otavirus, CONSIM/Border, I BR

CriptosporidabhCoccidios

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Procesos digestivos enrumiantes: toma de muestras

Muchas veces se puede hacer un diagnósticopresuntivo de la etiología de un proceso digestivo apartir de los signos clínicos, edad, situación vacunal,historial de la explotación, epidemiología del procesoy datos de la necropsia.Sin embargo, en ocasiones existen variaciones en lossíntomas clínicos observables debidos a un patógeno,o bien concurren varios patógenos, por lo que pararealizar un diagnóstico correcto tenemos que acudir allaboratorio.

E n este trabajo se orienta la to-

ma de muestras en procesosdigestivos y se comentan algu-nos de los resultados que se

pueden obtener. En todos los casos, sedebe considerar que no todos los la-boratorios utilizan las mismas técni-cas, por lo que conviene confirmarsiempre las muestras a enviar.

Es fundamental enviar la historiaclínica e informar de la edad de losanimales muestreados.

EtiologíaEn rumiantes antes del destete, la ma-yoría de las diarreas infecciosas seproducen por Escherichia coli,

Clostridium perfringens y

Criptosporidium parvum. Tras el deste-te, la mayoría de las diarreas se produ-cen por E. coli, Clostridios yCoccidios.

Rotavirus, Coronavirus, BVD,(Border Disease en pequeños rumian-tes) e IBR en bovino, también sonmuy frecuentes y muy importantes,especialmente en el caso del ganadovacuno. De hecho, en animales leche-ros con altas tasas de reposición (tan-to en bovino como ovino-caprino)existe poca "inmunidad de rebaño" yson frecuentes los virus. Por el contra-rio, en vacas y ovejas de carne son in-frecuentes.

Salmonella spp tiene una prevalenciamucho menor, mientras que no estáclaro cuál puede ser el papel de otrosagentes como Clostridium dzfficile,Candida albicans y los integrantes delos géneros Giardia, Carnpylobacter,Chlamydia y Yersinia, que sí se handescrito como patógenos en otras es-pecies, incluyendo el hombre. Aún así,en el laboratorio de los autores ya tra-bajan rutinariamente con alguno deestos patógenos.

En animales adultos, la preocupa-ción fundamental deben ser los para-

1. Albizu y R. Baselga

Exopol. Autovacunas yDiagnóstico.San Mateo (Zaragoza)

Figura 1. Edades más probables en las que aparecen las diarreas producidaspor los diferentes patógenos en ovino-caprino y bovino.

24 horas

C. p ens

5 días 3 semanas

olibaW_

5 semanas 10 semanas Recría Adultos

II

',Parásitos intestinales

erlirr"11

diatubercul

22 Mundo Ganadero Julio/Agosto '09

RUMIANTES MUNDO VETERINARIO

N

rro;01. Cryptosporidium parvum. Frotis a partir de un hisopo rectal de bovino lactante con diarrea. Se realizó una tinción de Ziehl Neelsenmodificada. Se observan los ooquistes del parásito en color rosa intenso sobre un fondo verdoso. Observación en microscopía de campoclaro x1000. Autor: Exopol.Foto 2. Intestinos delgados de dos corderos lactantes de 10-15 días con problemas digestivos. En el intestino superior se observa unaenteritis catarral con ligera inflamación, y en la cual se observaron abundantes criptosporidios, no aislándose ningún agente bacteriano enel cultivo microbiológico. En el intestino inferior se observa un contenido negruzco, y tras el estudio microscópico, el intestino no mostrabalesiones inflamatorias, ni necróticas, sugiriendo que el origen del contenido hemorrágico procedía de tramos anteriores, probablementeabomasal. En este intestino tampoco se aisló ningún agente bacteriano, observándose solamente algunos cryptosporidios. Autor: Exopol.-911Foto 3. Cepa de Esche richia coli crecida en Agar MacConkey a 37 °C 24 h. Obsérvese el color rosa de las colonias debido a la fermentaciónde la lactosa y el aspecto seco. Autor: Exopol.Foto 4. Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis. Tinción Ziehl-Neelsen de frotis de intestino de una cabra. Microscopia decampo claro 1000x. Autor: Exopol.Foto 5. Intestino de cordero de cebo con hemorragias multifocales. Microscópicamente, se observa una moderada enteritis crónica confenómenos degenerativos y proliferativos en las criptas y vellosidades, asi como abundantes coccidios parasitando el epitelio intestinal, locuales se corresponden con los nodulillos observados macroscópicamente, y extensas hemorragias localizadas en la submucosa. Autor:Exopol.Foto 6. Ooquistes de coccidios sin esporular, observados en un estudio coprológico a partir de heces. Se realizó una técnica de flotacióncon sulfato de zinc. Observación en microscopía de campo claro x400 en fresco.

isismemiseamener -momee

Isitos y la Paratuberculosis, aunque elblandeo o la diarrea puede ser un sín-toma inespecífico de otros procesos.

En la mayoría de estos casos, las le-siones microscópicas asociadas a losdiferentes patógenos son críticas enlos problemas digestivos.

Es normal identi ficar la presenciade más de un patógeno en las mues-tras recibidas y corresponde al veteri-nario llegar al diagnóstico definitivocon los datos de que dispone de la ex-plotación. En estos casos el laborato-rio debe asesorar para poder discernirla causa principal.

Hay que prestar también atención alas diarreas que tienen una etiologíade tipo no infeccioso: meteorismo,

acidosis ruminal, úlceras, desplaza-miento abomasal, alteraciones de floraintestinal, etc.

Toma de datosConviene tomar los datos clínicos decualquier proceso, porque compararlas características del mismo con losresultados del laboratorio, el resultadodel tratamiento, los cambios de mane-jo y la evolución en el tiempo es, sinninguna duda, una fuente fundamen-tal de conocimiento.

La edad a la que los lactantes se venafectados por la diarrea por primeravez es una indicación de la causa. Ladiarrea que aparece al primer o segun-do día de nacimiento probable- »

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Foto 7. moniezia expansa en intestinodelgado de un ovino. Autor: Exopol.

—7rFoto 8. Rotavirus detectado en células de

intestino delgado de bovino lactantemediante inmunoperoxidasa indirecta. Seempleó un anticuerpo monoclonalespecifico de grupo (reconoce la proteínaVP6, Chemicon). Sustrato AEC en DMF.

io:COntraste Hematoxilina de Mayer. Campoclaro 1000 x. Autor: Exopol.

Foto 9. Asas intestinales de un cabrito dedos meses de edad que presentaba uncuadro diarreico y al que se le diagnosticó

, Coccidiosis. A través de la pared intestinalI! se observan lesiones nodulares

blanquecinas asentadas en la mucosa delintestino delgado, provocadas por elparásito. Autor: Exopol.

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Tipificación de Escherichia coliLa tipificación de Escherichia coli se puede hacer comparando el ADN mediantetécnicas moleculares o comparando sus características fenotípicas.

En la Figura 2 se ve que los aislamientos de los lactantes 2, 3 y 4 pertenecen a lamisma cepa y el 1 y el 5 difieren de los otros y entre sí, por lo que pertenecen a cepasdistintas. En el eje de abscisas se indican unos valores que van del 50 al 100%. Un100% indica que las cepas que se comparan han dado el mismo resultado en todas laspruebas realizadas. Como seres vivos que son, siempre existe una variabilidad, aunquelas cepas aisladas procedan del mismo clon (sean iguales), por eso se utiliza un puntode corte algo inferior, pero muy exigente; en este caso un 98% de similitud. El punto decorte se representa en la línea de puntos. Los aislamientos que se agrupan (líneasverticales) a la derecha de la línea de corte, son iguales entre sí y pertenecen a lamisma cepa, mientras que los que se agrupan a la izquierda son diferentes.

La tipificación, permite seleccionar las cepas responsables del problema en las queposteriormente se puede determinar los factores de virulencia, valorar la sensibilidadantibiótica, calcular la concentración mínima inhibitoria frente a diversos antibióticos,o con las que elaborar autovacunas, incluyendo una o más cepas. Del mismo modo, sepuede comparar cepas aisladas en diferentes naves de la misma explotación, endistintas explotaciones, cepas obtenidas en diferentes fechas o momentosproductivos, etc., y así ayudar a comprender la epidemiología de muchos procesoscausados por E. coli.

98% similitud N,

07 0.8 ›09

Figura 2

CHay otros factores como unencalostramiento deficiente

o el agua de mala calidad quefavorecen la aparición de diarreas

mente está producida por E. coli o C.perfringens B y C. La Coccidiosis surgea partir de los 15-30 días de edad,mientras que el Criptosporidio es mássevero en animales de menos de 1mes. En la Figura 1 se detallan lasedades aproximadas en que aparecen

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lactärte I

LaCtirto 4

LActaria 2

lactwle 3

lactarlo 5

las diferentes diarreas. El aspecto delas heces y las lesiones observadas enla necropsia también ayudan a identi-ficar el origen de las diarreas.

A menudo, cuando se produce dia-rrea en los lactantes, toda la pariderase ve afectada, porque los procesos

Foto 11. Ternero lactante con unaabomasitis hemorrágica y ulcerativa porClostridium perfringens tipo A.Microscópicamente, se observaronlesiones severas en el abomaso, mientrasque el intestino delgado no mostrabalesiones significativas, siendo elcontenido hemorrágico observadomacroscópicamente procedente detramos anteriores, probablemente delabomaso.De las lesiones, se aisló el Clostridiumdeterminándose su tipo de toxina, yencontrándose que sólo tenia la toxinaalfa, siendo negativo para las toxinas betay epsilon (toxinas de los C. perfringenstipo B, C). C. perfringens tipo A producede forma relativamente esporádicaprocesos digestivos caracterizadosprincipalmente por una abomasitishemorrágica y ulcerativa.Autor: Exopol.

Coccidios Si

son infecciosos y contagiosos. LaClostridiasis es una excepción y nor-malmente sólo aparecen afectados al-gunos animales, que a menudo son losde mayor tamaño y más sanos. Las ba-jas temperaturas y la falta de leche (hi-poglucemia), un deficiente encalostra-miento, agua de mala calidad,deficiencias vitamínicas, etc., favore-cen la aparición de diarreas. En proce-sos sobreagudos producidos por toxi-nas de E. coli o C. perfringens,normalmente no se observa diarrea,sino bajas súbitas o animales con sin-tomatología nerviosa.

Técnicas diagnósticasLa toma de muestras debe estar orien-tada por cada laboratorio ya que no to-dos cubren todas las posibilidades, niemplean las mismas técnicas. Estopuede ser un inconveniente porquecomplica el envío de muestras y la in-terpretación de los resultados, pero almismo tiempo amplia el panel de pató-genos y de posibilidades al alcance delveterinario. Se han puesto a punto y sehan publicado muchas técnicas dife-rentes, pero muchas no están disponi-bles comercialmente. El Cuadro I in-dica las técnicas habitualmentedisponibles para el diagnóstico de losprocesos diarreicos en rumiantes paracada uno de los principales patógenosimplicados

Las técnicas de laboratorio se divi-den esencialmente en directas, en lasque se aísla (cultivo) o identifica el pa-tógeno fundamentalmente a través desus antígenos (IPX/IF) o su ADN(PCR), o indirectas donde se detecta larespuesta humoral (anticuerpos, sero-logia) o celular (como por ejemplo enla Tuberculosis) del organismo frenteal patógeno. Lógicamente algunas téc-nicas como el aislamiento viral o inclu-so la mayoría de los PCR no son técni-cas de rutina. En problemas digestivoslos diagnósticos indirectos son pocoútiles salvo frente a Paratuberculosis.

Con todas las técnicas conviene re-cordar lo dicho en el apartado anteriorsobre la calidad de una técnica diag-nóstica.

Toma de muestrasLa mejor muestra es el paquete intes-tinal de uno o varios animales en- »

Foto 10. Cepa de Clostridium perfringensaislado de intestino delgado de un ovinocon síntomas de enterotoxemia.Crecimiento en agar sangre de carneroen atmósfera anaerobia a 37 °C durante48 h. Obsérvese la doble hemólisis querodea a las colonias, típica de Ci.perfringens. Autor: Exopol.

Cuadro I. Técnicas habitualmente disponibles para el diagnóstico

Eschericim coli

Sí

SalmonellaParatuberculosis Si

NDC' Sí

Clostridium :ME Sí

Toxinas

Chlamydia sí

NDC--alumotmemw-- To-d-c-1119

Criptosporidium Sí

IPX/IF. Inmunoperoxidasa/Inmunofluorescencia; Cultivo. Casi todos los virus se pueden cultivar pero nose hace como rutina; Serologia. Se pueden buscar anticuerpos en madres y en lactantes.

NDC. No disponibles comercialmente.

de pr • iarreicos e es.

1Px/IF PCR Cultivo Serologiacoprologia

Identificaciónmorfológica

Si

Sí

NDC

Vacas

Sí Vacas

Sí si Vacas

La mayoría •Bacterias

VirusBVD/Border

IBR

Coronavirus

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Foto 12. Huevos de nematodos:Strongyloides (larvados) yTrichostrongylidos (blastómeros, nolarvados) observados en un estudio ecoprológico a partir de heces bovinas. Se

realizó una técnica de flotación consulfato de zinc. Observación enmicroscopia de campo claro x400 enfresco. Autor: Exopol. 1

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Toxinotipos de Clostridium perfringensEl número de toxinas producidas por Cl. perfringens es elevado (al menos una docena),pero la clasificación en tipos toxigénicos se hace en base a la producción de lastoxinas mayores: alfa, beta, épsilon e iota (Cuadro II).

En el diagnóstico de Clostridium, el examen anatomopatológico y la anamnesis encampo son muy importantes, siendo con frecuencia el único método utilizado para eldiagnóstico de las enterotoxemias. El diagnóstico definitivo requiere la confirmaciónlaboratorial de un elevado recuento de Cl. perfringens en contenido intestinal y, conmayor utilidad aún, de la presencia de toxinas en dicho intestino o en las heces.

Cuadro II. Clasificación de toxinotifx) CL perfringens

Toxinas mayoresToxinotiposCl. perfringens alfa beta épsilon iota

Tipo A ++

-91MTipo B

Tipo C

++

Tipo D

Tipo E

++

CCLa toma de muestras debeestar orientada por cada

laboratorio ya que no todoscubren todas las posibilidades

fermos con síntomas iniciales, no tra-tados, y con menos de 24 horas desdela presentación del cuadro clínico.Obviamente esto es difícil de entradaporque supone sacrificar animales quepueden tratarse. De animales muertostambién se puede obtener mucha in-formación, pero los resultados sonmás difíciles de interpretar por la pro-liferación bacteriana post mortern. Entodos los casos, los órganos deben en-viarse refrigerados y en bolsas indivi-duales.

En el laboratorio, el anatomopató-logo puede valorar las lesiones de laszonas afectadas y tomar las muestrasmás adecuadas para su estudio.

En animales vivos se pueden tomarhisopos rectales y/o heces directamen-te del recto. Además se puede mues-trear más animales con síntomas ini-ciales y sin tratar, y es mucho máseconómico.

Foto 13. Cepa de Sa/mofle/la spp en agarXLD tras 24 horas de incubación a 37 °C.Las colonias presentan color negro en suinterior debido a la producción de H 2S. ig4Autor: Exopol.

En el caso de que se envíen mues-tras para histopatología se deben to-mar varios fragmentos de 1 cm 2 fija-dos con formalina al 10% del colon,ciego, ileon y yeyuno, y por supuestode las lesiones que puedan aparecer.Hay que asegurarse de que la mucosaestá en contacto con la formalina. Siexiste necrosis, hay que enviar tejidonecrosado y el adyacente sin necrosar.Todas las muestras deben ir perfecta-mente identificadas.

Las muestras intestinales se estro-pean con facilidad (autolisan) si noestán fijadas, pero a veces es preferibleque sea el anatomopatólogo en el la-boratorios el que seleccione los trozosa estudiar. •Bibliografía en poder de los autores(exopol@exopol.com )

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