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PRODUCCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE
RESIDUOS DE MANGO (Manguifera indica)
Proyecto de grado
Por
ANGIE PAOLA GARCÍA BARRERO
Presentado a la Facultad de Ingeniería de la
Universidad de los Andes
En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de
INGENIERO QUÍMICO
Departamento de Ingeniería Química
Diciembre 2019
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PRODUCCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE
RESIDUOS DE MANGO (Manguifera indica)
Proyecto de grado
Por
ANGIE PAOLA GARCÍA BARRERO
Presentado a la Facultad de Ingeniería de la
Universidad de los Andes
En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de
INGENIERO QUÍMICO
Aprobado por:
Asesora, Rocío Sierra Ramirez, Ph.D.
Co-asesor, Daniel David Durán Aranguren, M.Eng.
Jurado, Rocío Sierra Ramirez, Ph.D.
Director de departamento, Andrés Gonzalez Barrios, Ph.D.
Departamento de Ingeniería Química
Diciembre 2019
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ABSTRACT Bioethanol production from mango waste (Manguifera indica)
(December 2019)
Angie Paola García Barrero, Universidad de los Andes, Colombia
Advisor: Rocío Sierra Ramirez Ph.D
The production of biofuels from agro-industrial waste is an alternative and attractive option to
reduce economic costs in landfills and environmental concerns due to climate change directly
related to the use of fossil fuels. Mango waste can be used to obtain bioethanol as biomass or
organic raw material for renewable energy. The biochemical transformations necessary to carry
out the production of this substance, will be carried out through the hydrolysis and fermentation
process. First, the acid hydrolysis treatment with sulfuric acid was carried out under two
concentration conditions: 1% and 3% (w / v) H2SO4, the hydrolysis was carried out at a
temperature of 50 ° C for 120 min. Subsequently, the Saccharomyces bayanus fermentation
process was perform under anaerobic conditions, room temperature (18 ° C) and for
approximately 6 days (144 h). The results affected a significant difference between 1% and 3%
acid hydrolysis treatments with a 95% confidence, reaching a hydrolysis efficiency of 23% and
7% respectively. The fermentation was determined through the change of reducing sugars, the
evidence greater consumption over time for samples pretreated with 1%, due to a lower
concentration of sodium sulfate (inhibitor) compared to 3%. Also, through liquid and gas
chromatography, it was concluded that due to the low ethanol proteins, it was not possible to
quantify the ethanol by HPLC, however, it was possible by the GLC method obtaining values
with trends according to the variation of concentration of Sugars in time. Finally, due to
systematic errors, it is prudent to take additional actions to improve experimental techniques
and to add additional steps such as the detoxification of hydrolysis treatments. In addition, in
order to generate greater value for this research, it is proposed to be able to investigate by means
of a robust experimental design, acid hydrolysis to detect 1% w / v sulfuric acid and explore
the obtaining of a pH indicator from a natural dye of mango waste.
Keywords: Mango, waste, hydrolysis, bioethanol, fermentation, HPLC, GLC.
4
RESUMEN Producción de bioetanol a partir de residuos de mango (Manguifera indica)
(Diciembre 2019)
Angie Paola García Barrero, Universidad de los Andes, Colombia
Asesora: Rocío Sierra Ramirez Ph.D
La producción de biocombustibles a partir de residuos de la agroindustria es una alternativa y
atractiva opción para reducir los costos económicos en los rellenos sanitarios y las
preocupaciones ambientales debido al cambio climático directamente relacionado con el uso de
combustibles fósiles. Los desechos de mango pueden usarse para la obtención de bioetanol
como biomasa o materia prima orgánica de energía renovable. Mediante el proceso de hidrólisis
y fermentación se realizan las transformaciones bioquímicas necesarias para llevar a cabo la
producción de esta sustancia. En primer lugar, el pretratamiento de hidrólisis ácida con ácido
sulfúrico se realizó bajo dos condiciones de concentración: 1% y 3% (p / v) de H2SO4, la
hidrólisis se llevó hasta una temperatura de 50 ° C durante 120 min. Posteriormente, se llevó a
cabo el proceso de fermentación por Saccharomyces bayanus en condiciones anaeróbicas,
temperatura ambiente (18° C) y durante aproximadamente 6 días (144 h). Los resultados
demuestran una diferencia significativa entre los tratamientos de 1% y 3% de hidrólisis ácida
con una confianza del 95%, alcanzándose una eficiencia de hidrólisis del 23% y de 7%
respectivamente. La fermentación fue evaluada a través del cambio de azúcares reductores, los
cuales evidencian mayor consumo en el tiempo para las muestras pretratadas con 1% , debido
a una menor concentración de sulfato de sodio (inhibidor) comparado con 3%. También,
mediante cromatografía líquida y de gases, se concluyó que, debido a las bajas concentraciones
de etanol, no fue posible cuantificar el etanol por HPLC, sin embargo, sí se pudo por el método
GLC obteniéndose valores con tendencias acordes a la variación de concentración de azúcares
en el tiempo. Finalmente, debido a errores sistemáticos, es prudente tomar acciones adicionales
para el perfeccionamiento de las técnicas experimentales y en al añadir pasos adicionales como
lo es la detoxificación de los tratamiento de hidrólisis. Además, con el fin de generar mayor
valor a esta investigación se propone poder investigar mediante un diseño experimental robusto,
la hidrólisis ácida a concentraciones cercanas a 1% p/v de ácido sulfúrico y explorar la
obtención de un indicador de pH a partir de un colorante natural de residuos de mango.
Palabras clave: Mango, residuos, hidrólisis, bioetanol, fermentación, HPLC, GLC.
5
TABLA DE CONTENIDO
ABSTRACT ...............................................................................................................................3
RESUMEN .................................................................................................................................4
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................6
LISTA DE TABLAS ..................................................................................................................7
OBJETIVOS ...............................................................................................................................8
OBJETIVO GENERAL .........................................................................................................8
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................8
1. Introducción ........................................................................................................................9
2. Metodología ..................................................................................................................... 12
2.1. Preparación de las muestras ..................................................................................... 12
2.2. Pretratamiento (hidrólisis ácida) .............................................................................. 12
2.2.1. Diseño experimental ........................................................................................ 12
2.2.2. Cuantificación de azúcares reductores (Método de Miller o DNS) ................. 12
2.2.3. Análisis estadístico .......................................................................................... 13
2.3. Fermentación de azúcares ........................................................................................ 13
2.3.1. Cromatografía líquida (HPLC) ........................................................................ 14
2.3.2. Cromatografía de gases (GLC). ....................................................................... 14
3. Resultados y análisis ........................................................................................................ 15
3.1. Hidrólisis ácida ........................................................................................................ 15
3.1.1. Cuantificación de azúcares reductores............................................................. 15
3.1.2. Análisis estadístico ANOVA one-way ............................................................ 17
3.2. Fermentación alcohólica .......................................................................................... 17
3.2.1. Ajuste de pH para la fermentación .................................................................. 17
3.2.2. Evaluación de azúcares reductores en el proceso de fermentación ................. 19
3.2.3. Resultados de la cromatografía líquida (HPLC) .............................................. 20
3.2.4. Resultados de cromatografía de gases (GLC) ................................................. 21
4. Conclusiones y trabajo futuro .......................................................................................... 23
Referencias .............................................................................................................................. 25
Anexos ..................................................................................................................................... 28
6
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Montaje de fermentación alcohólica. ....................................................................... 14
Figura 2. Concentración de azúcares reductores antes y después del tratamiento con 1% (p/v)
de ácido sulfúrico .................................................................................................................... 15
Figura 3. Concentración de azúcares reductores antes y después del tratamiento con 3% p/v de
ácido sulfúrico ......................................................................................................................... 16
Figura 4. Concentración de azúcares reductores para diferentes tratamientos. ....................... 17
Figura 5. Coloración amarilla de la mezcla agua-mango a un pH ácido ................................. 18
Figura 6. Coloración marrón de la mezcla agua-mango a un pH básico ................................. 18
Figura 7. Fermentación de azúcares reductores en el tiempo para los pretratamiento con 1% y
3% de ácido sulfúrico. ............................................................................................................. 19
Figura 8. Cromatogramas de una muestra de fermentación, el primero por detección UV y el
segundo por refractómetro. ...................................................................................................... 20
Figura 9. Tinciones de Gram, a la izquierda una muestra de 100% levaduras y a la derecha
una muestra de fermentación. .................................................................................................. 21
Figura 10. Concentración de etanol (g/L) para los días 2 y 4 de fermentación para los
pretratamiento de 1% y 3% ..................................................................................................... 22
Figura 11. Estándares de fermentación detectados por UV y refractómetro (RI) (Bio-Rad
Laboratories, Inc, n.d.). ........................................................................................................... 29
Figura 12. Método para la cuantificación de etanol en GLC. .................................................. 30
Figura 13. Curva de calibración 1, para el método de DNS con un ajuste de R2= 0.9968. ..... 31
Figura 14. Curva de calibración 2, para el método DNS con un ajuste de R2= 0.9983. .......... 31
Figura 15. Curva de calibración 3, para el método DNS R2= 0.9950. ..................................... 32
Figura 16. Gráfica de comprobación de supuestos de la prueba estadística. ........................... 32
7
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Análisis composicional (%) de cáscara, semilla y cascarilla de mango en peso seco
(Durán Aranguren, 2019). ....................................................................................................... 10
Tabla 2. Ventajas y desventajas de métodos para pretratamiento de material lignocelulósico
(Carrillo-Nieves et al., 2019) ............................................................................................... 28
8
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL Evaluar la capacidad de obtención de bioetanol a partir del tratamiento de residuos de mango.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Determinar el efecto del pretratamiento ácido de residuos de mango sobre la liberación
de azúcares reductores, a dos niveles de concentración de ácido sulfúrico (1% y 3%
p/v).
• Evaluar la concentración de azúcares reductores durante el proceso de fermentación de
los residuos de mango provenientes del pretratamiento ácido.
• Analizar por cromatografía líquida y de gases la producción de etanol en la
fermentación.
9
1. Introducción
Actualmente, existen serias preocupaciones e inquietudes alrededor del uso de los combustibles
fósiles debido su directa relación con el efecto invernadero y el cambio climático global. Estos
fenómenos son causados por el exceso de dióxido de carbono en la atmósfera, producidos
principalmente por centrales generadoras de energía a partir del carbón o automóviles (Kim,
Jang, Park & Um, 2018). En vista de esta problemática, es prudente explorar la posibilidad del
aprovechamiento de la biomasa como potencial generador de energía limpia. De esta forma, la
generación de bioetanol a partir de recursos renovables como desechos orgánicos, representa
una importante oportunidad de producción de bioenergía. La conversión bioquímica de biomasa
en combustible líquido (etanol) puede ser usada como alternativa para la producción de
combustible automotriz, preferiblemente como una mezcla con gasolina, reduciéndose
proporcionalmente, las emisiones de dióxido de carbono a la atmósfera (Kumar, Dheeran,
Singh, Mishra & Adhikari, 2015).
En América del sur, la producción de biocombustibles representa una serie de ventajas debido
a la presencia de suelos ricos en nutrientes, adecuadas condiciones climáticas, disponibilidad
de tierra y mano de obra, en comparación con otros países europeos y Estados Unidos. Brasil
es uno de los contados países que llevan una larga trayectoria, de alrededor de 30 años, haciendo
uso de biocombustibles como bioetanol, obtenido a partir de la caña de azúcar, para el uso de
este como combustible para el transporte. Además de esto, Argentina también se ha destacado
por la producción de biodiesel a partir de semilla de soja. Por otro lado, en Colombia se ha ido
reemplazando gradualmente los combustibles fósiles utilizados en los vehículos que operan en
el país, introduciéndose mezclas de 5% de etanol en gasolina, al igual que de biodiesel
(Cremonez et al., 2015).
Los biocombustibles de primera generación se obtienen de productos agrícolas que tienen un
valor alimenticio, estos se fabrican principalmente, para el caso de bioetanol, a partir del jugo
de caña de azúcar y maíz. Por otro lado, el etanol de segunda generación se obtiene de biomasa
rica en celulosa y hemicelulosa sin valor alimenticio proveniente de desechos orgánicos
(Cavieres Korn, 2008). En Colombia, existe un diverso y potencial conjunto de materia primas
para la producción de etanol tales como la caña de azúcar, la remolacha, café, maíz, algunas
frutas como la piña, banano, mango, pitaya, naranja, gulupa, entre otras. Por lo que, la
producción de etanol de segunda generación a partir de los residuos lignocelulósicos de frutas
representa un gran valor ambiental y social, debido a la gran cantidad de desechos alimenticios
que son generados, se estima que al menos 6.1 millones de toneladas de residuos de fruta y
verduras son producidos al año (Departamento Nacional de Planeación, 2016). Por esto, el
10
adecuado tratamiento y disposición de los residuos, representa un gran desafío y un alto costo
para las plantas de rellenos sanitarios y vertederos (Kim, Jang, Park & Um, 2018).
El mango es una de las frutas más populares y se caracteriza por tener un alto contenido de
azúcares, lo cual hace de este una materia prima valiosa para la obtención de etanol (Li, Yu,
Curran & Liu, 2012). En este orden de ideas, es importante resaltar que el departamento del
Tolima reporta alrededor de 94000 toneladas de mango producidas en el año 2018 (Ministerio
de Agricultura y Desarrollo rural, 2018), representando un 37,5 % de la producción nacional
(Agronet, 2017). En la región, diversas empresas se dedican a la producción de pulpa de mango,
mermeladas, jugos concentrados y otros derivados. Desafortunadamente, alrededor del 70% del
peso del fruto consiste en cáscara, semilla y endocarpio (Ayala, Zabala, 2011), biomasa
lignocelulósica (compuesta de celulosa, hemicelulosa y lignina) que finalmente es desechada
(Kumar, Dheeran, Singh, Mishra & Adhikari, 2015). De acuerdo con investigaciones recientes,
se conoce que estos residuos provenientes del mango como lo son la semilla y la cascarilla de
poseen una gran cantidad de sólidos (~60%), los cuales pueden ser aprovechados para diversos
fines (Durán Aranguren, 2019). La tabla 1. muestra el análisis composicional de residuos de
Manguifera indica
Tabla 1. Análisis composicional (%) de cáscara, semilla y cascarilla de mango en peso seco (Durán
Aranguren, 2019).
A partir de esta información, se sabe que los residuos de mango poseen un contenido de cenizas
significativamente bajo (~2 a 5%), lo cual indica el potencial uso de estos para múltiples
aplicaciones, debido a su alto contenido de sólidos volátiles. Respecto al contenido proteico, se
tienen bajas cantidades (~2 a 5%), por lo que no se esperan efectos negativos significativos
sobre rutas metabólicas de microorganismos tal como la digestión anaerobia en procesos de
fermentación. Por otro lado, la hemicelulosa y celulosa son fuentes para la obtención de
azúcares reductores tales como xilosa, arabinosa, glucosa, manosa y galactosa para fines
fermentativos, mientras que la lignina al no contener carbohidratos no es útil para la producción
de etanol. La pectina contiene propiedades adsorbentes, es decir, proporciona una superficie
11
donde el sustrato puede acumularse y así, brindar un ambiente favorable para el crecimiento de
microorganismos. Por último, la cantidad de extraíbles en los residuos de cáscara y semilla de
mango es considerable, mientras que para la cascarilla la cantidad es mucho menor. Esta
fracción de extraíbles está compuesta de aceites, tintes, sabores y fragancias que les dan
versatilidad y valor agregado a dichos residuos (Durán Aranguren, 2019).
Para el mejor aprovechamiento de los residuos lignocelulósicos es necesaria una etapa de
pretratamiento. El pretratamiento generalmente incluye métodos químicos (ácidos, bases
combinadas con agentes oxidantes, solventes orgánicos, ozonólisis y líquidos iónicos), métodos
físicos, como la variación de temperatura y presión para separar la lignina (irradiación,
molienda, conminución mecánica y extrusión), métodos fisicoquímicos (agua caliente líquida,
hidrotermal, explosión de vapor, explosión de CO2, explosión de fibra de amoníaco) y métodos
biológicos (hongos de podredumbre blanca y hongos marinos) (Carrillo-Nieves et al., 2019).
En la Tabla 1 en Anexos, se muestran las ventajas y desventajas de los diferentes
pretratamientos para el acondicionamiento de materiales lignocelulósicos con el fin de mejorar
la eficiencia general del proceso y hacer que la celulosa y la hemicelulosa sean más accesibles
para el procesos posteriores.
El proceso de conversión de residuos lignocelulósicos en etanol para este proyecto consiste
principalmente en cuatro rutas: (i) hidrólisis ácida de la hemicelulosa y celulosa en
monosacáridos, (ii) separación y obtención de los azúcares en medio acuoso, (iii) fermentación
de azúcares por medio de levaduras, (iv) recuperación del producto. En primer lugar, la
hidrólisis de la biomasa lignocelulósica es un proceso complejo, debido a que esta está
compuesta de una gran cantidad de azúcares como glucosa, xilosa, arabinosa, etc. La hidrólisis
se puede llevar a cabo por medio de ácidos, bases o enzimas (García et al., 2014). Para efectos
de este trabajo, se realizará una hidrólisis ácida con ácido sulfúrico, sustancia ampliamente
usada y reportada en literatura debido a su efectividad (Kumar, Dheeran, Singh, Mishra &
Adhikari, 2015). Por otro lado, a pesar de que la fermentación de azúcares comúnmente se
realiza a través de la levadura Saccharomyces cerevisiae ya que esta es conocida por su alta
tolerancia al etanol, rápidas tasas de fermentación, resistencia a la temperatura y a la
concentración del substrato (Choonut, Saejong & Sangkharak, 2014), se usará la especie
Saccharomyces bayanus ampliamente conocida para procesos fermentativos en vinos y
cervezas con características muy similares a la levadura mencionada anteriormente. Se conoce
que, aunque la mayoría de las levaduras toleran un pH entre 3 y 10, resulta favorable un medio
ligeramente ácido con un pH entre 4.5 y 6.5 (Suárez-Machín, Garrido-Carralero & Guevara-
Rodríguez, 2016).
12
El objetivo final de este estudio es evaluar la obtención del etanol a partir de los residuos de
mango pretratados mediante hidrólisis ácida, conocer la viabilidad de su fermentación y
proponer trabajos futuros.
2. Metodología
2.1. Preparación de las muestras
Para la preparación de las muestras de semilla, cáscara y cascarilla de mango, se aplicó el
protocolo NREL, en donde se indica el proceso de secado y molienda. Para ello, se calentaron
las muestras en un horno de convección forzada a 40±3 °C durante 48 horas con el fin de
disminuir la humedad del material a un valor cercano al 10% (Hames, Ruiz, et al., 2008).
Posteriormente mediante un molino de cuchillas se redujo el tamaño de partícula y se cribó por
un tamiz de 1.2 mm.
2.2. Pretratamiento (hidrólisis ácida)
El pretratamiento fue llevado a cabo en frascos ámbar de 1L, en donde se añadieron 5 g de
muestra, mezcla de residuos de semilla (40%), cáscara (40%) y cascarilla (20%) en cada botella
(Durán Aranguren, 2019). Posteriormente, se prepararon las disoluciones a concentraciones de
1% y 3% de ácido sulfúrico (𝐻2𝑆𝑂4) y se calentaron hasta 50°C por 120 minutos en un horno
de convección forzada. Luego, el contenido en cada botella fue filtrado al vacío. Se tomaron
muestras antes y después de los tratamientos para su posterior análisis de azúcares reductores.
2.2.1. Diseño experimental
Se realizó un diseño de experimental con el fin de evaluar la cantidad de azúcares reductores
producidos como resultado del pretratamiento de los residuos de mango a dos niveles: 1% p/v
y 3% p/v de concentración de ácido sulfúrico en 1L de solución. Para ello, se prepararon 8
réplicas para 1 % p/v y para 3% p/v, con un total de 16 experimentos (botellas), manteniendo
constantes las condiciones de temperatura y tiempo de hidrólisis entre tratamientos.
2.2.2. Cuantificación de azúcares reductores (Método de Miller o DNS)
Para la cuantificación de azúcares reductores presentes en las muestras, se implementó el
método de DNS, en donde a través de espectrofotometría se identifican los azúcares simples o
monosacáridos, tales como glucosa y fructosa. El método se basa en una reacción redox que
ocurre entre el reactivo DNS y los azúcares reductores, el 3,5 ácido dinitrosalicílico (DNS) se
reduce al reaccionar (asistido por calor) con los azúcares reductores, lo que da lugar a un cambio
13
en la coloración de la disolución de amarillo a naranja-marrón. Dicha coloración es medida por
medio de espectrofotometría (espectrofotómetro UV-VIS). Para llevar a cabo la reacción es
necesario preparar el reactivo DNS con 0.5 g de ácido dinitrosalicílico, 15 g de tartrato y 0.8 g
de NaOH (Ávila Núñez, Rivas Pérez, Hernández Motzezak & Chirinos, 2012). Posteriormente,
para la calibración, se preparan diferentes soluciones de glucosa analítica, de concentraciones
entre 0.5 g/L y 2g/L. Se añaden en un tubo de eppendorf 0.5 mL del reactivo DNS y 0.5 mL de
la solución de glucosa, luego se llevan a baño seco a 100°C por 5 minutos. Se mide la
absorbancia a 540 nm y se construye la curva de calibración. A partir de la calibración se puede
cuantificar la concentración de azúcares reductores.
2.2.3. Análisis estadístico
El diseño experimental planteado contiene como único factor, la concentración de ácido
sulfúrico evaluada a dos niveles (1% y 3% p/v) y como variable de respuesta, el cambio que
efectúan estos tratamientos sobre la cantidad de azúcares reductores (g/L). De esta forma, se
realizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA one-way) mediante la herramienta
Minitab 18.
2.3. Fermentación de azúcares
Después de realizado el pretratamiento, se procedió a generar un medio buffer con un pH entre
5 y 6 para garantizar la efectividad en el proceso de fermentación, para ello se usó NaOH
(hidróxido de sodio) como sustancia neutralizante. Posterior a esto, la levadura Saccharomyces
bayanus fue activada usando agua tibia e inoculada en cada botella a 20% (p/v). El proceso de
fermentación alcohólica se llevó a cabo bajo condiciones anaeróbicas, temperatura ambiente
(18°C) y sin agitación. El montaje de fermentación (Figura 1.), muestra generación de
condiciones anaerobias mediante el empleo de un tapón de caucho, la adecuada toma de
muestras haciendo uso una aguja de extracción, además de una salida de alivio para el CO2
producido gracias a una trampa de agua. Las muestras se extrajeron cada 2 días durante 6 días
(144 horas de fermentación) con el fin de monitorear la concentración de azúcares y la
producción de etanol. Luego, cada muestra se filtró y se midió por HPLC (Cromatografía
líquida de alta eficiencia), al igual que por cromatografía de gases.
14
Figura 1. Montaje de fermentación alcohólica.
2.3.1. Cromatografía líquida (HPLC)
Con el fin de monitorear el proceso de fermentación se usa la columna Aminex HPX-87H
(columna de hidrógeno) 300 x 7.8 mm, ampliamente usada en la cuantificación de ácidos
orgánicos, carbohidratos y alcoholes, especialmente para obtener perfiles de monosacáridos y
ácidos orgánicos simultáneamente. Para ello, se tienen las siguientes condiciones: fase móvil
de ácido sulfúrico 5 mM, flujo de 0.60 ml/min, una temperatura de 50°C y detectores UV 210
nm y RI. El cromatograma de los estándares para este método se encuentra en Anexos 2.1. Las
muestras se filtraron usando un filtro de jeringa de 0.22 µm.
2.3.2. Cromatografía de gases (GLC).
El método de cromatografía Gas- líquido para la cuantificación de etanol se encuentra presente
en Anexos 2.2. En donde se utiliza helio (He) como fluido transportador de la muestra (carrier),
una columna capilar (tubos capilares con una capa de fase estacionaria) llamada TRB-1 con una
longitud de 30 m y un diámetro interno de 0.32 mm y un detector de ionización de llama (FID).
Las muestras son preparadas de la misma forma que para HPLC, se filtran y se depositan en
viales.
15
3. Resultados y análisis
3.1. Hidrólisis ácida
3.1.1. Cuantificación de azúcares reductores
La cuantificación de azúcares reductores por el método DNS para el nivel de 1% p/v de ácido
sulfúrico, antes y después de este tratamiento es mostrado en la Figura 2, teniendo en cuenta
las curvas de calibración realizadas (Anexos 3.1).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Concentración de azúcares reductores (1% H2SO4)
Réplicas
Co
ncen
tra
ció
n (
g/L
) Antes del pretratamiento
Después del pretratamiento
Figura 2. Concentración de azúcares reductores antes y después del tratamiento con 1% (p/v) de ácido
sulfúrico
La anterior figura, muestra una concentración inicial de azúcares reductores promedio de
0.98±0.18 g/L, provenientes de la mezcla residuos de mango-agua. Esta concentración de
monosacáridos deriva de la composición de extraíbles de los residuos de mango, especialmente
de la semilla y la cáscara que reportan mayor porcentaje. Por otro lado, los azucares resultantes
justo después de la hidrólisis ácida son 1.63±0.14 g/L, lo cual se espera debido a la acción de
iones H+ que rompen los enlaces entre azúcares de la hemicelulosa y la celulosa dando lugar a
mayor cantidad de azúcares reductores como lo son glucosa, xilosa, manosa, entre otros. Así,
se reporta un incremento del 66.5 % con respecto a la cantidad inicial de azúcares y una
eficiencia de hidrólisis de 22.61%. También, se cuantificó el efecto de la hidrólisis ácida a 3%
p/v de concentración del ácido, el cual es reportado en la Figura 3.
16
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Concentración de azúcares reductores (3% H2SO4)
Réplicas
Co
ncen
tra
ció
n (
g/L
)
Antes del pretratamiento
Después del pretratamiento
Figura 3. Concentración de azúcares reductores antes y después del tratamiento con 3% p/v de ácido
sulfúrico
Las concentraciones antes y después del pretratamiento con 3% de ácido sulfúrico (Figura 3),
muestran que el efecto de este sobre los residuos de mango es mucho menor (17.1%) para la
obtención de azúcares reductores en contraste con 1%, dando una eficiencia de hidrólisis de
6.61%. Lo anterior, es claro debido a que a mayor concentración del ácido y un tiempo
significativo de hidrólisis (2h), el tratamiento tiende a ser más agresivo, no sólo
descomponiendo la hemicelulosa y de celulosa en azúcares simples (especialmente xilosa), si
no a su vez, deshidratando estos azúcares produciendo otro tipo de compuestos tales como
furfural e hidroximetilfurfural (HMF), ácido acético, y compuestos aromáticos derivados de la
lignina que pueden inhibir un eventual proceso de fermentación posterior (Carrillo-Nieves et
al., 2019).
A continuación, la Figura 4. muestra comparativamente la efectividad de estos dos niveles de
tratamiento de residuos de mango, en donde se muestra claramente una diferencia entre ambos
y una mayor efectividad para el pretratamiento con 1% p/v de ácido sulfúrico.
17
AP1% DP1% AP3% DP3%
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Concentración de azúcares reductores
Tratamiento
Co
ncen
tra
ció
n (
g/L
)
Antes del pretratamiento
(1% H2SO4)
Después del pretratamiento
(1% H2SO4)
Antes del pretratamiento
(3% H2SO4)
Después del pretratamiento
(3% H2SO4)
Figura 4. Concentración de azúcares reductores para diferentes tratamientos.
3.1.2. Análisis estadístico ANOVA one-way
Los resultados estadísticos del ANOVA one-way cumplen con los supuestos de esta prueba
(Anexos 3.2). Supuesto de distribución normal de los datos, debido a que estos se ajustan a una
línea de probabilidad normal y, por ende, se prueba la fiabilidad de los resultados de la prueba.
También, se cumplen los supuestos de varianza constante y aleatoriedad de las muestras, al
igual que la independencia de estas, las cuales no demuestran un patrón, tendencia o correlación
evidente. Con lo anterior, debido a que el p-value del análisis de varianza es menor a la
significancia (0.000 < 0.05), se rechaza la hipótesis nula y se concluye que, con una confianza
del 95%, los tratamientos de 1% y 3% p/v de ácido sulfúrico tiene una efectividad diferente en
la liberación de azúcares reductores.
3.2. Fermentación alcohólica
3.2.1. Ajuste de pH para la fermentación
La acidez del sustrato en cada botella de fermentación fue ajustada en un pH entre 5 y 6. En
dicho proceso, se percibieron cambios de coloración como consecuencia de cambios en el pH,
en un pH aproximadamente de 6. La figura 5 muestra la coloración de la mezcla mango-agua
en medio ácido y la Figura 6, la coloración de esta en medio básico.
18
Figura 5. Coloración amarilla de la mezcla agua-mango a un pH ácido
Figura 6. Coloración marrón de la mezcla agua-mango a un pH básico
Debido a que la coloración se da gracias a sustancias solubles en agua, es decir, extraíbles de
los residuos de cascarilla, semilla y cáscara, se hicieron pruebas de coloración para cada tipo
de residuo, en donde se identificó cualitativamente que los residuos de mayor respuesta a
cambios en el pH son la semilla y la cáscara. Lo anterior, va de la mano con la composición
reportada de extraíbles presente en estos dos residuos (14~16 %) la cual es moderada.
De acuerdo con la literatura, los tintes y pigmentos naturales en las plantas son sustancias
altamente coloreadas y pueden mostrar cambios de color con variación de pH. Varios
compuestos orgánicos e inorgánicos son responsables de la propiedad del color de la planta,
como flavonoides, flavonoles, flavonoides acilados, antocianinas, antocianinas aciladas
glucosiladas, quininas, iminas, polimetinas, naftaquinonas, antraquinonoides, indigoides,
dihidropiranos, diarilmetanos, diarilmetano. Algunos de estos compuestos muestran diferentes
colores en diferentes pH y, por lo tanto, esta propiedad se puede aplicar para usar como un
indicador natural. Un indicador de pH es solo una base débil o ácido-débil con formas de ácido
y base conjugada de diferentes colores (Kapilraj, Keerthanan & Sithambaresan, 2019).
19
3.2.2. Evaluación de azúcares reductores en el proceso de fermentación
Los resultados de fermentación de azucares reductores en el tiempo para los dos tipos de
pretratamientos se presentan en la Figura 7.
0 2 4 6 8
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Fermentación de azúcares reductores
Día
Co
ncen
tra
ció
n (
g/L
)
Muestras 1% H2SO4
Muestras 3% H2SO4
Figura 7. Fermentación de azúcares reductores en el tiempo para los pretratamiento con 1% y 3% de
ácido sulfúrico.
En la figura anterior, se hace evidente que la concentración inicial de azúcares reductores para
la fermentación de las muestras provenientes del pretratamiento con 1% de ácido sulfúrico
(0.98±0.8 g/L) es muy similar a las de 3% (0.99±0.18 g/L). Esto se debe a que la fermentación
no se realizó inmediata a la terminación de la hidrólisis ácida, si no, después de un de tiempo
significativo, en donde los azúcares reductores fueron transformados en otros compuestos,
generalmente tóxicos para los microorganismos, reduciendo su la tasa de crecimiento y la
productividad de etanol (Oliva Domínguez & Ballesteros Perdices, 2003). A pesar de que la
cantidad de azúcares reductores y otros compuesto inhibidores (aceites, furanos y ácidos
débiles) es muy similar, se tiene que la velocidad de fermentación es mucho mayor para las
muestras pretratadas de 1%, en comparación con las de 3%. Este comportamiento, se debe a la
cantidad de NaOH usada para neutralizar el pH para cada tratamiento, en donde se usaron
cantidades mucho mayores para las muestras concentradas de 3% de ácido sulfúrico, generando
así mayor proporción de sal (sulfato de sodio) en solución. Para los tratamientos de 1% la
concentración de sulfato de sodio es aproximadamente 54 g/L, mientras que para 3% es 162.24
g/L. Así mismo, se ha demostrado que iones tales como Na + y SO 4 -2, tienen un efecto inhibidor
significativo sobre los microorganismos que se consideran para la producción de
biocombustibles, específicamente, se encontró que reducen el crecimiento celular, las tasas de
utilización de azúcar y las tasas de productividad de etanol. También, cuando se exponen a altas
concentraciones de sal, las levaduras pueden experimentar estrés osmótico y toxicidad iónica
(Casey et al., 2013).
20
En consecuencia, con los fenómenos anteriores se hace necesario añadir una etapa de
detoxificación del producto hidrolizado siguiendo la metodología propuesta por Herazo, Ruiz
& Arrazola Paternina:
Una vez obtenido el hidrolizado se filtra al vacío y se concentra en un rotaevaporador a 70 ± 4
ºC hasta retirar un 60% de agua del hidrolizado. Se realiza sobretitulación del hidrolizado en
donde se aumenta el pH a 10, con hidróxido de sodio (NaOH) sólido, posteriormente se
disminuye el pH a 5,8, empleando ácido sulfúrico (H2SO4). Durante la sobretitulación con
hidróxido de sodio y ácido sulfúrico se realiza filtración del precipitado formado en el
hidrolizado. Otro procedimiento para detoxificar el hidrolizado es el tratamiento con carbón
activado, el cual consiste en someter la solución a una clarificación con 2,5% de carbón activado
a 200 rpm y 30 ºC durante una hora. Luego, se filtra y se lleva a autoclave a 100 ºC durante 15
minutos para la esterilización del medio (Herazo, Ruiz & Arrazola Paternina, 2009).
3.2.3. Resultados de la cromatografía líquida (HPLC)
El principal objetivo de la medición por medio de esta técnica fue la cuantificación del etanol
y la identificación de otras sustancias producto del proceso fermentativo. La Figura 8,
representa un cromatograma de una muestra para el día 6 de fermentación con un pretratamiento
de 1%.
Figura 8. Cromatogramas de una muestra de fermentación, el primero por detección UV y el segundo
por refractómetro.
A partir de la ilustración, se pueden identificar sustancias tales como ácido acético en detector
UV a los 15 min, ácido succínico UV 12 min y otros ácidos comunes en las fermentaciones
según la guía de estándares en Anexos, también, un posible azúcar en RI a los 6.5 min. Por otro
lado, la cuantificación del etanol no fue posible debido a que el pico identificado como etanol
en RI a los 23 min, fue muy pequeño y puede ser considerado como ruido ya que se encuentra
21
cercano a los límites de detección del equipo (~0.5 g/L). Con el fin de descartar posibles
contaminaciones microbianas, se realizaron tinciones de Gram a una muestra proveniente de
una botella de fermentación aleatoria (Figura 9)
Figura 9. Tinciones de Gram, a la izquierda una muestra de 100% levaduras y a la derecha una muestra
de fermentación.
Las tinciones de Gram de la figura anterior hacen posible identificar las grandes similitudes
entre ambas tinciones, además, se puede apreciar en la tinción de la muestra de fermentación,
el fenómeno de gemación (reproducción asexual de las levaduras), por lo que se descarta que
existió contaminación microbiana y, por ende, la fermentación sí se llevó a cabo produciendo
etanol. De esta forma, se concluye que el método propuesto en la metodología no es propio para
la identificación y cuantificación de etanol a tan bajas concentraciones.
3.2.4. Resultados de cromatografía de gases (GLC)
Los resultados de cromatografía de gases reportaron unas concentraciones de etanol para los
días 2 y 4 de fermentación de los diferentes pretratamiento con ácido sulfúrico (1% y 3%)
mostrados en la Figura 10
22
F1%(2
)
F1%(4
)
F3%(2
)
F3%(4
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Cuantificación de etanol por GLC
Tratamiento
Co
ncen
tra
ció
n (
g/L
)
F1%(2)-Día 2 de fermentación (1%)
F1%(4)-Día 4 de fermentación (1%)
F3%(2)-Día 2 de fermentación (3%)
F3%(4)-Día 4 de fermentación (3%)
Figura 10. Concentración de etanol (g/L) para los días 2 y 4 de fermentación para los pretratamiento de
1% y 3%
Los resultados mostrados en la figura anterior, evidencian la tendencia observada en la Figura
7, en donde la rapidez de fermentación para las muestras pretratadas con 1% de ácido es mayor,
produciéndose una cantidad de etanol importante hacia el segundo día de fermentación, sin
embargo, la cantidad de azúcares ya es muy baja y para el día 4, es posible que por estrés o
agotamiento de glucosa, las levaduras utilicen otras fuentes de carbono, pueden utilizar una
amplia variedad de otros carbonos, incluidos compuestos no fermentables como el etanol
(Turcotte, Liang, Robert & Soontorngun, 2010), explicándose así la disminución de la
concentración del etanol. Por otro lado, debido a que el proceso fermentativo de azúcares
reductores es más lento para las muestras pretratadas con 3% de ácido, entre los días 2 y 4, se
experimenta un crecimiento progresivo de la concentración de etanol, alcanzándose finalmente,
un valor cercano al segundo día de fermentación de 1%. A pesar de lo anterior, es claro en las
gráficas que la desviación estándar promedio para las diferentes mediciones es alta (0.15 g/L),
esto se puede deber a errores experimentales en el momento de generación de condiciones
anaeróbicas para cada sistema de fermentación, también, diferencias importantes en el ajuste
de pH para las réplicas del mismo tratamiento, que generan variaciones en las condiciones del
sustrato a fermentar. Además, de una posible e importante fuente de error que es la calibración
de la concentración de etanol en el equipo, debido a que se realizaron sólo 4 estándares que,
aunque generaban un ajuste muy alto, pueden no ser confiables estadísticamente.
23
4. Conclusiones y trabajo futuro
Con el fin de determinar la efectividad de los diferentes tratamientos de hidrólisis ácida (1% y
3% p/v) se realizó la cuantificación del efecto de estos sobre la liberación de azúcares reductores
mediante el método DNS. Lo anterior, demostró un mayor rendimiento de hidrólisis (17.1%)
para el tratamiento de 1% de ácido con respecto al de 3%, comprobándose mediante un análisis
estadístico ANOVA one-way, que sí existe diferencia significativa entre dichos tratamientos y
que el resultado obtenido es confiable.
El proceso de fermentación fue evaluado mediante la cuantificación de azúcares reductores en
el tiempo, el cual demostró una diferencia importante en la velocidad de las reacciones para las
muestras pretratadas con 1% y 3%. La diferencia se fundamenta en la no detoxificación de los
productos provenientes de la hidrólisis, presentándose mayor cantidad de compuestos
inhibitorios en las muestras de 3%, consecuentemente, la fermentación de las muestras
pretratadas con 1% presentan una mayor eficiencia fermentativa.
La cuantificación del etanol fue llevada a cabo por medio de dos métodos de cromatografía,
HPLC y GLC. Los resultados de cromatografía líquida para el etanol no fueron concluyentes
debido a que los picos registrados estaban muy cercanos a los límites de detección del equipo
y la concentración del analito calculada no es significativa. Por otro lado, los resultados de la
cromatografía de gases muestran picos muy claros y cuantificables, que finalmente van de la
mano con los resultados obtenidos de azucares reductores. Sin embargo, debido a que se
presenta una alta desviación estándar en las mediciones, no se tiene la confianza para concluir
que estos son significativos y se hace prudente sugerir nuevas mediciones de estándares y de
muestras.
Con el fin de generar mayor valor a esta investigación se propone poder investigar mediante un
diseño experimental robusto, la hidrólisis ácida a concentraciones cercanas a 1% p/v de ácido
sulfúrico, con el objetivo de encontrar las condiciones óptimas para este tipo de tratamiento.
También, es importante incluir en la metodología una etapa adicional para la detoxificación de
las sustancias inhibidoras y tóxicas para microorganismos empleados en procesos
fermentativos. Por otro lado, para lograr un mejor aproximado a condiciones anaerobias, es
necesario tener extremo detalle con el sellado del tapón y el ajuste de la trampa de agua y la
jeringa para muestras. El método GLC es el método más adecuado para la cuantificación del
etanol, sin embargo, realizar un análisis robusto por medio de HPLC permitirá conocer a
profundidad la cinética del proceso de fermentación.
Lograr la mayor cantidad de producto de etanol es el objetivo principal de muchas
investigaciones que pretenden usarlo como fuente de energía. Por ello, es importante crear un
24
medio de cultivo que brinde las condiciones nutritivas óptimas para el desarrollo de los
microorganismos, estas incluyen principalmente, mayor cantidad de azúcares iniciales a partir
del uso de mayor biomasa y de biomasa libre de aceites vegetales, que puedan inhibir un
eventual proceso fermentativo.
Finalmente, explorar la obtención de un indicador de pH a partir de un colorante natural de
residuos de mango, representa una interesante oportunidad de investigación para caracterizarlo
y darle valor agregado a la biomasa residual.
25
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28
Anexos 1.
Tabla 2. Ventajas y desventajas de métodos para pretratamiento de material lignocelulósico (Carrillo-Nieves et al., 2019)
29
2.
2.1
Figura 11. Estándares de fermentación detectados por UV y refractómetro (RI) (Bio-Rad Laboratories,
Inc, n.d.).
30
2.2.
Figura 12. Método para la cuantificación de etanol en GLC.
Intensity 250000 /
/
849 252
1, 2,
200000
150000
100000
50000
/ / / / //
054
/ 414 590 832
483564 3, 356 5, 5, 6, 0 1,1, 3,
0 1 2 3 4 5 6 7
min
Analysis Date & Time : 01/11/2013 10:08:15 User Name : Admin Vial# : 1 Sample Name : Estandar 2% Sample ID : Estandar 2% Sample Type : Unknown Injection Volume : ISTD Amount :
Data Name : C:\GCSolution_back\Data\2013\Daniela Barros\Estandar 2%.gcd Method Name : C:\GCSolution_back\Data\2013\Daniela Barros\Determinacion de etanol y metanol.gcm
Peak# Ret.Time Area Height Conc. Unit Mark ID# Cmpd Name 1 1,483 1214 697 0,000 V 2 1,564 2496 315 0,000 V 3 1,849 460001 251308 0,000 V 4 2,252 461025 227879 0,000 5 3,054 14084 4765 0,000 6 3,356 1414 106 0,000 V 7 5,414 12823 2552 0,000 8 5,590 2160 473 0,000 V 9 6,832 5656 150 0,000
TotalTotal 960873 488245
<Analytical Line 1>
[Injection Port SPL1] Injection Mode : Split Temperature : 250,0 C Carrier Gas : He Flow Control Mode : Velocity Pressure : 84,8 kPa Total Flow : 126,8 mL/min Column Flow : 2,43 mL/min Linear Velocity : 40,0 cm/sec Purge Flow : 3,0 mL/min Split Ratio : 50,0 High Pressure Injection : OFF Carrier Gas Saver : OFF Splitter Hold : OFF
[Column Oven] Initial Temperature : 60,0 C Equilibration Time : 2,0 min
=Column Oven Temperature Program= Total Program Time : 8,00 min
Method
Rate(C/min) Temperature(C) Hold Time(min) ------ 60,0 0,00
1 5,0 95,0 1,00
[Column Information] Column Name : TRB-1 Serial Number : NF-166689 Film Thickness : 3,00 um Column Length : 30,0 m Inner Diameter : 0,32 mm ID Column Max Temp : 300 C Installation Date : 2013/10/16
[Detector Channel 1 FID1] Temperature : 270,0 C Signal Acquire : Yes Sampling Rate : 40 msec Stop Time : 8,00 min Delay Time : 0,00 min Subtract Detector : None Makeup Gas : He Makeup Flow : 15,0 mL/min H2 Flow : 40,0 mL/min Air Flow : 400,0 mL/min
[General] < Ready Check Heat Unit >
Column Oven : Yes SPL1 : Yes FID1 : Yes
< Ready Check Detector (FTD) > < Ready Check Baseline Drift >
FID1 : No < Ready Check Injection Flow >
SPL1 Carrier : Yes SPL1 Purge : Yes
< Ready Check Add. Flow > < Ready Check Detector APC Flow >
FID1 Makeup : Yes FID1 H2 : Yes FID1 Air : Yes
External Wait : No Auto Flame On : Yes Auto Flame Off : Yes
31
3.
3.1. Curva de calibración DNS
Para la cuantificación de azucares reductores se realizaron 3 curvas de calibración con
estándares de glucosa a concentraciones conocidas. Para cada reactivo preparado se tiene las
Ilustraciones 2,3, y 4. Las curvas tienen un ajuste lineal significativo y muestran el modelo que
describe el comportamiento de la absorbancia con respecto a la concentración de azúcares
reductores (g/L).
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Curva de calibración para método DNS
Concentración (g/L)
Ab
sorb
an
cia
(5
40
nm
) Y = 0.08478*X + 0.005794
Figura 13. Curva de calibración 1, para el método de DNS con un ajuste de R2= 0.9968.
.
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Curva de calibración para método DNS
Concentración (g/L)
Ab
sorb
an
cia
(5
40
nm
) Y = 0.3122*X - 0.005660
Figura 14. Curva de calibración 2, para el método DNS con un ajuste de R2= 0.9983.
32
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Curva de calibración para método DNS
Concentración (g/L)
Ab
sorb
an
cia
(5
40
nm
) Y = 0.4149*X - 0.02425
Figura 15. Curva de calibración 3, para el método DNS R2= 0.9950.
3.2.
Figura 16. Gráfica de comprobación de supuestos de la prueba estadística.
