PROCEDIMIENTO RECUENTO AEROBIOS EN PLACA · PDF fileFecha emisión: Agosto de 2002 Revisión: 9 PROCEDIMIENTO RECUENTO AEROBIOS EN PLACA METODO BAM ONLINE 2001 Fecha

Fecha emisión: Agosto de 2002 Revisión: 9

PROCEDIMIENTO RECUENTO AEROBIOS EN PLACA METODO BAM ONLINE 2001

Fecha revisión: 11/02/2008

Sección Microbiología Alimentos y Agua

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1. OBJETIVO Conocer el número de microorganismos aerobios mesófilos que contiene un alimento. Este método es uno de los indicadores microbiológicos de calidad mas utilizado. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Aplicar este procedimiento a alimentos congelados, enfriados, precocidos o preparados con excepción de los productos fermentados o madurados tales como queso, ciertos tipos de embutidos, yogurt, etc. 3. FUNDAMENTO

Este en un método de recuento en placa y siembra en profundidad.

Los resultados de este análisis permiten:

• Verificar efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfección.

• Determinar si las temperaturas aplicadas en los procesos fueron las adecuadas.

• Determinar el origen de la contaminación durante los procesos de elaboración de los alimentos.

• Verificar condiciones óptimas de almacenamiento y transporte.

• Obtener información acerca de la vida útil de los alimentos.

• Indicar alteración incipiente en ciertos alimentos. 4. REFERENCIAS 4.1 Bacteriological Analytical Manual. Online Enero 2001. 4.2 Standard Methods for the Examination of Dairy Products.15 º ed. 1992. (Para cálculo de

resultados) 4.3 PRT-712.01-001 "Procedimiento de Recepción de las muestras". 4.4 PRT-712.01-002 "Procedimiento de procesamiento de muestras de alimentos y agua"





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5. TERMINOLOGÍA

No Aplica 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 MATERIALES Y EQUIPOS 6.1.1 Placas Petri estériles de vidrio o de plástico de 90-100 mm de diámetro. 6.1.2 Frascos de dilución de 160 mL de vidrio borosilicato con tapa rosca. 6.1.3 Tubos de 16 x 160 mm marcados en 9 y 10 mL, que contengan 9 mL de solución

diluyente estéril. 6.1.4 Pipetas bacteriológicas estériles de 1, 5 y 10 mL graduadas en 0,1 Ml 6.1.5 Incubadora regulada a 35 ± 1ºC, y para muestras de leche regulada a 32 ± 1ºC 6.1.6 Baño de agua termorregulado a 47 ± 2 ºC. 6.1.7 Agitador de tubos 6.1.8 Contador de colonias, tipo Quebec de campo oscuro o equivalente 6.2 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 6.2.1 AGUA RECOMENDADA PARA USO EN MICROBIOLOGIA

Para preparar medios de cultivo, reactivos y blancos de dilución sólo se debe usar agua que ha sido tratada por el desionizador Barnstead, para dejar libre de trazas de metales disueltos y componentes bactericidas e inhibitorios.

6.2.2 DILUYENTE: Agua dilución fosfato buferada de Butterfield pH 7.2 ± 0.1 distribuida

en volúmenes de 9 mL en tubos de tapa rosca. 6.2.3 AGAR PARA RECUENTO EN PLACA: Agar Plate Count Agar o Standard Methods

Agar estéril, pH 7±0.1, distribuido en frasco Schott con 200 mL. (Anexo Nº 3) 7. DESARROLLO 7.1 REQUISITOS "RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS

VIABLES" (Ver Anexo N° 1) 7.2 PRECAUCIONES "RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS

VIABLES" (Ver Anexo Nº 2) 7.3 DILUCIONES Y SIEMBRA DE LA MUESTRA





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7.3.1 Recibir en el Laboratorio de Recuentos, las muestras procesadas en el Laboratorio de

Recepción de Muestras de esta sección y dejar constancia de ello en el registro código RG-712.00-037. Estas muestras son procesadas según el PRT-712.01-001 de "Procedimiento de Recepción de las muestras" y el PRT-712.01-002 de "Procedimiento de procesamiento de muestras de alimentos y agua".

7.3.2 Anotar en cuaderno de inscripción, la clave y número de las muestras a sembrar.

7.3.3 Verificar que el volumen de cada tubo de dilución contengan 9 mL.

7.3.4 Preparar diluciones decimales de 10¯², 10 ¯³, etc. a partir del homogeneizado de la muestra o de muestra líquida directa. (Ver Anexo Nº 6). Para ello transferir 1 mL a un frasco con 9 mL de diluyente. Agitar y proceder de igual forma para las diluciones siguientes.

7.3.5 Identificar las placas Petri con clave, número de la muestra y dilución.

7.3.6 Sembrar 1 mL por duplicado de cada dilución en placas estériles previamente identificadas. Sembrar como mínimo dos diluciones consecutivas. (Anexo Nº 4 Diagrama Análisis Recuento de microorganismos aerobios mesófilos).

7.3.7 Verter en cada placa Petri aproximadamente 12-15 mL de agar previamente fundido y mantenido en baño de agua a 47°C ± 2 ºC.

7.3.8 Mezclar el inóculo con el medio fundido, inclinando y girando las placas. La forma adecuada de llevar a cabo esta operación sería la siguiente:

a) Mover la placa con movimientos de vaivén 5 veces en una dirección,

b) hacerla girar 5 veces en el sentido de las agujas del reloj,

c) mover con movimientos de vaivén en una dirección que forme ángulo recto con la primera y

d) hacerla girar 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj.

7.3.9 Una vez solidificado el agar, invertir las placas rápidamente para prevenir el crecimiento de colonias invasivas por acumulación de humedad. Incubar a 35 ºC durante 48 horas ± 2 horas.

Con el fin de validar los resultados se recomienda realizar controles de: ambiente, esterilidad del medio de cultivo, esterilidad del diluyente

7.4 LECTURA Y RECUENTO DE COLONIAS 7.4.1 LECTURA DE LAS PLACAS 7.4.1.1 Luego de cumplir el período de incubación realizar la lectura de las placas.





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7.4.1.2 Si no es posible leerlas prontamente, guardarlas a 4ºC por no más de 24 horas, pero

esto no hay que hacerlo de rutina. 7.4.1.3 Realizar el recuento con un contador de colonias modelo Quebec de campo oscuro. 7.4.1.4 Examinar las muestras dudosas con mayor aumento para distinguir las colonias de

materias extrañas. 7.4.1.5 Evitar la fatiga ocular que puede causar imprecisiones. 7.4.1.6 Anotar la dilución usada y el número de colonias contadas en cada placa en el registro

código RG-712.00-023. 7.4.1.7 Anotar los resultados de los controles realizados en los siguientes registros según

corresponda: RG-.712.00-001, RG-712.00-009 y RG-712.00-010.

7.4.2 RECUENTO DE COLONIAS Y REGISTRO (Anexo Nº 5 Casos, lectura, registro

cálculo e informes de resultados)

El recuento de colonias en placa se realiza de acuerdo al siguiente esquema:

7.4.2.1 Placas normales (25 - 250 colonias):

• Seleccionar las placas libres de crecimiento invasivo.

• Contar todas las colonias incluyendo aquellas de tamaño muy pequeño.

• Anotar por dilución, el número de colonias contadas en cada placa.

7.4.2.2 Casos especiales

Si no se tienen placas que cumplan con el requisito anterior, proceder de la siguiente manera:

7.4.2.2.1 Placas sobrepobladas (mas de 250 colonias):

a1)-Anotar los recuentos de placas sobrepobladas como muy numerosos para contar (MNPC) cuando disponga de placas normales.

a2) Si no dispone de placas normales en las diluciones sembradas, contar las colonias en porciones de la placa si su distribución es homogénea y calcular el recuento estimado en placa (RPES).

• Si hay menos de 10 colonias por cm², contar las colonias en 12 cuadrados, seleccionar 6 cuadrados consecutivos horizontales de la placa y 6 cuadrados consecutivos formando ángulo recto, contar cada cuadrado sólo una vez

• Si hay más de 10 colonias por cm² contar las colonias en cuatro de tales porciones.





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En ambos casos, multiplicar el número promedio de las colonias contadas por cm² por el área de la placa usada para estimar el número de colonias por placa. Cada laboratorio debe determinar el área en cm² de las placas usadas. Registre los valores obtenidos e indique como recuento estimado.

• Si hay mas de 100 colonias por cm², registrar como >100 col / cm².

7.4.2.2.2 Placas con menos de 25 colonias (< 25 colonias)

Cuando las placas de las diluciones tienen menos de 25 colonias cada una, registre los valores obtenidos e indique como recuento estimado.

7.4.2.2.3 Placas sin desarrollo de colonias

Cuando ninguna de las placas presente desarrollo de colonias, registrar como sin desarrollo en la dilución correspondiente (SD) o < 1 por la correspondiente dilución más baja e indique como recuento estimado.

7.4.2.2.4 Crecimiento invasivo

Las colonias invasivas son generalmente de tres tipos:

a1) El primer tipo son las colonias en cadenas, que al parecer son causadas por desintegración de un grupo de bacterias cuando la placa Petri es rotada para mezclar el agar con la alícuota analizada. Si solamente existe una de tales cadenas contar como una colonia . Si una o mas cadenas parecieran originarse de fuentes distintas, contar cada fuente como una colonia. No contar cada crecimiento individual de tal cadena como una colonia.

a2) El segundo tipo de colonia invasora es la que se desarrolla en una película de agua entre el agar y el fondo de la placa Petri.

a3) El tercer tipo es la que se forma en una película de agua en el costado o en la superficie del agar.

Estos dos últimos tipos revelan una acumulación de humedad en el punto en el cual se origina el crecimiento invasivo. Cuando la alícuota de siembra es uniformemente distribuida en el medio, las bacterias raramente desarrollan colonias invasivas.

a4) Si en las placas seleccionadas se presenta invasión, realizar recuento de colonias solamente:

• Si el área invadida no excede la mitad de la placa.

• Si las colonias están bien distribuidas fuera del área invadida.

• Si no se cumple lo anterior, registrar como crecimiento invasivo o accidente de laboratorio.





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Los laboratorios con un 5 % de placas cubiertas con más de 1/4 de las placas con crecimiento invasivo, deberían tomar medidas inmediatas, para eliminar este problema (reducir la humedad ambiente en la cámara o estufa de incubación y mezclar cuidadosamente el agar con la siembra).

7.4.2.2.5 Accidente de laboratorio o inhibidores de crecimiento bacteriano.

Cuando una placa presenta contaminación u otra condición insatisfactoria registrar como "Accidente de Laboratorio". Especificar. El analista puede sospechar la presencia de sustancias inhibidoras en las muestras que están siendo analizadas, cuando las placas no tienen crecimiento o tienen proporcionalmente menos crecimiento en las diluciones mas bajas. Tal resultado no debería ser interpretado como evidencia de inhibidores hasta confirmar la presencia de ellos en el producto 7.5 EXPRESION DE RESULTADOS 7.5.1 Cálculo y registro de resultados ( Ver Anexo Nº 5)

Para los cálculos del Recuento Standard en placa considerar sólo los dos primeros dígitos.

Si el tercer dígito es 6, 7, 8 o 9 adicionar una unidad al segundo dígito. Si el tercer dígito es 1, 2, 3 o 4 considerar solamente los dos primeros dígitos. Cuando el tercer dígito es 5, agregar una unidad al segundo dígito si este es impar y mantener el segundo dígito si este es par.

Usar ceros para los demás dígitos hacia la derecha.

Ejemplo

Lectura calculada R A M

12.700 13.000

12.400 12.000

15.500 16.000

14.500 14.000

7.5.2 Placas normales 7.5.2.1 Cuando los recuentos de los duplicados de placas de sólo una de las diluciones caen

dentro del rango 25 a 250 colonias:

- Utilizar para el cálculo los recuentos obtenidos en placas normales

- Sacar promedio y multiplicar por el factor de dilución.





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7.5.2.2 Si los recuentos de las placas de dos diluciones consecutivas caen dentro del rango

25-250 colonias calcular el RAM según la siguiente fórmula:

N = Σ C

[ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d

donde :

N = número de colonias por ml o g de producto

Σ C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas

n1 = número de placas contadas de la menor dilución.

n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva.

d = dilución de la cuál fué obtenido el primer recuento

Ejemplo

1 : 100 1 :1000

232 y 244 33 y 28

N = 232 + 244 + 33 + 28

[( 1 x 2 )+( 0.1 x 2 )] x 0,01

= 537

0.022

= 24.409 = 24000

7.5.2.3 Cuando los recuentos de las placas en duplicado caen tanto dentro como fuera del

rango 25-250 colonias, usar sólo aquellos recuentos que estén dentro de este rango.





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7.5.3 Todas las placas con menos de 25 colonias.

Cuando las placas de ambas diluciones tienen menos de 25 colonias cada una, informar el recuento como menor de 25 por el recíproco del factor de dilución menor.

Ejemplo

1 : 100 1 : 1.000 R A M ( mL o g )

18 2 < 2.500 recuento en placa estimado (RPES)

0 0 < 2.500 recuento en placa estimado (RPES)

7.5.4 Todas las placas con mas de 250 colonias

Cuando las placas de ambas diluciones tienen más de 250 colonias cada una (pero menos de 100 por cm²) contar las placas más cercanas a 250, sacar promedio y multiplicar por el recíproco de la dilución.

Ejemplo

1 :100 1 : 1.000 R A M ( mL o g )

MNPC 640 640.000 recuento en placa estimado (RPES)

( MNPC = Muy numeroso para contar )

7.5.5 Todas las placas con más de 100 colonias promedio por cm².

Estimar que el R A M es mayor de 100 veces la mayor dilución sembrada, por el área de placa utilizada y por el recíproco de la dilución.

Ejemplo

1 : 100 1 : 1.000 R A M ( mL o g )

TNPC 7.150* > 6.500.000 * ( RPES )

TNPC 6.490** >5.700.000 **( RPES )





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* basado en un área de placa de 65 cm² ( 9 cm Ø )

** basado en un área de placa de 57 cm² ( 8,5 cm Ø )

7.5.6 Todas las placas con crecimiento invasivo, presencia de inhibidores o accidente

de laboratorio. Informar según corresponda. 7.6 INFORME DE RESULTADOS (Anexo Nº 5) 7.6.1 Informar el recuento de aerobios mesófilos (RAM) en unidades formadoras de colonias

(ufc) por mililitro o gramo según corresponda.

Expresar el Resultado con sólo un número entero y un decimal multiplicado por 10 elevado a la potencia correspondiente. Ej 2.400 → 2,4 x 103 ufc / g o mL.

7.6.2 Siempre que se utilice el método de recuento en placa para decidir si una partida de

alimentos se acepta o se rechaza, debe considerarse únicamente recuentos realizados dentro del rango 25-250 colonias y nunca los recuentos estimados. Desde el punto de vista de un Organismo Oficial, el recuento estimado es sólo útil como una aproximación inicial para valorar la calidad bacteriológica de un alimento.

7.6.3 En el caso de que se utilice el recuento en placa para establecer si un alimento determinado

cumple una norma microbiológica, debe tomarse en cuenta los planes de muestreo especificados para ese alimento

7.7 REPRODUCIBILIDAD Y ERROR PERSONAL

El resultado obtenido al contar por segunda vez las colonias de una placa determinada debe presentar: 7.7.1 Una diferencia máxima del 5% en el caso de que este recuento lo realice la misma persona. 7.7.2 Una diferencia máxima del 10% en el caso de que este recuento lo haya realizado otra u

otras personas. Cuando la diferencia entre ambos es superior a estos límites, puede deberse a defectos visuales, a la dificultad de reconocer las colonias muy pequeñas o lo que es mas frecuente, a la incapacidad para diferenciar las colonias de las partículas más pequeñas





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7.8 CONTROLES 7.8.1 Chequear esterilidad de:

- Agua de dilución

- Agar para recuento en placa (Plate Count o agar Standard Methods)

- Pipetas

- Placas Petri 7.8.2 Control de ambiente por método de sedimentación en placa :

- Mesón de siembra

- Flujo laminar 7.8.3 Control de temperatura de incubadora diariamente. 7.8.4 Control temperatura baño termorregulado cada vez que se siembre muestras 8. REGISTROS

Identificación del registro

Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención y disposición

Registro control de ambiente, RG-712.00-009.

Archivador verde Registros Laboratorio N°346 Sección Microbiologia Alimentos y Agua.

Acceso restringido a personal Sección Microbiología.

Papel 5 años y disposición en basura normal partidos en trozos.

Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis Laboratorio 346, RG-712.00-010.

Archivador verde Registros Laboratorio N°346 Sección Microbiologia Alimentos y Agua.



Registro análisis de muestras de alimentos y agua

Archivador azul Registros de Lecturas e informes de resultados Laboratorio







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Identificación del registro

Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención y disposición

Laboratorio de Recuentos RG-712.00-023.

Recuento aerobios mesófilos, S.aureus, Mohos y levaduras Sección Microbiologia Alimentos y Agua.

Registro de entrega diaria de muestras a los laboratorios RG-712.00-037.

Archivador rojo Registro entrega diaria Laboratorio 340.



9. TABLA DE MODIFICACIONES Revisión Nº Pág.

Modificada Motivo del cambio Fecha

Aprobación 8 1 Se elimina formato página 1 por cambio en

formato de documento institucional.

8 1 a 31 Se cambia el formato del encabezado de página a todo el documento. Se corrige PRT-702.02-023 por “PRT -712.02-023” Se cambia el número de revisión 8 por “9” y el total de páginas.

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8 2 En los puntos 4.3 y 4.4 se corrige PRT-702.01-001 y PRT-702.01-002 por “PRT-712.01-001 y PRT-712.01-002” respectivamente.

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8 2 Se deja pie de página sólo en página 1 y se actualizan los cargos.

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8 3 En el punto 6.6 se cambia 45°C ±2 °C por “ 47 °C ± 2°C.”

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8 3 En ítem Medios de Cultivo y Reactivos en el segundo párrafo Diluyente se cambia por:...”.9 mL en tubos tapa rosca” y se elimina: Para

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Aprobación muestras de leche distribuida en frasco con 99 mL ± 2 mL.

8 3 En el punto 7.1 se corrige N por “N °” 11/02/2008 8 3 En el punto 7.3.1 se corrige la codificación de

RG-702.00-037 por RG-712.00-037, PRT-702.00-001 por PRT-712.01-001 y PRT-702.01-002 por PRT-712.01-002.

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8 3 En el punto 7.3.3 se cambia por:...tubo....9 mL. 11/02/2008 8 4 En el punto 7.3.4 se cambia por:...1 mL...9

mL... 11/02/2008

8 4 En el punto7.3.7 se cambia 48°C por 47°C ± 2°C.

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8 4 En el punto 7.3.11 en los párrafos 6 y 7 se corrige RG -702.00-XXX por “RG-712.00-XXX”.

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8 5 En el punto 7.4.2 en el párrafo 7 se agrega al final de la frase después del punto seguido: ” Registre los valores obtenidos e indique como recuento estimado.”

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8 5 En el punto 7.4.2.b) en segundo párrafo se elimina: ....., proceder como punto 1 y se agrega:” registre los valores obtenidos e indique como recuento estimado”.

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8 5 En el punto 7.4.2 c), en segundo párrafo se agrega:... “o < 1 por la correspondiente dilución más baja e indique como recuento estimado”.

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8 8 En el punto 7.5.3 en el ejemplo se agrega a la derecha de < 2.500: “recuento en placa estimado (RPES)”.

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8 9 En el ejemplo del punto 7.5.4 se agrega al lado derecho del valor RAM: ...“recuento en placa”...

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8 11 Se cambia el punto 8.0 Responsables por “Tabla registro” por cambio de formato a nivel institucional.

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Aprobación 8 11 Se cambia el punto 9.0 Distribución por “Tabla

de modificaciones” por cambio de formato a nivel institucional

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8 11 Se cambia el punto 10.0 Registros por Anexos por cambio formato a nivel institucional.

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8 12 En la tabla Anexo 1 se reemplaza BOTELLAS DE DILUCIÓN por:”TUBOS DE DILUCION: Deben tener una capacidad aproximada de 20 mL, de vidrio de borosilicato con tapa de rosca. Verificar que los tubos contengan la cantidad adecuada. Se recomienda tubos marcados indeleblemente a 9 mL y 10 mL ± 0,1 mL”.

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8 14 En la fila octava de la tabla se cambió 50°C por “47°C ± 2°C”.

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8 15 En el Anexo N° 2, en el párrafo nueve se cambió 48°C ± 1°C por “47 ºC ± 2ºC”.

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8 17 En el esquema del anexo N° 4 se cambia 99 mL de Agua peptonada 0,1 % por: “450 mL de Solución de Butterfield”. Se cambia 11 g por “50 g”. Se cambia 9 mL se agua peptonada 0,1% por “Solución de Butterfield”.

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8 20 En los casos 1 y 2 a), b),c) se agrega “RPES”a los puntos mencionados en la columna INFORME.

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8 21 En el punto b), en la columna INFORME se agrega (RPES). En el punto c), en la columna CALCULO Y REGISTRO se agrega:” < 1,0 x por el recíproco de dilución menor” y en al columna Informe se cambia <1,0 x 10^3 por” < 2,5 x 10^3 (RPES)”.

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10. ANEXOS





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10.1 Anexo N° 1 “Requisitos “Recuento de microorganismos aerobios mesófilos viables”. 10.2 Anexo N° 2 “Precauciones “Recuento de microorganismos aerobios mesófilos viables”. 10.3 Anexo N° 3 “Características del agar Standard. 10.4 Anexo N°4 “Recuento de microorganismos aerobios mesófilos: Técnica Recuento en placa

siembra en profundidad”. 10.5 Anexo N° 5 “Recuento de microorganismos aerobios mesófilos”. 10.6 Anexo N° 6 “Tabla de diluciones según análisis realizado en el lab. 346”. 10.7 Anexo N° 7 RG-712.00-023 "Registro de resultados análisis RAM, S. aureus, Mohos y

Levaduras en alimentos y agua”





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ANEXO Nº 1

REQUISITOS "RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS VIABLES"

AUTOCLAVE : El autoclave debe ser de tamaño suficiente para prevenir el amontonamiento de material en su interior y ser construido de forma que provea temperaturas uniformes. Este equipo debe constar de un termómetro registrador de temperatura.

HORNO ESTERILIZADOR :

De tamaño suficiente para evitar que se amontone el material en su interior, que provea una temperatura uniforme. Debe tener termómetro registrador de temperatura.

BALANZA :

Con sensibilidad de 0,1 g capacidad de 200 g de carga. Es preferible de un sólo plato.

CONTADOR DE COLONIA :

Se prefiere el modelo "Quebec" o uno que tenga aumento y visibilidad equivalente.

TUBOS DE DILUCION: Deben tener una capacidad aproximada de 20 mL, de vidrio de borosilicato con tapa de rosca. Verificar que los tubos contengan la cantidad adecuada. Se recomienda tubos marcados indeleblemente a 9 mL y 10 mL ± 0,1 mL.

INCUBADORA :

La temperatura dentro de la incubadora no debe variar mas de 35 ±1 ºC. La temperatura dentro de la incubadora se determina cuando está llena a su capacidad máxima. Las placas deben llegar a la temperatura de incubación dentro de 2 horas. Evitar la humedad excesiva dentro de la incubadora, para reducir la tendencia de crecimiento de colonias invasivas. Prevenir el desecamiento excesivo del medio, controlando la ventilación y circulación de aire. El agar de las placas incubadas no debe perder mas del 15 % del peso durante las 48 horas de incubación.





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REQUISITOS "RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS

VIABLES" La incubadora debe cargarse de manera que quede no menos de

2,5 cm de espacio entre los grupos de placas o entre las placas y las paredes del incubador. Las incubadoras deben estar aisladas, equipadas con unidades bien distribuidas de calefacción y deben tener una circulación mecánica de aire. Las incubadoras deben mantenerse en salas donde la temperatura tenga un rango de 16 - 27 ºC. La temperatura de la estufa o cámara de incubación debería chequearse dos veces al día; una antes de sacar el material en la mañana y otra en la tarde al finalizar la jornada trabajo. Esto debe ser realizado con termómetros de registro de temperatura máxima y mínima. Los termómetros deben ser sumergidos en un recipiente con agua herméticamente cerrado. La temperatura del aire no es un buen índice de la temperatura real del agar.

HOMOGENIZADOR MECANICO:

Warring blender con vaso de vidrio o de acero inoxidable.

STOMACHER:

De capacidad 400 g.

PLACAS PETRI:

Los fondos de las placas Petri deben tener por lo menos 85 mm de diámetro interior y una profundidad de 12 mm con superficies interiores y exteriores libres de burbujas, rayaduras u otros defectos. Pueden ser de vidrio o desechables.

CONTENEDORES DE PLACAS PETRI.:

De acero inoxidable o aluminio, con tapa.

PIPETAS: Para este análisis se usan pipetas de 1 mL ± 0,25 mL, la que debe entregar su contenido en máximo 4 segundos. Usar sólo pipetas intactas, taponadas, de material no torcido, calibradas para uso bacteriológico y en conformidad con las especificaciones de APHA.





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REQUISITOS "RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS

VIABLES" PROPIPETAS O PIPETAS AUTOMATICAS .

CONTENEDOR DE PIPETAS:

De acero inoxidable.

REFRIGERADOR :

Debe mantener las muestras a una temperatura de 0 -4.4 ºC hasta ser analizadas. Se debe chequear la temperatura diariamente.

ESPACIO DE ALMACENAJE:

Libre de polvo e insectos y adecuados para guardar material.

TERMOMETROS

Los termómetros deben tener un rango de -1,1 a 55 ºC. La graduación no debe exceder de 1 ºC. Los termómetros deben ser chequeados con un termómetro certificado por lo menos una vez al año.

AREA DE TRABAJO:

Debe ser un mesón nivelado, con amplia superficie de trabajo, limpio, iluminado. El laboratorio debe tener buena ventilación, libre de polvo y de corrientes de aire. El número de microorganismos (bacterias, levaduras y hongos) en el aire del área de trabajo no debe exceder de 15 colonias por placa expuesta durante 15 minutos.

BAÑO DE AGUA TERMORREGULADO:

De dimensiones adecuadas, con control termostático para mantener el medio a 47°C ± 2°C.





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ANEXO Nº 2

PRECAUCIONES "RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS VIABLES"

• Al realizar las siembras usar propipeta. No pipetear con la boca. • Al retirar una pipeta estéril de su contenedor evite contaminar la punta con las superficies

exteriores del envase. • No flamear pipetas estériles. • Introducir la pipeta no más de 2,5 cm. dentro del homogeneizado de la muestra o dilución. • Extraer un volumen ligeramente mayor a la alícuota deseada. Retirar la pipeta por sobre el

nivel del líquido y enrasar tocando con la punta de ésta la pared interior del tubo o frasco de dilución.

• Al inocular las diluciones, mantener la pipeta en un ángulo de 45 º, y con la punta de ésta

tocar el fondo de la placa Petri o la pared interior del envase de dilución. • Levantar la tapa de la placa Petri lo necesario para introducir la pipeta. El tiempo que debe

transcurrir para que la pipeta entregue el volumen de 1 mL es de 2-4 segundos. Tocar un punto seco de la placa manteniendo la pipeta en posición vertical.

• No expulsar la gota que queda en la punta de la pipeta. • Fundir la cantidad de medio de cultivo necesario para ser usada en un período de 3 horas y

mantenerlo en baño de agua a 47 ºC ± 2ºC. • Evitar exposiciones prolongadas del medio a altas temperaturas.





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ANEXO Nº 3 CARACTERÍSTICAS DEL AGAR STANDARD

Si el medio de cultivo es preparado por ingredientes éstos deben tener las siguientes

especificaciones: 1-Caseína pancreática: debe ser de calidad USP dada en la U.S. Pharmacopoeia, 1975 XIX p. 744. 2-Extracto de levadura: conforme a normas dadas por la U.S. Pharmacopoeia, 1975 XIX p. 758. 3-Glucosa: según normas de U.S. Pharmacopoeia XIX p. 128. Debe ser anhidra. 4- Agar: conforme a las siguientes especificaciones. a) Características generales: El material seco debería ser granulado o en escamas, de color blanco cremoso. Una cantidad de 2 g

suspendida en 100 mL. de agua destilada fría. Debería disolverse completamente en 5 minutos a 100 ºC. Después de autoclavar esta solución debe estar libre de materias extrañas o partículas en suspensión las cuales pueden interferir en la lectura. El pH de esta solución al 2% no debe ser menos de 6,0.

b) Temperatura de gelificación y fundido La gelificación de solución acuosa caliente al 1.5% no debería ser sobre 43 º C y no menor de 33 º

C. Luego de solidificado el medio no debería fundirse a menos de 70ºC. c) Recuento de esporas viables Este recuento no debería ser superior a 50. A 2 g de agar agregar 100 mL. de caldo soya y autoclavar la mezcla a 121 ºC por 15 minutos.

Luego enfriar a 45 ºC y distribuir en 3 o 4 placas estériles. Incubar las placas por 48 horas a 35 º C y contar las colonias. El total de colonias dividido por 2 no debería ser superior a 50.

CARACTERISTICAS FISICAS DEL AGAR STANDARD

1- Debería ser preparado con ingredientes que tengan las características anteriormente mencionadas. 2- El polvo debe ser beige claro o amarillo pálido. 3- El contenido de humedad no debería ser menos del 5 %. 4- Debe ser soluble la solución al 2,35 % al hervir 1 a 2 minutos. Esta solución debe ser clara y libre

de precipitados. 5- Debe tener un pH final 7 ± 0,2 a 25 ºC, después de ser esterilizado a 121 por 15 minutos. 6- No debe presentar precipitado cuando es mantenido a 50-56 ºC, por 2 hrs. después de ser

esterilizado.





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ANEXO Nº 4

RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOSTécnica Recuento en placa siembra en profundidad

1 mL

HOMOGENEIZADO:

450 mL de Solución de Butterfield 9 mL de

Solución de Butterfield 50 g muestra

Dil 10 -1 10 -2 10 -3

SIEMBRA :

Agar Plate Count

INCUBACION: 35 ºC +-0,5ºC por 48 horas

LECTURA PLACAS : Leer placas Petri según anexo Nº 5

CALCULO : Realizar los cálculos según anexo Nº 5

INFORME : Informar como Nº de UFC/g o mL de producto

1 mL 1 mL

1 mL 1 mL 1 mL

1 mL





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ANEXO Nº 5 LECTURA, REGISTRO, CALCULO E INFORME DE RESULTADOS RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS

Lic. T.M. Mariana Fernández C. Instituto de Salud Pública de Chile 1-Placas normales

25-250 colonias CASOS LECTURA Y REGISTRO CALCULO Y REGISTRO INFORME

ufc /g o mL

a) Cuando los recuentos de los duplicados de placas de sólo una de las diluciones caen dentro del rango 25-250 colonias

Ej 2 10¯²= 301 y 289 10¯³= 244 y 232 Ej 2 10¯²= 301 y 289 10¯³= 203 y 199 Ej 3 10¯²= 301 y 289 10¯³= 210 y 220

-Utilizar para el cálculo los recuentos obtenidos en placas normales.

-Si el tercer dígito es 6 , 7, 8 , o 9 adicionar

1 unidad al segundo dígito Ej 1 = 238 x 1000 = 238.000

= 240.000 -Si el tercer dígito es 1, 2 , 3 , o 4 sólo

considerar los dos primeros dígitos Ej 2 = 201 x 1000 = 201.000

= 200.000 - Si el tercer dígito es 5, agregar 1 unidad al

segundo dígito si éste es impar y mantener el segundo dígito si éste es par Ej 3 = 215 x 1000 = 215.000

= 220.000

2,4 x 10 ^5 2,0 x 10 ^5 2,2 x 10 ^5





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Continuación CASOS LECTURA Y REGISTRO CALCULO Y REGISTRO INFORME

ufc /g o mL

b) Si los recuentos de las placas de dos diluciones consecutivas caen dentro del rango 25 - 250 colonias

Ej 10¯²= 232 244 10¯³= 33 28

Calcular según la siguiente fórmula:

N= ____________Σ C___________ [ ( 1x n1 ) + ( 0,1 x n2 ) ] x d

N= 232 + 244 + 33 + 28

[ ( 1x 2 ) + ( 0,1 x 2 ) ] x 0,01 N= 24.409

2,4 x 10^4

c) Cuando los recuentos de las

placas en duplicado caen tanto dentro como fuera del rango 25 - 250 colonias , usar sólo aquellos recuentos que estén dentro de este rango .

Ej 10¯²= 238 263 10¯³= 15 17

=238 x 100 = 23.800 =24.000

2,4 x 10^3

N =Número de colonias / g o mL Σ C = Suma de todas las colonias contadas en todas las placas n1 =Número de placas contadas de la menor dilución n2 =Número de placas contadas de la dilución consecutiva d =dilución de la cual fue obtenido el primer recuento





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2- Casos especiales CASOS LECTURA Y REGISTRO CALCULO Y REGISTRO INFORME

ufc / g o mL a) Placas sobrepobladas

( > 250 colonias ) 1- Mas de 250 colonias y disponga

de placas normales > 250 MNPC

(RPES)

2- Si no dispone de placas normales en las diluciones sembradas y las placas sembradas presentan mas de 250 colonias contar las mas cercanas a 250 :

a) < 10 colonias / cm ². b) > 10 colonias / cm ² c) >100 colonias / cm ².

Contar 6 cuadrados consecutivos horizontal y 6 consecutivos vertical Ej 10¯³ horiz.5, 7, 8, 3, 5, 6 Vert. 6, 7, 3, 4, 4, 5 Contar las colonias en cuatro de éstos cuadrados Ej 10¯³ 77 , 46 , 38 , 67 Registrar como >100/cm ² Ej 10¯² MNPC 10¯³ >100 col / cm ².

5+7+8+3+5+6++6+7+3+4+4+5=63 63 / 12 x 65*x 1000 = 341000 77+46+38+67 = 288 288 / 4 x 65*x 1000 = 3705000 > 100 x 65*x 1000 = > 6.500.000

3,4 x 10^5 (RPES) 3,7 x 10^6 (RPES) >6,5 x 10^6 (RPES)

* Basado en un área de 65 cm² ( 9 cm de díámetro.) MNPC = Muy numeroso para contar RPES = Recuento en placa estimado





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Continuación. CASOS LECTURA Y REGISTRO CALCULO Y REGISTRO INFORME

ufc / g o mL b) Todas las placas con

menos de 25 colonias

Placas de las diluciones sembradas presentan menos de 25 colonias cada una .

Ej 10¯² 10 y 15 10¯³ 3 y 5

< 25 x el recíproco del factor de dilución menor

< 2,5 x 10^3 (RPES)

c) Placas sin desarrollo de colonias

Ninguna de las placas presenta desarrollo de colonias

Ej 10¯² 0 y 0 10¯³ 0 y 0

< 1,0 x por el recíproco de dilución menor < 2,5 x 10^3 (RPES)

d) Crecimiento invasivo Tipos de crecimiento invasivo : a) Colonias en cadenas b) Colonia entre el agar y fondo de

la placa Petri c) Colonia en una película de agua

en el costado o en la superficie del agar

Sólo contar sí : - El área invadida no

excede la mitad de la placa.

- Si las colonias están bien

distribuidas fuera del área invadida.

- Si no , registrar como

crecimiento invasivo (CI )

Crecimiento Invasivo





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Continuación CASOS LECTURA Y REGISTRO CALCULO Y REGISTRO INFORME

ufc / g o mL e) Accidente de

laboratorio o inhibidores de crecimiento bacteriano

Accidente de laboratorio : - Presencia de contaminación u

otra condición insatisfactoria. - Presencia de inhibidores

bacterianos

Especificar Cuando las placas no tienen

crecimiento o tienen proporcionalmente menos crecimiento en las diluciones mas bajas

Accidente de laboratorio No informar hasta confirmar su presencia

REF: Standard Methods for the Examination of Dairy Products.15 º ed. 1992. (Para cálculo de resultados)





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ANEXO Nº 6 TABLA DE DILUCIONES SEGÚN ANÁLISIS REALIZADO EN EL LAB 346

Los análisis que aparecen marcados en negrita, están estipulados en el Reglamento sanitario de los Alimentos

Suubgrupo Reglamento

CLAVE RTO AEROBIOS MESOFILOS (RAM)

RTO O NMP S. aureus RTO MOHOS Y LEVADURAS

Agar Plate Count. 1 mL en profundidad en placas en duplicado de cada dilución

RTO : Agar Baird Parker 0,3 - 0,3 y 0,4 mL sembrado en 3 placas en superficie NMP serie 3-3-3-: Caldo soya tripticasa con 10 % NaCl 1% piruvato de sodio. 1 mL en cada tubo de cada dilución

Agar OGY 1 mL en profundidad en placas en duplicado de cada dilución

1.1 Leche cruda 2 placas dil 10-3 y 10-4

No No

1.2 Leche y crema pasteurizada

2 placas dil 10-2 y 10-3

Rto dil 10-1

No

1.3 Leche y crema en polvo

2 placas dil 10-2 y 10-3 NMP dil 10-1, 10-2 y 10-3

No

1.4 Leche y crema UHT (previa incubación a 35 ºC por 10 días)

2 placas directo No

1.5. Leche evaporada y crema esterilizada

No No No





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1.6 Leche condensada azucarada y manjar (dulce de leche)

No No 2 placas dil 10-1 y 10-2 marcadas con rojo

1.7 Yogurt y productos lácteos fermentados o acidificados


1.8 Postres lácteos envasados no acidificados


Rto dil 10-1 2 placas dil 10-1 y 10-2 marcadas con rojo

1.9 Quesillo Queso fresco chacra y queso de suero

No Rto dil 10-1 No

1.10 Queso madurado y rallado

No Rto dil 10-1 No

1.11 Queso no madurado, queso suave y queso crema

No Rto dil 10-1 No

1.12 Queso procesado (fundido y en polvo)


Rto dil 10-1 No

2.1 Helados base leche simples

2 placas dil 10-2 y 10-3 Rto dil 10-1 No

2.2 Helados base leche complejos con otros ingredientes


2.3 Helados de agua

No No No

2.4 Mezclas para helados deshidratadas

2 placas dil 10-2 y 10-3 No No

3.1 Mantequilla y margarina






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4.1 Caldos, sopas, cremas y mezclas deshidratadas instantáneas

No Rto dil 10-1 No

4.2 Caldos, sopas, cremas y mezclas deshidratadas que requieren cocción

No Rto dil 10-1 No

4.3 Mezclas en seco de uso instantáneo (Refrescos, jaleas, gelatinas, budines, cremas)


4.4 Mezclas en seco que requieren cocción (budines, flanes)


5.1 Harinas y almidones


5.2 Pastas frescas


5.3 Fideos y pastas rellenas desecadas

No Rto dil 10-1 2 placas dil 10-1 y 10-2 marcadas con rojo

5.4 Cereales para desayuno


6.1 Azúcar


6.2 Miel

No No No

7.1 Productos de cacao y chocolate

No No No





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7.2 Confites de azúcar y frutos secos


8.1 Pan y masas horneadas sin relleno


8.2 Masas horneadas con relleno y/o cobertura


8.3 Productos farináceos para cóctel (snacks)


9.1 Leches en polvo , fórmulas para lactantes, productos en base a cereales y preparaciones infantiles


No

9.2 Alimentos y fórmulas de uso infantil esterilizadas

No No No

9.3 Preparaciones infantiles listas para consumo que requieren calentamiento


NMP Líquidas: Directo, 10-1 y 10-2 Sólidas: dil 10-1, 10-2 y 10-3

No

9.4 Formulas lácteas con cereales


NMP Líquidas: Directo, 10-1 y 10-2

No

10.1 Carne de res cruda






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10.2 Carne de ave cruda


10.3 Cecinas cocidas


10.4 Cecinas crudas frescas y hamburguesas


10.5 Cecinas crudas maduradas

No Rto dil 10-1 No

10.6 Cecinas crudas acidificadas


11.1 Moluscos bivalvos frescos


11.2 Pescados y mariscos crudos congelados


No

11.3 Pescados y mariscos precocidos o cocidos congelados


No

11.4 Pescados y mariscos ahumados


No

12.1 Huevo pasteurizado, líquido, congelado, deshidratado


12.2 Huevo fresco


13.1 Mayonesa y otras salsas en base a huevo






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13.2 Ketchup, salsa y condimento de mostaza, salsa de tomate pasteurizada y/o preservada, salsa de ají y aderezos


13.3

Especias y condimentos 2 placas dil 10-3 y 10-4 No 2 placas dil 10-1 y 10-2 marcadas con rojo

14.1

Frutas y verduras frescas No No No

14.2

Frutas y verduras congeladas 2 placas dil 10-2 y 10-3 No No

14.3

Frutas y verduras desecadas o deshidratadas


14.4

Frutas y verduras en vinagre, aceite, salmuera o alcohol, productos fermentados


14.5

Mermeladas, jaleas, crema de castañas, fruta confitada, preparados de frutas y verduras (incluida la pulpa)


15.1 Comidas y platos preparados listos para consumo


15.2 Comidas y platos preparados que necesariamente requieren cocción

No Rto dil 10-1 y 10-2 No





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16.1

Bebidas analcohólicas carbonatadas 2 placas directo dil 10-1 2 placas dil 10-1 y 10-2 marcadas con rojo

16.2

Bebidas analcohólicas no carbonatadas (zumos y néctares pasteurizados y productos concentrados en su envase original)

* 2 placas dil 10-1 y 10-2 No No

16.3

Agua potable, aguas minerales y hielo

2 placas directo y dil 10-1 Rto directo y dil 10-1 No

16.4 Zumos, nectares y bebidas a base de frutas y verduras no pasteurizados

* 2 placas dil 10-2 y 10-3 ( No * 2 placas dil 10-1 y 10-2 marcadas con rojo

17.1

Café y sucedáneo de café No No No

17.2

Té y hierbas para infusiones 2 placas dil 10-1, 10-2 y 10-3 No No





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OTROS TIPOS DE MUESTRAS, NO ESTIPULADOS EN EL REGLAMENTO SANITARIO CLAVE RTO AEROBIOS MESOFILOS

(RAM) S. AUREUS RTO MOHOS Y LEVADURAS

Agar Plate Count 1 mL en profundidad en placas en

duplicado de cada dilución

RTO : Agar Baird Parker 0,3 - 0,3 y 0,4 mL sembrado en 3 placas en superficie NMP serie 3-3-3-:Caldo soya tripticasa con 10 % NaCl 1% piruvato de sodio

1 mL en cada tubo de cada dilución

Agar OGY 1 mL en profundidad en placas en duplicado de cada dilución

Leche materna 2 placas dil 10-2 y 10-3 Rto directo

No

Agua de diálisis

2 placas directo, dil 10-1 y 10-3 marcadas con azul e incubadas a 25 ºC 2 placas directo, dil 10-1 y 10-3 marcadas con negro e incubadas a 35 ºC

Rto directo 2 placas directo, dil 10-1 y 10-3 marcadas con rojo

Aguas contaminadas

2 placas directo, dil 10-1 y 10-3 Rto directo No

Intoxicaciones

Según tipo de muestra Rto dil 10-1, dil 10-3 y dil 10-5

2 placas dil 10-1 y 10-2 marcadas con rojo

* En las muestras que han sido tamponadas con buffer pH 7, para realizar la dilución 10-1 es necesario tomar 2 mL de muestra diluida 1:2 y agregar a un tubo con 8 mL de agua pertonada 0,1

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PROCEDIMIENTO RECUENTO AEROBIOS EN PLACA · PDF fileFecha emisión: Agosto de 2002 Revisión: 9 PROCEDIMIENTO RECUENTO AEROBIOS EN PLACA METODO BAM ONLINE 2001 Fecha