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INFLUENCIA DEL PROCESADO Y LA DIGESTIÓN IN
VITRO EN LAS PROPIEDADES BIOACTIVAS DE LOS
EXTRACTOS DE HOJA DE OLIVO (VAR. SERRANA)
TRABAJO FINAL DE CARRERA
TITULACIÓN:
INGENIERO AGRÓNOMO
ALUMNO:
JAIME CÁNOVAS DE LA NUEZ
DIRECTORES:
Dr. JOSÉ VICENTE GARCÍA PÉREZ
Dr. JOSÉ ENRIQUE CARRERES MALONDA
DIRECTORA EXPERIMENTAL:
Dña. MARGARITA H. AHMAD QASEM MATEO
Valencia, Diciembre 2011
1
ÍNDICE 1. Introducción 2. Objetivos 3. Materiales y métodos 4. Resultados y discusión 5. Conclusiones
2
INTRODUCCIÓN
3
INTRODUCCIÓN
•España es el mayor productor de aceitunas y de aceite del mundo. •Las hojas de olivo son un subproducto con escaso valor añadido procedente de la elaboración del aceite de oliva y de la poda. •Su uso normalmente está destinado a la alimentación animal y a la quema.
El cultivo del olivo
4
• Las hojas de olivo presentan compuestos polifenólicos con propiedades bioactivas.
• Es necesario procesar las hojas de olivo para obtener extractos ricos en compuestos polifenólicos.
•El procesado puede influir tanto en los costes del proceso como en la composición de los extractos.
Compuestos fenólicos
Oleuropeína
Luteolina
Verbascósido
INTRODUCCIÓN
Hidroxitirosol
5
• La deshidratación previa del material vegetal puede favorecer la liberación de compuestos polifenólicos.
•El secado por aire caliente es una técnica sencilla y rápida.
• La liofilización es una técnica óptima para preservar la calidad pero es muy costosa.
Métodos de deshidratación INTRODUCCIÓN
6
• La extracción convencional es una técnica sencilla pero muy lenta.
• La aplicación de ultrasonidos puede facilitar el intercambio de materia entre sólido y solvente y reducir el tiempo de extracción.
• Es necesario evaluar cómo influye la aplicación de los ultrasonidos en la cinética de extracción y en la composición de los extractos.
Métodos de extracción INTRODUCCIÓN
7
• Para determinar la bioaccesibilidad y biodisponibilidad es necesario realizar una simulación gastrointestinal.
• Durante esta etapa se promueve la degradación y/o formación de nuevos compuestos polifenólicos.
Digestión in vitro INTRODUCCIÓN
8
OBJETIVOS
9
El objetivo general de este trabajo fue contribuir a la mejora de la obtención de extractos naturales a partir de hojas de olivo. Determinar la influencia del procesado en la extracción de compuestos fenólicos. - Deshidratación. - Aplicación de ultrasonidos en el proceso de extracción. Determinar los cambios en la composición de los extractos durante la digestión in vitro. - Cinética de los cambios. - Degradación y/o formación de los compuestos fenólicos.
OBJETIVOS
10
MATERIALES Y MÉTODOS
11
Materia prima
-Hojas de olivo (Olea europea L. var. Serrana).
- Recogidas en el T.M. de Segorbe.
MATERIALES Y MÉTODOS
12
AOAC, procedimiento 934.01
Determinación de la humedad
MATERIALES Y MÉTODOS
Deshidratación
Secado por aire caliente Liofilización
13
70°C-55 min 120°C-12 min 24 h
MATERIALES Y MÉTODOS
Extracción convencional
Molienda 8°C 10 min 5000 rpm
Extracción Centrifugado
Filtrado Almacenamiento
14
30°C Solvente etanol-agua ,80% 24 h 120 rpm
MATERIALES Y MÉTODOS
Equipo de
refrigeración
Depósito-
pulmón
Bomba
Vaso de
vidrio con
camisa
Sonda
ultrasónica
Controlador
Ordenador
15
Extracción asistida por ultrasonidos
MATERIALES Y MÉTODOS
16
Determinación de la potencia aplicada EXTRACCIÓN ASISTIDA POR ULTRASONIDOS
Tiempo (s)
Te
mp
eratu
ra
(°C
)
m Masa de solvente
Cp Calor específico del
solvente
Incremento de
temperatura
respecto al tiempo
dT/dt
( ) dTP W m Cp t
y = 0,0668x + 19,3270 R² = 0,9993
0
5
10
15
20
25
30
35
0 20 40 60 80 100 120 140 160
MATERIALES Y MÉTODOS
SELECCIÓN DE VARIABLES ÓPTIMAS
Amplitud Ø de sonda ultrasónica
Temperatura Tiempo
40 mm 22 mm 14 mm
5 min
10 min
15 min 20 min
25 min
30 min
35 min
40 min
25
30
35
40
45
50
40%
60% 80%
100%
17
EXTRACCIÓN ASISTIDA POR ULTRASONIDOS
MATERIALES Y MÉTODOS
Modelización
tB
tYY
Modelo de Naik
Cinéticas de extracción de compuestos fenólicos
18
Y
B
t
Contenido fenólico en
el equilibrio
Tiempo de extracción
Tiempo necesario
para alcanzar la
mitad del contenido
fenólico en el
equilibrio
EXTRACCIÓN ASISTIDA POR ULTRASONIDOS
Digestión in vitro
Digestión gástrica
Digestión intestinal
-Adición de pepsina
- pH 2
-Temperatura: 37°C
-Adición de pancreatina y sales biliares
- pH 7
-Temperatura: 37°C
MATERIALES Y MÉTODOS
19
Toma de
muestras
1ª h
2ª h
3ª h
4ª h
Propiedades bioactivas MATERIALES Y MÉTODOS
MÉTODO FOLIN-CIOCALTEU
CONTENIDO TOTAL EN COMPUESTOS FENÓLICOS
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE MÉTODO FRAP
MÉTODO TEAC
IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE COMPUESTOS MAYORITARIOS CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC-DAD) ESPECTROMETRÍA DE MASAS (MS-MS)
20
Deshidratación
Hojas de olivo
120°C 70°C Liofilización
Extracción
convencional
Extracción
asistida por
ultrasonidos
POLIFENOLES TOTALES FRAP TEAC HPLC
Digestión in vitro
-Digestión gástrica (1ª y 2ª h)
-Digestión intestinal (3ª y 4ª h)
POLIFENOLES TOTALES FRAP TEAC HPLC
MATERIALES Y MÉTODOS
21
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
22
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Influencia del método de deshidratación
Método de deshidratación Compuestos fenólicos (mg GAE/g m.s.)
Aire caliente 120°C-12 min 66±3a
Aire caliente 70°C-55 min 42±3b
Liofilización-24 h 33±3c
Contenido total en fenoles
Tabla 4.1. Contenido de fenoles totales de los extractos procedentes de hojas de olivo deshidratadas.
23
• Con el secado por aire caliente se obtuvieron extractos con mayor contenido fenólico que con las muestras liofilizadas.
• Conforme aumentó la temperatura de secado los extractos presentaron mayor contenido total en fenoles.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Capacidad antioxidante
Método de deshidratación Capacidad antioxidante (mg TROLOX/g m.s.)
Aire caliente 120°C-12 min 92±7a
Aire caliente 70°C-55 min 87±6a,b
Liofilización-24 h 75±4b
Método de deshidratación Capacidad antioxidante (mg TROLOX/g m.s.)
Aire caliente 120°C-12 min 6,26±0,22a
Aire caliente 70°C-55 min 5,12±0,37a,b
Liofilización-24 h 4,65±0,49b
Tabla 4.2. Capacidad antioxidante (FRAP) de los extractos procedentes de hojas de olivo deshidratadas.
MÉTODO TEAC
Tabla 4.3. Capacidad antioxidante (TEAC) de los extractos procedentes de hojas de olivo deshidratadas.
MÉTODO FRAP
24
INFLUENCIA DEL MÉTODO DE DESHIDRATACIÓN
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Identificación de compuestos bioactivos
Tiempo de retención (min)
Ab
sorb
anci
a (U
A) Los compuestos mayoritarios son
Oleuropeína, verbascósido y luteolina-glucósido
INFLUENCIA DEL MÉTODO DE DESHIDRATACIÓN
Figura 4.1. Cromatograma a 280 nm de extracto de hoja liofilizada.
Tabla 4.4. Tiempos de retención de los compuestos fenólicos presentes en el extracto de hoja de olivo.
25
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cuantificación de compuestos bioactivos
Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
Tratamiento
Co
nce
ntr
ació
n (
mg
/g m
.s.)
120°C 70°C LF
20
30
40
50
60
70
80
Oleuropeína
Verbascósido Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
Tratamiento
Co
nce
ntr
ació
n (
mg
/g m
.s.)
120°C 70°C LF
0
4
8
12
16
20
• Las muestras secadas a 120°C presentaron los mayores contenidos de oleuropeína y verbascósido.
INFLUENCIA DEL MÉTODO DE DESHIDRATACIÓN
Figura 4.2. Media e Intervalos LSD (p < 0,05) para la concentración de oleuropeína (A) y de verbascósido (B).
A
B
26
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Luteolina-glucósido
• La luteolina-glucósido prácticamente no se vio afectada por el método de deshidratación.
• La sensibilidad de los diferentes compuestos fenólicos al estrés ocasionado por la deshidratación es diferente.
INFLUENCIA DEL MÉTODO DE DESHIDRATACIÓN
27
CUANTIFICACIÓN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS
Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
Tratamiento
Con
cen
tració
n (
mg c
om
pu
esto
/ g
m.s
.)
120°C 70°C LF
7
8
9
10
11
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aplicación de ultrasonidos de potencia en el proceso de extracción
Amplitud
Figura 4.3. Evolución del contenido total de compuestos fenólicos de los extractos de hoja de olivo para diferentes amplitudes eléctricas.
Figura 4.4. Evolución de la capacidad antioxidante de los extractos de hoja de olivo para diferentes amplitudes eléctricas.
Selección de variables óptimas Amplitud eléctrica (%) Potencia aplicada (W)
40 13
60 19
80 24
100 28
28
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
SELECCIÓN DE VARIABLES ÓPTIMAS
Diámetro de sonda ultrasónica
Figura 4.7. Evolución del contenido total de compuestos fenólicos de los extractos de hoja de olivo para diferentes diámetros de sonda ultrasónica.
Figura 4.8. Evolución de la capacidad antioxidante de los extractos de hoja de olivo para diferentes diámetros de sonda ultrasónica.
APLICACIÓN DE ULTRASONIDOS DE POTENCIA
Diámetro de sonda ultrasónica (mm) Potencia aplicada (W)
14 28
22 51
40 33
29
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Temperatura de extracción
Figura 4.10. Evolución del contenido total de compuestos fenólicos de los extractos de hoja de olivo para diferentes temperaturas.
Figura 4.11. Evolución de la capacidad antioxidante de los extractos de hoja de olivo para diferentes temperaturas.
APLICACIÓN DE ULTRASONIDOS DE POTENCIA
Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
Temperatura
CT
F (
mg
GA
E/g
m.s
.)
25°C 30°C 35°C 40°C 45°C 50°C
32
34
36
38
40
42
Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
Temperatura
CA
(m
g T
RO
LO
X/g
m.s
.)
25°C 30°C 35°C 40°C 45°C 50°C
60
63
66
69
72
75
78
30
SELECCIÓN DE VARIABLES ÓPTIMAS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tiempo de extracción
Figura 4.13. Evolución del contenido de compuestos fenólicos totales de los extractos de hoja de olivo para diferentes tiempos de extracción.
Figura 4.14. Evolución de la actividad antioxidante de los extractos de hoja de olivo para diferentes tiempos de extracción.
APLICACIÓN DE ULTRASONIDOS DE POTENCIA
Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
Tiempo
CT
F (
mg
GA
E/g
m.s
.)
5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 35 min 40 min
31
34
37
40
43
46
Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
Tiempo
CA
(m
g T
RO
LO
X/g
m.s
.)
5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 35 min 40 min
58
63
68
73
78
83
88
31
SELECCIÓN DE VARIABLES ÓPTIMAS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Amplitud
Diámetro de sonda ultrasónica
Temperatura
Modelización APLICACIÓN DE ULTRASONIDOS DE POTENCIA
32
SELECCIÓN DE VARIABLES ÓPTIMAS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Influencia en la cinética de extracción
0
10
20
30
40
50
0 3 6 9 12 15
CF
T (
mg
GA
E/
g m
.s.)
Tiempo (min)
Extracción estática
Extracción convencional
US
Figura 4.16. Influencia del método de extracción en la evolución del contenido total de compuestos fenólicos de los extractos de hoja de olivo.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 3 6 9 12 15
CA
(mg
TRO
LOX
/g m
.s.)
Tiempo (min)
Extracción estática
Extracción convencional
US
Figura 4.17. Influencia del método de extracción en la evolución de la actividad antioxidante de extractos de hoja de olivo.
APLICACIÓN DE ULTRASONIDOS DE POTENCIA
US
Extracción convencional
Extracción estática
US
Extracción convencional
Extracción estática
33
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
Extracción
CT
F (
mg
GA
E/g
m.s
.)
Convencional US
30
32
34
36
38
40
INFLUENCIA EN LA CINÉTICA DE EXTRACCIÓN
Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
Extracción
CA
(m
g T
RO
LO
X/g
m.s
.)
Convencional US
66
68
70
72
74
76
Figura 4.18. Media e Intervalos LSD (p < 0,05) para el contenido total de compuestos fenólicos (A) y capacidad antioxidante (B).
A
B
- Los extractos finales mostraron un contenido fenólico similar.
- La aplicación de ultrasonidos permitió obtener extractos con una capacidad antioxidante ligeramente superior.
APLICACIÓN DE ULTRASONIDOS DE POTENCIA
34
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Influencia en la Composición de los extractos Extracción convencional
Extracción asistida por ultrasonidos
- La aplicación de ultrasonidos permitió obtener extractos con un perfil fenólico idéntico a los obtenidos con extracción convencional.
Ab
sorb
anci
a (U
A)
Ab
sorb
anci
a (U
A)
Tiempo de retención (min)
Tiempo de retención (min)
A
B
Figura 4.19. Cromatograma a 280 nm de extracto procedente de hoja secada a 120°C y obtenido de forma convencional (A) y con aplicación de ultrasonidos (B).
O
L
V
V
L
O
35
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Influencia de la digestión in vitro en las propiedades de los extractos
Contenido total en fenoles
Figura 4.20. Evolución del contenido total de compuestos fenólicos durante la digestión in vitro.
• La digestión in vitro redujo la cantidad de compuestos fenólicos en el extracto, especialmente durante la primera hora de la digestión.
• La mayor reducción correspondió a los extractos procedentes de muestras secadas a 120°C mientras que la menor a las muestras liofilizadas.
36
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Figura 4.21. Evolución de la capacidad antioxidante (FRAP) durante la digestión in vitro.
• La capacidad antioxidante medida con FRAP de los extractos no varió prácticamente durante la digestión gástrica.
• Sin embargo, a lo largo de la digestión intestinal (3ª h) se produjo un incremento de la capacidad antioxidante.
Capacidad antioxidante (FRAP)
INFLUENCIA DE LA DIGESTIÓN IN VITRO
37
Capacidad antioxidante (TEAC)
Figura 4.22. Evolución de la capacidad antioxidante (TEAC) durante la digestión in vitro.
• La mayor reducción de la capacidad antioxidante (TEAC) se produjo durante la primera hora de la digestión.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Identificación de los principales compuestos fenólicos
Extracto inicial
Ab
sorb
anci
a (U
A)
Ab
sorb
anci
a (U
A)
Tiempo de retención (min) Tiempo de retención (min)
Figura 4.23. Cromatograma a 280 nm de extractos iniciales (A) y digeridos (B) procedente de hoja secada a 70°C.
A
Extracto digerido B
INFLUENCIA DE LA DIGESTIÓN IN VITRO
V L O
L
O
38
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cuantificación de los principales compuestos fenólicos
Oleuropeína
Figura 4.24. Evolución de la concentración de oleuropeína durante la digestión in vitro.
INFLUENCIA DE LA DIGESTIÓN IN VITRO
• La oleuropeína descendió a lo largo de toda la simulación, especialmente durante la primera y tercera hora de la digestión.
• Todos los extractos presentaron una reducción de oleuropeína superior al 86%.
39
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Verbascósido
INFLUENCIA DE LA DIGESTIÓN IN VITRO
Figura 4.25. Evolución de la concentración de verbascósido durante la digestión in vitro.
• El verbascósido descendió de forma moderada durante la primera hora de la digestión y prácticamente desapareció durante la tercera hora de la digestión.
CUANTIFICACIÓN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS
40
•Los extractos “120°C” mostraron la mayor degradación de oleuropeína y verbascósido, mientras que los extractos “LF” mostraron la menor al final de la simulación.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Luteolina-glucósido
INFLUENCIA DE LA DIGESTIÓN IN VITRO
Figura 4.26. Evolución del contenido de luteolina-glucósido durante la digestión in vitro.
•La luteolina glucósido de los extractos sufrió una menor degradación que la oleuropeína y el verbascósido
•Este compuesto se redujo de forma considerable durante la primera hora de la digestión (40%).
41
0
2
4
6
8
10
12
0 60 120 180 240
mg
/ g
m.s
.
Tiempo digestión (min)
LF
120 °C-US
70 °C
120 °C
CONCLUSIONES
42
CONCLUSIONES
• El método de deshidratación de la hoja de olivo influyó en la composición de los extractos. La liofilización fue la técnica que conllevó una mayor degradación de los compuestos fenólicos, mientras que el secado por aire caliente a 120°C fue el método que de deshidratación que mejor preservó estos compuestos.
•La oleuropeína y el verbascósido presente en los extractos varió en función del método de deshidratación aplicado, mientras que el contenido de luteolina-glucósido fue muy similar para todos ellos. Esto indica que la sensibilidad de los distintos fenoles de la hoja de olivo al estrés producido por la deshidratación es diferente. • Una eficiente aplicación de ultrasonidos durante el proceso de extracción permitió acortar de manera drástica el tiempo de tratamiento. Así, con únicamente 15 minutos de tratamiento de aplicación ultrasónica, se obtuvieron un contenido total fenólico y capacidad antioxidante similar que con 24 horas de extracción convencional. Estos resultados muestran el potencial de esta tecnología para mejorar la productividad de este proceso a nivel industrial.
43
• El método de deshidratación de la hoja de olivo influyó en la composición de los extractos. La liofilización fue la técnica que conllevó una mayor degradación de los compuestos fenólicos, mientras que el secado por aire caliente a 120°C fue el método que de deshidratación que mejor preservó estos compuestos.
•La oleuropeína y el verbascósido presente en los extractos varió en función del método de deshidratación aplicado, mientras que el contenido de luteolina-glucósido fue muy similar para todos ellos. Esto indica que la sensibilidad de los distintos fenoles de la hoja de olivo al estrés producido por la deshidratación es diferente. • Una eficiente aplicación de ultrasonidos durante el proceso de extracción permitió acortar de manera drástica el tiempo de tratamiento. Así, con únicamente 15 minutos de tratamiento de aplicación ultrasónica, se obtuvieron un contenido total fenólico y capacidad antioxidante similar que con 24 horas de extracción convencional. Estos resultados muestran el potencial de esta tecnología para mejorar la productividad de este proceso a nivel industrial.
CONCLUSIONES
• La aplicación de ultrasonidos no varió el perfil polifenólico de los extractos, ya que no se identificaron prácticamente diferencias respecto a los extractos obtenidos de forma convencional. Así, la energía ultrasónica no implicó la formación de nuevos compuestos.
• El contenido total fenólico y la capacidad antioxidante de los extractos se redujeron durante la digestión in vitro. Los cambios más importantes ocurrieron durante la primera y tercera hora de dicha simulación.
• La digestión in vitro redujo de forma considerable la oleuropeína presente en los extractos, mientras que el verbascósido prácticamente desapareció. La luteolina-glucósido fue el compuesto más estable durante la digestión. Estos resultados sugieren la posibilidad de proteger los extractos de hoja de olivo con técnicas de micro o nanoencapsulación para evitar la degradación de los polifenoles más sensibles a la digestión gastrointestinal.
44
• La aplicación de ultrasonidos no varió el perfil polifenólico de los extractos, ya que no se identificaron prácticamente diferencias respecto a los extractos obtenidos de forma convencional. Así, la energía ultrasónica no implicó la formación de nuevos compuestos.
• El contenido total fenólico y la capacidad antioxidante de los extractos se redujeron durante la digestión in vitro. Los cambios más importantes ocurrieron durante la primera y tercera hora de dicha simulación.
• La digestión in vitro redujo de forma considerable la oleuropeína presente en los extractos, mientras que el verbascósido prácticamente desapareció. La luteolina-glucósido fue el compuesto más estable durante la digestión. Estos resultados sugieren la posibilidad de proteger los extractos de hoja de olivo con técnicas de micro o nanoencapsulación para evitar la degradación de los polifenoles más sensibles a la digestión gastrointestinal.
INFLUENCIA DEL PROCESADO Y LA DIGESTIÓN IN
VITRO EN LAS PROPIEDADES BIOACTIVAS DE LOS
EXTRACTOS DE HOJA DE OLIVO (VAR. SERRANA)
TRABAJO FINAL DE CARRERA
TITULACIÓN:
INGENIERO AGRÓNOMO
ALUMNO:
JAIME CÁNOVAS DE LA NUEZ
DIRECTORES:
Dr. JOSÉ VICENTE GARCÍA PÉREZ
Dr. JOSÉ ENRIQUE CARRERES MALONDA
DIRECTORA EXPERIMENTAL:
Dña. MARGARITA H. AHMAD QASEM MATEO
Valencia, Diciembre 2011
45