Cultivo de frijol (Phaseolus vulgaris L.) acondicionado con nanopartículas de TiO2: efecto en las comunidades microbianas de su rizósfera

e implicaciones socio-ambientales

M en C. Gabriela Medina Pérez

Yates, J. T., Jr. et al., J. Phys. Chem. B 2005, 109. 6061

1.Introducción

Antecedentes/Estado del arte

Medina-Pérez, G. et al., 2019. Nanotechnology in crop protection: Status and future trends. In Nano-BiopesticidesToday and Future Perspectives(pp. 17-45). Academic Press)

Fig 1. Aplicaciones de la nanotecnología en la agricultura

FBN

18,000 especies de leguminosas

El cultivo de frijol,

Importancia de las leguminosas

Proteínas

Carbohidratos

Vitaminas

Grasas

Fibra

N

1.06 millones de toneladas

(FIRA, 2016)

2. Antecedentes

1.06 millones de toneladas de frijol en 2016 (FIRA,2016)

Representa el 36% de la ingesta de proteínas

Fig 2. Distribución geográfica del cultivo de frijol en México. (Soto, 2003)

En 2012 se publicaron los “Lineamientos para regulaciones sobre nanotecnologías para impulsar la

competitividad y proteger al medio ambiente, la salud y la seguridad de los consumidores”.

NMX-R-10867-SCFI-2014 “Nanotecnologías-Caracterización de nanotubos de carbono de una capa(NTCUC)

mediante espectroscopia de fotoluminiscencia en el infrarrojo cercano (EFL-IRC)”

NMX-R-10929-SCFI-2014 “Nanotecnologías-Caracterización de muestras de nanotubos de carbono de

múltiples capas (NTCMC)”.

NMX-R-27687-SCFI-2014 “Nanotecnologías-Terminología y definiciones para nano-objetos-Nanopartícula,

nanofibra y nanoplaca”.

NMX-R-80004-1-SCFI-2014 “Nanotecnologías-Vocabulario-Parte 1: Conceptos básicos “

Legislación en México

NMX-R-80004-3-SCFI-2014 “Nanotecnologías-Vocabulario-Parte 3: Nano-objetos de carbono”

NMX-R.80004-5-SCFI-2015 “Nanotecnologías-Vocabulario-Parte 5: Interfaz nano/bio”

La necesidad de medir los efectos socio-ambientales de la aplicación de nanopartículas de titanio en cultivo de frijol.

González y Torres (2014), proponen

que la sustentabilidad agrícola está

en función de factores como las

técnicas de cultivo y los

componentes de dichas técnicas

que pueden ser sociales, naturales

y económicos.

3. Objetivo general

Determinar el efecto de nanopartículas de TiO2 sobre las comunidades

microbianas de la rizósfera de frijol común, cultivado en condiciones de

invernadero y sobre los indicadores de sustentabilidad de los sistemas de

producción agrícola.

3.1 Objetivos específicos

• Cultivar frijol común en un suelo agrícola acondicionado con nanopartículas de TiO2, bajo

condiciones de invernadero.

• Caracterizar el crecimiento y desarrollo del cultivo con base en sus etapas fenológicas.

• Evaluar las interacciones simbióticas frijol-rizobias y los componentes de rendimiento del cultivo.

• Extraer ADN de suelo de la rizosfera de frijol y analizar la diversidad y abundancia de sus

comunidades bacterianas.

• Diseñar un indicador que permita estimar las implicaciones socio-ambientales a partir de los

resultados experimentales publicados en revistas JCR

4. Hipótesis

Las NP’s de TiO2 afectan las comunidades microbianas de la rizosfera de frijol

común, sus componentes de rendimiento y los indicadores de sustentabilidad

de los sistemas de producción agrícola.

5. Justificación

El interés de empresas y del Estado en la nanotecnología agrícola está limitado por la

incertidumbre ante los efectos aún desconocidos, toda vez que se trata de la producción de

alimentos, una vía rápida para consumir nanomateriales.

Así mismo, la inclusión de productos de dimensiones nanométricas en el mercado de

agroquímicos e insumos agrícolas es una realidad que genera preocupación sobre el potencial

daño al medio ambiente y a la salud pública, aún a pesar de que algunos nanomateriales

incrementan significativamente el crecimiento y desarrollo de los cultivos, así como sus

componentes de rendimiento.

Por lo anterior, es necesario documentar y evaluar las aplicaciones nanotecnológicas que se

están comercializando en el sector agrícola mexicano, a fin de contribuir con el avance

tecnológico y el desarrollo sustentable.

6. Metodología

Se planteó un proyecto de investigación integrado por dos etapas:

1) Investigación experimental

Metodología cuantitativa mediante el establecimiento del cultivo de frijol acondicionado con TiO2-NPs en

condiciones de invernadero. Se midió la respuesta de las plantas cultivadas durante un periodo de 90

días, así como el comportamiento de las poblaciones de microorganismos del suelo rizosférico y no

rizosférico.

2) Construcción del indicador de sustentabilidad

Se construirá un indicador basado en la información estadística y experimental recabada en

publicaciones en JCR. Se utilizará la metodología ambiental Presión-Estado-Respuesta

Fig. 3. Micrografía de nanopartículas de TiO2 por TEM.

Fig. 4. Micrografía de nanopartículas de TiO2 por SEM.

6.1 Investigación experimental

6.1.2 Caracterización de las nanopartículas de dióxido de titanio

6.1.3 Características de las semillas

Cultivo: Frijol

Variedad: Pinto Saltillo

Color de la semilla: Crema claro con pintas café claro

Lugar de producción: Emiliano Zapata, Arteaga-Coahuila

Categoría: Básica

Ciclo de producción: PV-2014

Factor de calidad

Semilla pura 98%

Material inerte 2.0%

Germinación 85%

Humedad <12%

Sin tratamiento químico

6.1.2 Muestreo del suelo

P3

P1

P2

Fig. 5 Localización del sitio de muestreo de suelo.

Áreas de cultivo de rotación (alfalfa-maíz-

cebada) del Instituto de Ciencias

Agropecuarias de la Universidad Autónoma

del Estado de Hidalgo, en el estado de

Hidalgo, México; coordenadas: latitud norte

20 ° 04 '53' ', latitud oeste 98 ° 22' 07 'del

meridiano de Greenwich.

El suelo se muestreó en tres sitios

mediante el establecimiento de parcelas

(P1, P2 y P3).

Se muestreó la capa de 0 a 20 cm de

profundidad.

P3

Empacar las columnas

Suelo muestreado se seco en

invernadero y se tamizó en malla de

0.5 cm

Preincubación(5d, 50% CRA)

Análisis físico-

químicos

Adición y homogenización

de NPs

Ralear

(12d)

T1: Suelo + Pv + TiO2-0.15g kg-1 peso seco

T2: Suelo + Pv + TiO2-0.30g kg-1 peso seco

T3: Suelo + TiO2-0.15 kg-1 peso seco

T4: Suelo + TiO2-0.30 kg-1 peso seco

T5: Suelo + Pv

T6: Suelo

6.1.3 Diseño y montaje del experimento en el invernadero.

Parámetro Método

pH Potenciométrico Thomas, 1996

Conductividad electrolítica

(CE)Conductimétrico Rhoades et al., 1989

NO3, NO2 y NH4+ SKALAR Mulvaney, 1996

Textura Métodos de Bouyoucos Gee y Bauder, 1986

CRA Método gravimétrico

Humedad Método gravimétrico

Tabla 1. Técnicas de caracterización de suelo que se emplearon en esta investigación.

6.1. 4 Análisis fisicoquímicos de suelo

T1 T3T2 T4 T6

Día 0

Día 45

Día 90

× 9 × 9× 9 × 9 × 9

T5

× 9

Figura 6. Acomodo en el invernadero

Extracción por tres técnicas

Muestreo de suelo

de las columnas

Muestreo para extracción de

ADN

(Conservación a -20°C)

Análisis físico-químicos

Temperatura ambiente

Profundidad 0-15 cm

No rizosférico

Rizosférico

Muestreo de plantas

6.1.5 Toma de muestras y mediciones

Actividad fotosintetica (SPAD)

Biomasa (peso seco-peso húmedo)

Crecimiento de estructuras

Rendimientos

Concentración de titanio por ICP-MS

Microscopia de tejidos por SEM

Concentración de titanio ICP-MS

0.5 g de muestra de suelo

Eliminación de la materia orgánica con pirofosfato

Eliminación del exceso de pirofosfato

1. Método de lisis

(Valenzuela-Encinas et al. 2008)

2. Método de lisis enzimático

(Sambrook y Russell, 2001)

3. Método de lisis

(Winston y Hofman 1987)

Purificación y precipitación del DNA

Pool del DNA metagenómico

Verificaciónde la calidad del DNA

6.1.6 Obtención de ADN

Construcción de bibliotecas

del gen 16SrDNA

Secuenciación

(ILLUMINA)

6.1.7 Análisis bioinformático

Se usará el programa estadístico QIIME de acuerdo a un único código de barras (Caporaso et al.,

2010).

6.1.8 Análisis estadístico

Se realizará el análisis de varianza (ANOVA) y comparación de medias con Tukey (P <0.05) para

determinar si existen diferencias significativas entre los tratamientos en las mediciones fisicoquímicas

de suelo, plantas y abundancias microbianas (SPSS 20.0. IBM).

Se realizarán estimaciones, evaluando tres índices generales:

1) Calidad de suelo,

2) Calidad y rentabilidad del cultivo, respecto al valor económico,

3) Influencia de los cultivos de frijol, con y sin aplicación de nanopartículas, en la calidad

de vida de los agricultores

Universo de estudio: Zona productiva de frijol en Rio Grande, Estado de Zacatecas

Del 2000-2018

6. 2 Construcción del indicador de sustentabilidad

6.2.1 Selección de índices e indicadores

Fase 1. Comparación de las características

químicas, físicas y microbiológicas de suelo

con y sin adición de nanoparticulas de

dióxido de titanio

Fase 2. Estimación de los rendimientos de la

producción de frijol, mediante la integración

de los datos obtenidos en artículos JCR y

experimentalmente

Fase 3. Cambios en la calidad de vida de los

agricultores de la zona de estudio (Estado

de Zacatecas) mediante el uso de

indicadores seleccionados basados en la

estadística estatales proporcionadas por

INEGI.

a) Implementación de modelo estadístico

para ensayos experimentales

b) Obtención de resultados de los indicadores del

índice i) calidad de suelo. Construcción de matriz

de datos

c) Análisis estadisticos. Prueba de

Hipótesis.

a) Aplicación de los indicadores del

índice ii) Calidad y rentabilidad del

cultivo

Resultados cuantitativos y cualitativos

calificados y ponderados según rango

establecido (1,5 y 10)

a) Aplicación de entrevista

semiestructurada a pequeños

productores de frijol de la zona

seleccionada de estudio.

b) Aplicación de indicadores de el índice iii)

Calidad de vida.

Fase 4. Determinación de la sustentabilidad agrícola del cultivo de frijol acondicionado con nanoparticulas

Ponderación de los resultados estandarizados.

(Sarandón et al., 2014)

6.3.2 Determinación de la sustentabilidad agrícola de los cultivos de frijol

adicionados con nanoparticulas de titanio.

Estos indicadores se ponderarán asignando un factor de ponderación “C” (Cuadro 1, Tabla 2),

evaluándolos bajo los criterios de (i) reversibilidad y (ii) dependencia hacia otros indicadores (Sarandón

et al., 2014).

Tabla 2. Rangos porcentuales para la evaluación de la sustentabilidad

agrícola (Bell y Morse, 2008)

Porcentajes Observaciones

0 – 50Insustentable Declive de los indicadores de sustentabilidad a

través del tiempo.

51 – 85

Poco sustentable Los indicadores de sustentabilidad se mantienen

constantes a través del tiempo.

86 – 100Sustentable Incremento en los indicadores sustentabilidad a

través del tiempo.

7. Resultados investigación experimental

Figura 7. Micrografía por SEM de corte longitudinal de tallo de planta de frijol. a) control, b) TiO2-NP (0.30 g kg-1).

a b

Figura 8. Micrografía por SEM de corte longitudinal de raíz de planta de frijol. a) control, b) TiO2-NP (0.30 g kg-1).

a b

Figura 9. Micrografía por SEM de corte transversal de nódulo de raíz de plantas de frijol. a) control,

b) TiO2-NP (0.30 g kg-1).

a b

Figura 10. Micrografía por SEM de superficie externa de raíces secundarias de planta de frijol tratadas con TiO2-NP (0.30 g

kg-1. a) 170 ×; b) 9500 ×.

a

b

Figura 11. Micrografía por SEM de superficie externa de raíces secundarias de planta de frijol tratadas con TiO2-NP (0.30 g

kg-1). a) 75 ×; b) 2000 ×.

a

b

Tabla 3. Caracterización fisicoquímica de suelo utilizado en el experimento

pHE.C

(dS m-1)OM (%)

Nitrógeno total

(%)

Nitrógeno inorgánico

(mg.kg-1)

7.54 ± 0.20 0.53 ± 0.18 3.61 ± 0.18 0.18 ± 0.01 21.27 ± 11.47

P (mg.kg-1) K (mg.kg-1) Na (mg.kg-1) Ca (mg.kg-1) Mg (mg.kg-1)

Densidad

aparente

(g cm-3)

23.25 ± 7.4 506 ± 91.8 422.66 ± 55.1 3050 ± 63.5 1448 ± 40.6 1.29 ± 0.1

Arena (%) Limo (%) Arcilla (%) Textura Color

31.20 ± 1.4 41.96 ± 1.1 26.5 ± 2 FRANCO1 O YR 5/3 Café

Figura 12. ADN extraído y amplificaciones del fragmento 16SrDNA de ADN suelo de los diferentes tratamientos. a) DNA purificado en

columna b) amplificaciones del fragmento 16SrDNA sin anidación, c) amplificaciones del fragmento 16SrDNA con anidación

a

b c

Fig. 13. Abundancia relativa (%)

de los filos bacterianos y de los 50

géneros más abundantes en a)

suelo no modificado, b) suelo

modificado con 150 mg de TiO2

kg-1 suelo seco) 300 mg de TiO2

kg-1 suelo seco. Suelo no

cultivado con plantas de frijol

(Phaseolus vulgaris L.) en el día 0

(bulk-d0), el día 45 (bulk-d45) y

el día 90 (bulk-d90), suelo no

rizosférico en el día 0 (nrhi-d0),

día 45 (nrhi-d45) y día 90 (nrhi-

d90) y suelo de rizósfera de

plantas de frijol en el día 0 (rhi-

d0), día 45 (rhi-d45) y día 90 (rhi-

d90)

Fig. 14. Análisis de

componentes principales

(PCA) con la abundancia

relativa de los filos

bacterianos y en a) suelo no

cultivado con plantas de frijol

(Phaseolus vulgaris L.) o

suelo en masa, b) suelo no

rizosférico o c) rizosférico de

plantas de frijol. Suelo no

modificado ( ), suelo

modificado con 150 mg de

TiO2 kg-1 de suelo seco y ( )

y 300 mg de TiO2 kg-1 de

suelo seco ( ).

Fig. 15. Análisis de componentes

principales (PCA) con la abundancia

relativa de los 50 géneros

bacterianos más abundantes y en a)

suelo no cultivado con plantas de

frijol (Phaseolus vulgaris L.) o suelo

en masa, b) no rizósfico o c)

Rizosfera de suelo de frijol. Suelo no

modificado ( ), suelo modificado

con 150 mg de TiO2 kg-1 de suelo

seco y ( ) y 300 mg de TiO2 kg-1

de suelo seco ( ).

Conclusiones preliminares

Las NPs de TiO2 no modificaron significativamente la biomasa de las plantas de frijol común (número

de nódulos, peso seco de parte aérea o raíz, longitud de parte aérea o raíz y rendimiento), ni la

actividad fotosintética (unidades SPAD).

Las NPs de TiO2 se adsorbieron en la superficie de la raíz pero no causaron alteraciones estructurales

en el tejido.

Los tallos de plantas de frijol tratadas con NPs de TiO2 no presentan microorganismos endófitos.

El nivel de aplicación de nTiO2 no alteró la comunidad del phylum bacteriano en el suelo

no modificado, no rizosférico y rizosférico.

El tiempo de exposición tuvo un efecto significativo, en el suelo no rizosférico y rizosférico.

El suelo rizosférico se separó claramente del suelo no rizosférico y en masa considerando

los filos bacterianos, pero más aún considerando los 50 géneros bacterianos más

abundantes.

Estos hallazgos deben considerarse en relación con el uso, eliminación o aplicación de

TiO2 en suelos agrícolas, especialmente en estudios a largo plazo.

2015-2 2016-1 2016-2 2017-1 2017-2 2018-1 2018-2 2019-1

1 2 3 4 5 6 7 8

Actividadessep-

oct

nov-

dic

ene-

feb

mar-

abr

may-

jun

jul-

agos

sep-

oct

nov-

dic

ene-

feb

mar-

abr

may-

jun

jul-

agos

sep-

oct

nov-

dic

ene-

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may-

jun

jul-

agos

sep-

oct

nov-

dic

ene-

feb

mar-

abr

may-

jun

jul-

agos

Clases en diferentes

instituciones

Revisión bibliográfica

Preparación protocolo

Reuniones de trabajo para

revisar proyecto

Predoctoral

Búsqueda de material

bibliográfico

Investigación y recopilación de

datos de campo

Análisis de información

recopilada

Reporte del análisis

Experimentación

Análisis de resultados

Análisis datos sociales

Elaboración de artículos

Redacción de tesis

Trabajo pendiente:

• Análisis de concentración de titanio en plantas de frijol y suelo.

• EDS, para asegurar las observaciones de microscopia.

• Extracción de DNA bacteriano de plantas y semillas de frijol (endófitos).

• Trabajo con la base de datos para la construcción del indicador

• Análisis del metaboloma

Medina-Pérez, G., Fernández-Luqueño, F., Vazquez-Nuñez, E., López-Valdez, F., Prieto-Mendez, J., Madariaga-Navarrete,

A., & Miranda-Arámbula, M. (2019). Remediating Polluted Soils Using Nanotechnologies: Environmental Benefits and

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Medina-Pérez, G., & Fernández-Luqueño, F. Nanotoxicidad: retos y oportunidades Nanotoxicity: Challenges and

opportunities.

Medina-Pérez, G., Fernández-Luqueño, F., Trejo-Téllez, L. I., López-Valdez, F., & Pampillón-González, L. (2018). Growth

and development of common bean (Phaseolus

vulgaris L.) var. pinto Saltillo exposed to iron, titanium, and zinc oxide nanoparticles in an agricultural soil. Appl Ecol

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Book chapters

Gutiérrez-Ramírez, R., Fernández-Luqueño, F., Medina-Pérez, G., Pérez-Hernández, H., López-Valdez, F., Vázquez-

Núñez, E., ... & Inchauregi, V. U. (2018). Agronanobiotechnologies to Improve the Water Quality in Irrigation Systems. In

Agricultural Nanobiotechnology (pp. 141-157). Springer, Cham.

Fernández-Luqueño, F., Medina-Pérez, G., López-Valdez, F., Gutiérrez-Ramírez, R., Campos-Montiel, R. G., Vázquez-

Núñez, E., ... & Madariaga-Navarrete, A. (2018). Use of Agronanobiotechnology in the Agro-Food Industry to Preserve

Environmental Health and Improve the Welfare of Farmers. In Agricultural Nanobiotechnology (pp. 3-16). Springer,

Cham.

Medina-Pérez, G., Fernández-Luqueño, F., Campos-Montiel, R. G., López-Valdez, F., Vázquez-Núñez, E., Pérez-

Hernández, H., ... & Zavala-Cortés, A. (2018). Effects of Nanoparticles on Plants, Earthworms, and Microorganisms. In

Agricultural Nanobiotechnology (pp. 161-181). Springer, Cham.

Publicaciones en congreso

“Cultivo de frijol, maíz y girasol en suelo agrícola acondicionado con nanopartículas de TiO2 y ZnO”, Gabriela Medina-

Pérez, Fabián Fernández-Luqueño, Fernando López-Valdez, Oscar Enrique Del Razo-Rodríguez, Isaac Almaraz-Buendía

y Rafael Germán Campos-Montiel. International Symposium on AgroBio NanoTechnology, 2017, Saltillo Coahuila-

Mexico

Abundancia de hongos, bacterias, actinomicetos y lombrices en un suelo agrícola contaminado con nanopartículas

de TIO2, ZnO y α-Fe2O3”. Gabriela Medina-Pérez, Fabián Fernández-Luqueño, Fernando López-Valdez, Oscar Enrique

Del Razo-Rodríguez, Isaac AlmarazBuendía y Rafael Germán Campos-Montiel International Symposium on AgroBio

NanoTechnology, 2017 Saltillo Coahuila-Mexico

Resilience of the rhizosphere bacterial communities from common bean plants (Phaseolus vulgaris L.) grown in

agricultural soil contaminated with TiO2 nanoparticles

Gabriela Medina-Pérez1, 5, Yendy E. Navarro-Noya2, Fabián Fernández-Luqueño3*, Claudia L. Ibarra-Sánchez4, Jessica

N Barrera-Cabrera4, Luc Dendooven4 PROXIMO MAYO-2019, BIOVEG CUBA

«La metodología experimental en nanotecnología agrícola llevada a una política pública para la sustentabilidad en

México» 3er Coloquio de estudiantes de posgrado Gestión y políticas de Ciencia, Tecnología e Innovación. Zacatecas,

Zacatecas 25-26 abril, 2018

Medina-Pérez, G., Fernández-Luqueño, F., Campos-Montiel, R. G., Sánchez-López, K. B., Afanador-Barajas, L. N., & Prince,

L. (2019). Nanotechnology in crop protection: Status and future trends. In Nano-Biopesticides Today and Future

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