Lic. En Biol. Gregorio Poot Mex

Replica curso de determinación Salmonella sp. y Listeria monocytogenes en

alimentos.

Actualizaciones en determinación de Salmonella sp. y Listeria monocytogenes en alimentos

• En las siguientes diapositivas se expondrá las actualizaciones en la determinación de Salmonella sp y Listeria monocytogenes para su aislamiento en muestras de alimentos.

• Se trata de las actualizaciones que propone el PROY-NOM-210-SSA1-2013 y sobre las cuales fue efectuado el curso taller L. monocytogenes y Salmonella sp.

Características del género Salmonella

• Bacilo Gram negativo• Familia Enterobacteriaceae• Generalmente móviles• Aerobios o anaerobios facultativos• Antígenos somáticos “O” (lipopolisacárido)• Antígenos flagelares “H” (proteínas)

Determinación de Salmonella sp.

Pre- enriquecimiento Se utiliza de manera general el Caldo Lactosado. Incubar por 24 +/- 2 h a 35°C

Enriquecimiento selectivoSe utilizan Caldo Selenito Cistina y Caldo Tetrationato. Incubar por 24 +/- 2 h a 35° C. Adicionar 0.2 ml de Yodo Yoduro y 0.1ml de Verde Brillante. Se menciona el uso del Caldo Rappaport Vassiliadis

Selección en medios sólidosSe menciona que se pueden utilizar tres agares de los siguientes: Agar Verde Brillante, Agar Sulfito de Bismuto y Agar XLD, Agar Hektoen, Agar SS. Incubar por 24 +/- 2h a 35 +/- 1°CSe menciona que se prueben dos o más colonias típicas de cada placa

Identificación bioquímicaMenciona pruebas bioquímicas adicionales para la identificación cuando no se identifica directamente con la serología.

Confirmación serológica

NO

M -114 S

SA

1-1994

Prueba de ureasa se puede incluir en las pruebas presuntivas

Pre- enriquecimientoSe utiliza de manera general el Agua Peptonada Amortiguada. Incubar por 18 +/- 2 h a 37°C

Enriquecimiento selectivoSe descarta el uso del Caldo Selenito Cistina.Se utiliza el Calo Müller- Kauffmann Tetrationato novobiocina. 0.2 ml de solución Yodo Yoduro Incubar por 24 +/- 3 h a 37 +/- 1°C +/- y se utiliza el Caldo Rappaport Vassiliadis. Incubar por 24 +/- 3 h a 41.5 +/- 1°C.

Selección en medios sólidosSe indica el uso de Agar XLD y se menciona que se utilicen dos agares más, Agar Sulfito de Bismuto y Agar Hektoen. Incubar por 24 +/- 3 h a 37 +/- 1°CSe menciona que se prueben dos o más colonias típicas de cada placa y si no hay, dos o más colonias atípicas. Sembrar en agar nutritivo ; incubar 24 hrs a 35 °c

Identificación bioquímica y serología.Prueba de UreasaPrueba de Lisina descarboxilasaDetección de Beta-GalactosidasaPrueba de IndolPrueba de Voges ProskaweImplica un día más de análisis

PR

OY

-NO

M -210 S

SA

1-2013

COMPARACIÓN DE LA NOM-114-SSA1-1994 y El Proyecto de la NOM-210-SSA1-2013

CONCLUSIÓN

• NOM-114• Se utiliza de manera general el Caldo

Lactosado. Incubar por 24 +/- 2 h a 35°C

• Tiempo total: 4 días• Permite el uso de otros medios solidos

para aislamiento.• Tsi y Lia

• Proy. NOM-210• Tiempo total: 6 días• Se utiliza de manera general el Agua

Peptonada Amortiguada. Incubar por 18 +/- 2 h a 37°C

• Incluye el uso de novobiocina permite mejor selectividad en el enriquecimiento. MKTTn

• Pruebas bioquimicas adicionales• Se mantienen XLD, SB y Hecktoen.

Listeria monocytogenes

Generalidades

Gram (+)

Bacilo 1-2 x 0.5-0.8 µm

No esporulado

0 – 45 °C [37 °C]

pH 5.0 – 9.6 [pH 7.0]

Tolera 10 % NaCl

C a

r a c

t e

r í s

t i c

a s

Patógeno intracelular facultativoβ-hemólisis discreta | CAMP (+)

hidroliza la esculina

oxidasa(-) catalasa (+)

Voges-Proskauer y Rojo de Metilo (+)

Flagelos perítricos / 25 °C

(Mandell et al., 2002).

Ciclo infectivo L. monocytogenes

La bacteria es inocua en el medio ambiente y es la modificación del ambiente al ser sometida a presión selectiva la que permitirá la expresión de los factores de virulencia.

1.- Entrada a las células del huésped.

2.- Escape del fagosoma y desarrollo

intracelular.

3.-Desplazamiento intracitoplásmico.

4.- Diseminación célula a célula.

Especies de Listeria

L. monocytogenes

L. ivanovii

L. seeligeri

L. innocua, L. welshimeri, L. grayi, L.

murrayi, L.rocourtiae. L. marthii

La identificación de

Listeria monocytogenes se

apoya en las

características fisiológicas,

bioquímicas y antigénicas:

L.monocytogenes se

divide en 14 serotipos,

identificados por la fórmula

somática (O) y flagelar (H).

Determinación Listeria monocytogenes NOM-143-SSA1-1995

Tomar 25 gr o ml en 225 caldo EB homogeneizar, incubar por 48 hrs a

30°c

Resembrar en OXA a 35°c por 24 a 48 hrs .

Colonias negras con halo negro

Resembrar en LMP a 30 °c de 24 a 48 hrs.

Con iluminación de Henry colonias de color blanco o

azul iridiscentes.

Seleccionar 5 o mas colonias típicas y pasar a placas de ASTEL

35°c por 24 hrs

a 24 y 48 ha 24 y 48 h

Prueba de movilidad en

fresco.

Solucion salina 0.85%

Tincion gram. Gram +

Prueba de catalasa.Solución de peróxido al 3%

Prueba de hemolisis.Agar sangre de cordero al 5%.

48 hrs a 35°c

Prueba de reducción de nitrato.Caldo nitratos incubar a 35°c x 5 días.

Leer 0.2ml de reactivo A y 0.2ml reactivo B rojo indica nitritos

Agregar zinc en polvo rojo después de 1h indica nitratos.

Prueba de movilidad en agar.

Usando SIM o MTM forma de paraguas.

7 dias de 20 a 25°c

Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson.SINERGIA DE HEMOLISINASEn agar sangre de carnero

Rhodoccocyus equi ATCC 6339Staphylococcus aureus ATCC 25923

Incubar a 35°c por 24 a 48 hrs

Serologia.

Informe. Reportar presencia/ausencia en 25 gr

o ml.

Prueba de utilización de carbohidratos.En caldo purpura de bromocresol al 5% con:

Dextrosa, Esculina, Maltosa, Ramnosa, Manitol y Xilosa.

A 35°c por 7 dias

Polivalente listeria monocytogenes

Determinación Listeria monocytogenes PROY- NOM-210-SSA1-2013

25 g r o ml de la muestra en 225 caldo Fraser medio a 30°c±1°c por

24±2 hNota: una coloración oscura puede

aparecer.

Inocular por estría cruzada 2 placas Oxford a 30°c±1°c a de 24 a 48 hrColonias a 24 h pequeñas

de 1mm grisáceas rodeadas de un halo

oscuro a las 48 horas de 2 mm oscuras con posible

brillo verdoso halos negros y centros hundidos

Inocular PALCAM 2 placas por estría cruzada incubar a 37°c±1°c por 24 a 48 hrs

Colonias a 24 hrs muy pequeñas grisáceas o

verde olivo de 1.5 a 2mm a veces con centros negro

pero siempre con halos oscuros a las 48 horas de color verde con el centro hundido y halos negrosTransferir 0.1ml del enriquecimiento

primario a caldo Fraser incubar a48h±2 h a 37°c±1°c

Presuntivo: Observación de la hidrólisis de la esculina.

Seleccionar 5 o mas colonias sospechosas y pasar a placas de TSYEA por estría cruzada incubar a 37°c±2°C

por 18 a 24 hrs no mas de 72 hrsSe puede usar óptica de Henry como parte informativa colonias azul-gris o

azul.Se recomienda TSYEA delgado 15ml por

placa

Prueba de movilidad en fresco.

Tomar una colonia aislada de TSYEA e inocular CSTYE

incubar a 25°c±1°c por 8 a 24 hrs o hasta turbiedad examinar

en microscopio.

Tincion gram. Gram +

Prueba de catalasa.Solución de peróxido al 3%

Prueba de movilidad en agar.

forma de paraguas.Incubar 25°c±1°c por 48

h

Pruebas complementarias.

Tinción gram a 100 x

Prueba catalasa

Forma típica de paraguas en Agar Movilidad

Prueba de hemolisis.Agar sangre de cordero al 5%

Dibujar una cuadricula de 20 a 25 cuadros inocular por picadura; utilizar cepas de referencia

L.monocytogenes y L.innocua.L. monocytogenes produce una zona discreta de3 hemolisis alrededor de la picadura; L. innocua no

muestra una zona de hemolisis y L.ivanovii muestra una zona ancha, clara y delimitada por β-

hemolisis.

Prueba de utilización de carbohidratos.Ramnosa y xilosa

En caldo carbohidratos inocular usando colonias de TSYEA. Incubar a 35°c±2°c por 5 días.Pueden usarse sistemas de bioquímicas

miniaturizadas o técnicas de biología molecular.

Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson.SINERGIA DE HEMOLISINASEn agar sangre de carnero

Rhodoccocyus equi ATCC 6339Staphylococcus aureus ATCC 25923Incubar a 35°c±2°c por 12 a 18 hrs

Para fines de vigilancia sanitaria , los aislamientos que seran considerados como L. monocytogenes

deben ser enviados al laboratorio de referencia de la COFEPRIS para realizar tipificacion.

Polivalente listeria monocytogenes

Sistema API ®LISTERIA

PRUEBA CAMP

PRUEBAS PARA CONFIRMACION DE LISTERIA MONOCYTOGENES

GRACIAS