de resazurina a resofurina por células viables.43
Procedimiento:
Todo el proceso desde la disolución de los compuestos y la manipulación de las
cepas de trabajo y aislados clínicos se realizaron en un gabinete de bioseguridad
nivel II. Al igual que el desarrollo de los ensayos de actividad in vitro, se utilizó el
equipo de protección adecuado como, mascarilla con filtro N95, guantes de látex,
bata y Fenol 5% o benzal para el desecho de material contaminado.
a) preparación de la suspensión bacteriana de trabajo
Se tomó una alícuota de cultivo de M. tuberculosis en fase log (2-5 semanas) y se
transfirió a un tubo con tapón de rosca de 13x100 mm. Se ajustó la suspensión al
tubo No.1 del nefelómetro de McFarland con medio Middlebrook 7H9. El cual se
rotuló como suspensión A. De la suspensión A se realizó una dilución 1:10 con el
medio Middlebrook 7H9 sin tween 80. Por cada placa a ensayar, se prepararon 11
ml de la dilución (suspensión de trabajo B) la cual se realizó en una caja Petri de
60x100.
20
(Azul) (Rosa)
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
b) Preparación de las soluciones de trabajo de los compuestos de estudio.
En microtubos estériles, se prepararon las disoluciones en DMSO (dimetilsulfóxido)
de los compuestos sintetizados. Los compuestos puros se prepararon a una
concentración de 10 mg/mL. La solución de trabajo se preparó a una concentración
4 veces mayor a la máxima a ensayar en el estudio y que para el caso de los
compuestos puros fue de 200 µg/mL (50 µg x 4). Esta solución se preparó en el
medio Middlebrook 7H9 con OADC y sin tween.
c) Preparación de la microplaca
Se utilizaron placas de 96 pozos, nuevas, en el momento de uso se retiraron de su
empaque y se marcaron adecuadamente. Los pozos de la periferia se dejaron
intactos, y a los 60 pozos restantes se les adicionaron 100 µL medio Mlddlebrook
7H9 con OADC (ácido oleico-albumina-dextrosa-catalasa) sin tween. Se adicionaron
100 µL de la solución de trabajo del compuesto a ensayar, en el pozo que inicia cada
columna de trabajo. Una vez que se agregó la solución de trabajo a los pozos
correspondientes, se realizaron las diluciones seriadas 1:2 a 1:32, mezclando
perfectamente el contenido del primer pozo y posteriormente tomando 100 µL del
mismo y transferirlos al siguiente conjunto de pozos. Se repitió el procedimiento
hasta completar la dilución seriada requerida tomando en cuenta que se eliminaron
los 100 µL de la última dilución realizada de cada compuesto. Una vez realizadas las
diluciones seriadas, se adicionaron 100 µL de la suspensión bacteriana B a cada
pozo con los compuestos diluidos. Una vez que se prepararon los pozos de ensayo
de compuestos, se procedió a preparar los controles del ensayo, los cuales fueron
de tres tipos: el control C se preparó con 100 µL de medio y 100 µL de la suspensión
bacteriana B; el control D se preparó con 90 µL de medio y 10µL de la suspensión
bacteriana B (control de 10% de crecimiento); y el control U conteniendo 98 µL de
medio y 2µL de la suspensión B (control de 2 % de crecimiento). En los pozos de la
periferia se colocaron 200 µL de agua destilada estéril; la placa se cubrió con su
tapa y se aseguró con cinta tipo masking tape. Para evitar la desecación, la placa se
introdujo en una bolsa de plástico y se incubó 5 días A 37 ºC.
21
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
d) Revelado de la microplaca
Transcurrido el tiempo de incubación, se observó el crecimiento bacteriano en un
microscopio invertido para determinar si en los controles se presentaba suficiente
crecimiento bacteriano. Se adicionaron 20 µL del colorante alamar azul a cada pozo
de ensayo de compuestos y controles. Se permitió la incubación de la microplaca
durante 24 h a 37 °C, y transcurrido este tiempo, los controles del 100% deberán
presentar un color rosa intenso, mientras que los controles del 10 y 2% debieron
permanecer azules.
e) Interpretación
Se realizó la interpretación visual de la placa, considerando la concentración mínima
inhibitoria (MIC) a aquella concentración correspondiente al último pozo que
permaneció azul y cuya intensidad de color fue igual o menor a la obtenida en el
control del 10%.
22
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
NH
NO2
6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Síntesis de (2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol
El compuesto 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a (Figura 5) se obtuvo como
un sólido amarillo con un rendimiento del 64% y p.f. de 210°C (Lit20 pf 208 oC).
NH
NCl
NO24
6
5
77a
3a2´
4´
5´6´
3´
Figura 5: (2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a
El espectro infrarrojo del compuesto 4a mostró la banda de absorción intensa de
estiramiento del enlace N-H en 3322 cm-1 y otra en 1513 cm-1 debida al grupo NO2
(figura 6).
Figura 6. Espectro infrarrojo (IR) del compuesto 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a.
NH
NCl
NO2
23 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
En el espectro de resonancia magnética nuclear de protones del compuesto 4a
mostró una señal ancha en δ 13.42 para el protón del imidazol (NH), en δ 8.9 se
observó una señal triple que integra para un protón y constante de acoplamiento 1.2
Hz que fue asignada al hidrógeno H2’, los hidrógenos H6’ y H4’ dieron señales triples
dobleteadas en δ 8.5 y δ 8.3 respectivamente, ambas con constantes de
acopamiento de 7.8 y 1.2 Hz, mientras que los hidrógenos H5’ y H4 y H7 mostraron
señales triples, una en δ 7.8 y que integra para un protón y constante de
acoplamiento de 7.8 Hz asignada a H5´ y la otra en δ 7.6 que integra para dos
protones y constante de acoplamiento de 8.4 Hz, asignado a H4 y H7 y finalmente el
protón H6 resonó como una señal doble de doble en δ 7.2 con constantes de
acoplamiento de 8.4 y 1.2 Hz (Figura 7).
Figura 7. Espectro de resonancia magnética nuclear de protones (RMN 1H) para 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a.
H1
H2’ H4’ H6’ H5’ H6
H7, H4
NH
NCl
H4
H6
H7
´H2 NO2
H5´´H6
H4´
24 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
En el espectro de resonancia magnética nuclear de carbono trece del compuesto 4a
mostró las siguientes señales en δ: 151.1, 149.0, 133.2, 131.9, 131.4, 125.2, 123.6,
121.6 (Figura 8).
Figura 8. Espectro de resonancia magnética nuclear de 13C para 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a.
En el espectro de masas MS (m/z, %), se observaron los principales fragmentos
siguientes: 275 (M++2, 33), 273 (M+, 100), 243 (M+-NO, 4), 227 (M+-NO2, 45), 192
(M+-NO2 y Cl, 30) (Figura 9).
Figura 9. Espectro de masas (EM) (m/z, %) para 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a.
C2’
C5’
C4’ C7, C4
C6’ C-NO2
C6 NH
NCl
NO24
6
5
77a
3a2´
4´
5´6´
3´
2 1´
NH
NCl
NO2
25 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
Síntesis del 1-[(tien-2’-il) metil]-2-(tien-2’-il) bencimidazol
El compuesto 1-[(tien-2’-il) metil]-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b (figura 10) se obtuvo
como sólido amorfo café y 23% de rendimiento; p.f. 120-123 ºC (Lit47.pf 124-128 °C).
N
N S
S
4
5
67
7a
3a
3"
4"
5"
3´4´
5´
Figura 10: 1-[(tien-2’-il) metil]-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b
En espectroscopia IR del compuesto 5b mostró una banda de absorción en 1611cm-1 para el grupo N=C (Figura 11).
Figura 11. Espectro infrarrojo del compuesto 1-(Tien-2’-il) metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b
26
C=N N
N S
S
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
H4
H6, H7, H5, H4’
H5’, H3’ H5” H4”, H3”
CH2-N
En espectroscopia RMN 1H se observan las siguientes señales : una señal múltiple
en δ: 7.83 que integra para un protón atribuida a H4, otra señal múltiple en δ: 7.50
que integra para dos protones siendo asignadas a H5’ y H3’, una señal múltiple en δ:
7.29 que integra para cuatro protones siendo atribuidas a H6, H7, H5 y H4’, una señal
doble de doble en δ: 7.14 J=5 y 3.6 Hz, que integra para un protón que fue asignada
a H5’’, otra señal doble de doble en δ: 7.94 J=5 y 3.6 Hz, que integra para un protón y
fue atribuida a H3’’, una señal múltiple en δ: 6.86 que integra para un protón y siendo
asignada a H4’’, y una señal simple en δ: 5.70 que integra para dos protones
atribuidos a CH2 (Figura 12).
Figura 12. Espectro de resonancia magnética nuclear de protones (RMN 1H) para 1-(Tien-2’-il) metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b
En espectroscopia RMN 13C el compuesto 5b mostró 16 señales δ: 147.5, 142.7,
138.7, 135.8, 133.8, 131.6, 128.9, 128.1, 127.9, 127.2, 125.5, 125.4, 123.3, 123.0,
119.8, 44.1 (Figura 13).
Figura 13. Espectro de resonancia magnética nuclear de 13C para 1-(tien-2’-il) metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b
C=N
C-ipso
CH2
C 4,5,7,3’,4’,5’,3”,4”,5” N
N S
S
4 5 6
7 7 a
3 a
3 " 4 "
5 "
3 ́ 4 ́
5 ́
27
N
N S
S
4 5 6
7 7 a
3 a
3 " 4 "
5 "
3 ́ 4 ́
5 ́
C = N
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
Síntesis del 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol
Se obtuvo 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6) cloro bencimidazol 5a (figura 14) como un
sólido-viscoso guinda, Rf 0.4186 Rendimiento 18 % (0.03g).
N
N
CH2
CH3
Cl
NO2
14
45
6
3a
7a7
2'
4'
5'6'
Figura 14. 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6) cloro bencimidazol 5a
En el espectro de resonancia magnética nuclear de protones del compuesto 5a
mostró señales de protones aromáticos y alifáticos. Así, en δ 8.53 se observó una
señal simple que integra para un protón y fue asignada al hidrógeno H2’, mientas que
los hidrógenos H4´ y H6´ dieron señales dobles en δ 8.38 y 8.22 que integran para un
protón respectivamente con una constante de acoplamiento de 8 Hz para H4´ y 7.5
Hz para H6´, el hidrógeno H5’ a δ 7.8 aparece como señal triple e integra para un
protón con una constante de acoplamiento de 8 Hz, el protón H4 a δ 7.73 aparece
como singulete y la señal doble de H6 se desplaza a δ 7.68 con una constante de
acoplamiento de 8.5 Hz, por otro lado el protón H7 muestra una señal doble a δ 7.3
que integra para un protón y una constante de acoplamiento de 8.5 Hz. A campo alto
se observaron los protones alifáticos. En δ: 4.1 se observó una señal triple que
integra para 2 protones correspondientes al CH2 que se encuentra unido en el
imidazol y que tiene una constante de acoplamiento de 10 y 5 Hz, los 28 protones de
los 14 metilenos (CH2) de la cadena hidrocarbonada resonaron en δ: 1.2 y como una
señal múltiple, mientras que el metilo (CH3) se mostró a δ: 0.8 como una señal triple
que integra para 3 protones y tiene una constante de acoplamiento de 5 Hz (Figura
15).
28 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
Figura 15. Espectro de resonancia magnética nuclear de protones (RMN 1H) para 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6) cloro bencimidazol 5a.
En el espectro de resonancia magnética nuclear de carbono trece del compuesto 5a
mostró las siguientes señales en δ: 135.746,131.053, 124.936, 124.158, 123.504,
119.317, 112.998, 70.7895, 33. 0053, 31.5519, 30.2240, 29.3153, 29.2623, 29.1694,
28.9734, 28.9366, 28.9191, 28.6952, 26.1762, 25.9672, 25.3477, 22. 5336, 14.4841
(Figura 16).
Figura 16. Espectro de resonancia magnética nuclear de 13C para 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6) cloro bencimidazol 5a
3.63.84.04.24.44.64.85.05.25.45.65.86.06.26.46.66.87.07.27.47.67.88.08.28.48.6f1 (ppm)
4.97
8.80
6.13
13.03
6.23
7.06
5.19
5.11
4.95
4.38
3.97
3.98
3.99
4.01
4.02
4.12
4.13
4.15
4.26
4.31
4.32
4.34
6.64
6.85
7.19
7.29
7.30
7.32
7.37
7.39
7.69
7.70
7.73
7.83
7.85
7.86
8.22
8.24
8.36
8.38
8.54
0.60.81.01.21.41.6f1 (ppm)
35.77
38.84
4.80
247.5
4
273.5
9
11.21
17.09
0.79
0.80
0.81
0.82
1.06
1.13
1.15
1.16
1.19
1.25
H2'
H4' H6'
H5'
H4, H6
H7
28H (14, CH2)
3H (CH3)
2H (CH2-N)
N
N
CH2
CH3
Cl
NO2
14
45
6
3a
7a7
2'
4'
5'6'
102030405060708090100110120130140150160170f1 (ppm)
14.30
14.48
22.53
25.34
25.96
28.97
29.16
29.35
29.41
29.44
29.47
29.51
29.57
31.75
33.00
36.97
39.63
39.80
39.97
40.14
40.30
60.14
61.16
70.78
113.0
0
119.2
712
3.48
124.1
412
4.92
127.2
513
1.03
135.7
2
143.7
0
148.3
7
170.6
4
115120125130135140145150f1 (ppm)
113.0
0
119.2
7
123.4
812
4.14
124.9
2
127.2
5
131.0
3
135.7
2
143.7
0
148.3
7
152.3
7
C=N C3-NO2 C5-Cl
C6´ C5´ C6 C4 C2´
CH2N
C (28H)
CH3
C4´ C7
N
N
CH2
CH3
Cl
NO2
14
45
6
3a
7a7
2'
4'
5'6'
29 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
En el espectro de masas MS (m/z, %) 461 (M-HCl, 5), 415 (M-HCl+NO2, 4), 240 (M-
C15H31+NO2, 5), 253 (M-NO+C15H31, 20), 55 (C4H7, 100) (Figura 17).
Figura 17. Espectro de masas (EM) (m/z, %) para 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6) cloro bencimidazol 5a
Síntesis de 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol
El compuesto 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b (figura 18) se obtiene como un líquido viscoso marrón con un rendimiento del 25%.
NH
NCl
N
3´ 4´
5´
6´
45
6
77a
3a
Figura 18. 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b
30
154-43( )
211-15(CH3)
211-29( )
211-57 ( )
m-NO-C15H31 m-C15H31
m-HCl-NO2
m-HCl
m- C15H31 NO2
N
N
CH2
CH3
ClNO2
14
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
En el espectro de resonancia magnética nuclear de protón del compuesto 4b mostró
una señal ancha en δ 13.2 para el protón del imidazol (NH), en δ 8.7 se observó una
señal múltiple que integra para un protón que fue asignada al hidrógeno H3’, el
hidrógenos H4’ dio una señal doble a δ 8.5 con una constante de acoplamiento de
8Hz y a δ 8.0 se desplaza una señal triple que integra para un protón asignada a H6´
con una constante de acoplamiento de 8 Hz. Los protones H4 y H6 resonaron como
una señal múltiple que integran para un protón y se encuentran desplazados a δ 7.8
y δ 7.7 respectivamente. A δ 7.5 se desplaza una señal triple que integra para un
protón, con una constante de acoplamiento de 6 Hz que corresponde a H5’. El protón
H7 se encuentra desplazado a δ 7.3 con una señal doble que integra para un protón
y una constante de acoplamiento de 8 Hz (Figura 19).
Figura 19. Espectro de resonancia magnética nuclear de protones (RMN 1H) para 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b
En el espectro de resonancia magnética nuclear de carbono trece del compuesto 4b
mostró las siguientes señales en δ:167, 166.5, 144.5, 144, 141, 129.5, 129, 128.6,
128.3, 125.1 (figura 20).
Figura 20. Espectro de resonancia magnética nuclear de 13C para 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro
bencimidazol 4b
31
H3´ H4´ H6´
H4 H6
H5´ H7
H3´
NH
NCl
N
3´ 4´
5´
6´
45
6
77a
3a
C3´ C4´ C6´
C4
C6
C5
C7
NH
NCl
N
3´ 4´
5´
6´
45
6
77a
3a
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
Evaluación de la actividad
Tabla 1.- Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) de los bencimidazoles 5a, 5b, 4a y 4b frente a la cepa de referencia y cepas mono-resistentes de Mycobacterium tuberculosis.
Cepa de referencia de M. tuberculosis (1MtbH37Rv); Etambutol-resistente (2Mtb-ER); Isoniazida-
resistente (3Mtb-IR); Rifampicina-resistente (4Mtb-RR); Estreptomicina-resistente (5Mtb-SR)
La evaluación antimicobacteriana de los compuestos 5a, 5b, 4a y 4b se realizó
usando el microensayo fluorométrico de alamar azul. El alamar azul es un indicador
de óxido-reducción que bajo un ambiente de crecimiento bacteriano cambia de su
forma oxidada (color azul) a su forma reducida (color rosa). Se analizaron diferentes
concentraciones de cada uno de los compuestos (50, 25, 12.5, 6.25 y 3.125 µg/mL)
frente a la cepa de referencia de M. tuberculosis MtbH37Rv y frente a cepas
monoresistentes para los fármacos de primera línea (etambutol, isoniazida,
rifampicina, estreptomicina). Los resultados obtenidos muestran que el compuesto
4a es el que presenta una mayor actividad antimicobacteriana ya que las CMI se
encontraron entre 3.125 frente a la cepa de referencia MtbH37Rv y frente a la cepa
estreptomicina resistente, mientras que para las demás cepas analizadas
presentaron una CMI de 6.25 µg/mL. El compuesto 4b presentó una mejor actividad
antimicobacteriana frente a las cepas isoniazida y estreptomicina resistentes (3.125
µg/mL), seguida por la cepa de referencia 12.5 µg/mL).
Por el contrario, los compuestos con menor actividad antimicobacteriana fueron el 5a y 5b, cuyas MICs para todas las cepas fueron superiores a 50 µg/mL (Tabla 1).
Cepas M-tb MIC µg/mL
del compuesto 5a MIC µg/mL
del compuesto 5b MIC µg/mL
del compuesto 4a MIC µg/mL
del compuesto 4b 1MtbH37-Rv >50 >50 3.125 12.5
2Mtb-ER >50 >50 6.25 50
3Mtb-IR >50 >50 6.25 3.125
4Mtb-RR >50 >50 6.25 50
5Mtb-SR >50 >50 3.125 3.125
32 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
Discusión de resultados
Diversas publicaciones han reportado que el núcleo bencimidazol tiene un amplio
potencial terapéutico, se considera un sistema heterocíclico debido a su amplio
rango de compuestos activos con propiedades antiparásitarias, anticonvulsionantes,
analgésicas, antihistamínicas, antihipertensivas, antivirales, antifúngicas y
antimicrobianas.52,56 El núcleo bencimidazol puede ser llamado “llave maestra” ya
que a partir de éste se pueden generar una gran cantidad de compuestos con acción
hacia diferentes blancos. En este trabajo se reporta la actividad antimicobacteriana
de 4 compuestos derivados del bencimidazol. Los resultados señalan que las
modificaciones químicas en el núcleo bencimidazol influyen en la actividad
antimicobacteriana de los compuestos y sugieren que la potencia antimicobacteriana
depende de las propiedades hidrofílicas e hidrofóbicas. Para el caso de los
compuestos que tienen las cadenas hidrofóbicas (5a y 5b) se demostró que la
disminución en la polaridad de estos compuestos causó una disminución en su
actividad antimicobacteriana. En cambio para los compuestos polares (4a y 4b) se
observa un aumento de la actividad antimicobacteriana. El compuesto 4a presenta
una mayor polaridad debido al grupo nitro que contiene en su estructura y es
probable que el grupo nitro este participando en la actividad contra la micobacteria
ya que generalmente los compuestos polares presentan mayor afinidad por los
transportadores de membrana. En conjunto, los efectos inhibitorios de los
compuestos 4a, 4b, 5a y 5b sobre el crecimiento micobacteriano, puede deberse a
que estas moléculas se unan a un sitio celular de enlace específico llamado
receptor45, ya que los receptores de medicamentos son con frecuencia de naturaleza
proteica, y constituyen una ruta de entrada de pequeñas moléculas hidrofílicas y las
moléculas hidrofóbicas se disuelven en la fase lipídica50, 51. Algunos receptores son
moléculas polares y forman parte de las membranas celulares, mientras que otros
están en el citoplasma, los ácidos nucleicos, en particular el ADN, también actúan
como receptores para ciertas clases de sustancias45. Sin embargo, no existen
evidencias directas de que Mycobacterium tuberculosis use de manera selectiva
receptores específicos que le confieran ventajas en su supervivencia intracelular.46
33
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
El blanco celular de estos compuestos queda aún por estudiarse, aunque los
primeros reportes referentes al núcleo bencimidazol señalan que por analogía con
las purinas pudieran tener un efecto sobre los ácidos nucleicos, en el caso de los
derivados se requiere estudios relacionados a la molécula en conjunto, ya que los
sustituyentes pueden conferir diversas actividades biológicas. Un estudio realizado
por Kazimierczuk y col., señalan que la actividad observada sobre diferentes cepas
de micobacterias depende del sustituyente o de la longitud del sustituyente.57 En
este trabajo se encontró que la adición de una cadena hidrocarbonada en la posición
1 al bencimidazol 4a disminuyó su polaridad y junto con el compuesto 5a que es
hidrofóbico, mostraron una disminución de la actividad contra Mycobacterium
tuberculosis, estos resultados sugieren que la hidrofobicidad de los compuestos
tiene un efecto negativo sobre la actividad biológica.
El compuesto 4a mostro buena actividad contra la cepa MbH37-Rv y las cepas
mono-resistentes H37-Rv SR con una CMI de 3.125 µg/mL y H37-Rv ER, H37-Rv IR, H37-Rv RR con una CMI de 6.25 µg/mL. El compuesto 4b es un compuesto
polar, por la piridina sustituida en C-2 del bencimidazol 4b que obtuvo una CMI de
12.5 µg/mL para la cepa MbH37-Rv, además de que inhibió a las cepas H37-Rv IR, H37-Rv SR a una CMI de 3.125 µg/mL, la actividad de estos compuestos frente a
las cepas de resistencia de M. tuberculosis sugiere que ambos compuestos tienen la
potencialidad de ser usados en tratamientos en donde se presenta multidrogo-
resistencia.
La actividad biológica positiva observada en los diferentes compuestos analizados
permite continuar con estudios sobre su citotoxicidad, su potencial capacidad para
eliminar micobacterias intracelulares, su potencial efecto in vivo y a esclarecer el
blanco molecular de estos compuestos.
34 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
7.- CONCLUSIONES
Se sintetizó el compuesto 2-(3’-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a como
una mezcla de tautómeros en equilibrio dinámico
Se sintetizó el compuesto 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b como una
mezcla de tautómeros en equilibrio dinámico
Se sintetizó el compuesto 1-hexadecil-2-(3’-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol
5a como una mezcla de regioisómeros.
Se sintetizó el 1-[(Tien-2’-il) metil]-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b como una
mezcla de regioisómeros
Se sintetizaron cuatro bencimidazoles: dos 2,5(6) disustituidos y dos 1, 2, 5(6)
trisustituidos y se probaron su actividad antimicobacteriana en las cepas de
referencia MtbH37Rv y monorresistentes, mostrando que la sustitución en 1
disminuyo la actividad biológica.
Los resultados de actividad biológica indican que las modificaciones químicas
influyen en la actividad antimicobacteriana de los compuestos y sugieren que
la potencia antimicobacteriana depende de las propiedades hidrofílicas e
hidrofóbicas de los compuestos, ya que al disminuir la polaridad de los
compuestos también se disminuyó su actividad antimicobacteriana.
35
QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL
“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”
8.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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