Profesor: Sr. Claudio Berrios

Integrantes: - Natalia Hormazábal Espinoza

- Camila Marambio

- Paula Soto Varas

Fecha: 11/04/2011

Electroforesis en gel

agarosa para DNA

Biología celular

Resumen

La electroforesis separa el DNA mediante distintos procesos que depende de

distintas variables como la carga y masa. Los fragmentos de DNA están cargados

negativamente debido al grupo fosfato por esa razón migran hacia el polo positivo

y los fragmento más grandes van quedando atrás y para poder visualizar cada

secuencia de DNA estas se tiñe con un color fluorescente, el proceso de

electroforesis está incluido en el método southern blot, llamado asi en memoria de

su creador Edward southern, esto permitió estudiar el DNA y poder aplicarlo en la

medicina como por ejemplo: en pruebas de DNA (huella digital), detectar

cancereso virus y mutaciones en el genoma humano, entre otros.

Proceso de electroforesis

En primer lugar se extrae el DNA y luego se corta con una enzima de restricción.

La electroforesis se encarga de separar las moléculas tales como: las proteínas, el

DNA, RNA, entre otras. Utilizando acrilamida (agarosa), que actúa como un filtro

separando las moléculas según el tamaño y la carga neta que tengan.

En el caso del DNA el grupo fosfato es el que está cargado negativamente, esto

hace que los fragmentos de DNA se vallan hacia el polo positivo (ánodo) durante

la electroforesis.

Al separar los fragmentos de DNA por electroforesis, la velocidad y resolución será

regulada por la concentración de acrilamida (agarosa) que hay en el gel por el

voltaje que será empleado en la electroforesis.

La acrilamida o agarosa que se encuentra en el gel y el gel está en la membrana

que funciona como un filtro en donde los fragmentos de DNA de menor tamaño se

dirigen más rápido hacia el ánodo que los de mayor tamaño.

Luego de la electroforesis el DNA se desnaturaliza y es transferido a la superficie

de una membrana de nylon y se realiza una copia (blot). A este método de

desnaturalización y copia se le conoce como sourthen blot en memoria del creador

de este método Edward Southern.

Después pueden visualizarse marcando con colorantes fluorescentes, y haciendo

un análisis comparativo con otras concentraciones ya conocidas. Estos colorantes

actúan mediante inserción entre los pares de bases que forman el DNA. Y este se

podrá visualizar como una especie de escalera, por esta razón llamaremos al

DNA, DNA ladder.

Proceso físico-químico

La separación de DNA depende de dos variables: carga y masa, la corriente

eléctrica de un electrodo atrae las moléculas y el otro electrodo las repele, el gel

actúa como una especie de colador debido a su fuerza de fricción. El número de

moléculas que pasan por los poros en el campo eléctrico dependerá de distintos

factores como por ejemplo:

- hidrofobicidad de las muestras.

- el tamaño y la forma que tengan las moléculas.

- fuerza del campo.

- temperatura y fuerza iónica de la solución.

Para entender mejor la la separación de las moléculas que están cargadas en la

electroforesis en gel, se puede explicar con ecuaciones sencillas. Cuando en los

electrodos se agrega o aplica tensión se forma una gradiente de potencial la cual

se puede expresar de la siguiente forma:

E = V/d

V: tensión aplicada medida en voltios.

d: distancia de los electrodos medida en cm.

E: gradiente de potencial.

Cuando se aplica E, en la molécula se genera una fuerza y esta se puede explicar

mediante otra ecuación

F = Eq

“q” corresponde a la carga de la molécula medida en culombios y la ecuación en si

corresponde a la fuerza que empuja a la molécula hacia un electrodo medida en

culombios. También existe una fuerza de fricción, y esta hace demorar el

desplazamiento de las moléculas que están cargadas, esta fuerza de fricción está

relacionada con los siguientes factores:

- viscosidad del tampón (donde se encuentra la solución de agarosa).

- tamaño del lugar en donde se produce la electroforesis.

- forma de la molécula.

La velocidad de una molécula con carga estará relacionada con la gradiente de

potencial, la fricción de la molécula y la carga que esta tenga

Ecuación: v = Eq / f

Cuando se aplica una diferencia de potencial, las moléculas de diferente carga

empezaran a fragmentarse. Las moléculas de mayor tamaño se desplazaran más

lentamente debido a su fuerza de fricción.

Mediante esta ecuación que se expresa según la ley de OHM:

R = V / I

l= relación entre intensidad

v= tensión

R= resistencia

Esta ecuación explica que para una resistencia (R) se puede acelerar la

electroforesis aumentando la tensión (v) y esto llevara también a un incremento

de la corriente. Pero esto lleva a uno de los principales problemas de la

electroforesis, que es la producción de calor, sus consecuencias son:

- ensanchamiento de las muestras de DNA.

- inestabilidad de las muestras. Como son sensibles al calor, esto podría ocasionar

por ejemplo la desnaturalización de DNA.

- se reduce la resistencia ya que disminuye la viscosidad del gel.

- Formación de corrientes de convección.

Aplicaciones de electroforesis el gel agarosa (southern blot)

La técnica southtern blot es la técnica más utilizada hoy en día en los laboratorios

de investigación aunque requiere de mucho tiempo y de tejidos frescos para

analizar el DNA, se utiliza para detectar el virus del papiloma humano, en donde

se compara con diferentes muestras obtenidas de otros laboratorios. Esto consiste

en la extracción de DNA que luego se separa según su tamaño en un gel agarosa.

Y esto da a conocer el número total de copias de DNA viral por célula. También

sirve para detectar otro tipo de virus.

Se pueden detectar mutaciones en los genes, anomalías cromosómicas de un

paciente como por ejemplo el síndrome de Down, para detectar de donde proviene

el cromosoma mutado (materno o paterno) al realizar esta técnica se comprobó

que entre el 90-95 % resultan de la no disyunción germinal materna, también esta

técnica es muy utilizada en el diagnóstico prenatal de enfermedades hereditarias.

Para analizar la huella genética (pruebas de DNA) entre personas se utiliza el

método southern blot, para comprobar si dos personas pertenecen al mismo

grupo familiar ya que tendrán gran parte de su secuencia en común.

Bibliografía

1.- Duina, P.D. Electroforesis del DNA en geles de agarosa. Protocolos de

laboratorio UEG. 4. 1-2. (2009).

2.- M. Somma, M. Querci. Electroforesis en Gel de Agarosa. Sesión n°5. Electroforesis en Gel de Agarosa. Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos.12. 3-6. (1997).

3.- William J.L. Aplicaciones clínicas. Embriología humana. Tercera edición. 518. 23-25. (2003).

4.- ¿Existe una relación entre papiloma virus y cáncer de cuello uterino? .Revista medicina. Buenos Aires. Volumen 51 n°1. 101. 84. (2003).

5.- José L.C. Hibridación de southern. Texto ilustrado de biología molecular e ingeniería genética. 172. 171. (2006).

6.- Concepción P.B. y Claudia P.U. Electroforesis en geles de agarosa. Prácticas de biología molecular. 100. 24-25. (2005).

 

Anexos

Migración de las

moléculas del polo

negativo hacia el polo

positivo y separación de

acuerdo al tamaño

molecular.

Grafico del

tamaño del

logaritmo

frente al

logaritmo de

la movilidad.

DNA ladder

Cargas de las muestras en gel agarosa para realizar la electroforesis