PRODUCCIÓN DE AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO

M. Pía Cerdeiras

CATEDRA DE MICROBIOLOGÍA

FACULTAD DE QUIMICA

Requisitos para el desarrollo de un ACB

• Selección de un agente superior.• Producción abundante y a un costo adecuado de

propágulos.

• Formulación adecuada.

• Vida útil del producto final adecuada, preferiblemente sin refrigeración.

• Eficacia alta y estable en condiciones de uso a través de un sistema de aplicación adecuado.

• Registro/aprobación.

• Patente

Producción

Producción de ACBs

• Fermentación sumergida (sustrato líquido) (FSL)

• Fermentación sobre sustrato sólido (FSS).

Crecimiento

Crecimiento implica un aumento ordenado de todos los componentes de un organismo y

no solamente de alguno de ellos.

En organismos unicelulares el crecimiento conduce a un aumento en el número de

células más que un aumento en el tamaño celular

Crecimiento de un microorganismo en medio de cultivo líquido

Crecimiento en cultivo en lote (batch)

• Fase lag - las células se adaptan al nuevo ambiente, aun no se dividen

• Fase exponencial (log) - velocidad máxima de crecimiento bajo condiciones particulares, tiempo de generación mínimo

• Fase estacionaria - sin crecimiento neto, vc=0 ó estadísticamente = 0

cuando: vc=vm (vel. crecimiento es igual a la de muerte)

– nutrientes limitantes, pero suficientes para mantener actividad

– acumulación de desechos, inhibición del crecimiento

• Fase de muerte - velocidad de muerte celular > velocidad de división celular

Luego de la adición de m.o. al medio líquido fresco se observa la siguiente cinética de crecimiento

Fermentación sobre sustrato sólido

Existe falta de conocimiento en cuanto a patrones y cinética de crecimiento en FSS

• La disposición 3-D del micelio y del sustrato.

• La heterogeneidad del sustrato en sí.

• La dificultad de obtener medidas directas de la biomasa microbiana formada.

1- Determinación del número de microorganismos

• Métodos directos: recuento total

• Métodos indirectos: recuento de viables

Evaluación del crecimiento

2- Determinación de la masa celular

• Métodos directos–Medida de la masa–Medida del volumen

• Métodos indirectos–Determinación del contenido de N, C, P, etc–Turbidimetría

3- Determinación de la actividad celular

–Actividad enzimática–Concentración de un metabolito–Medida de la respiración

Diferencias entre FSS y FSL

• Algunos hongos filamentosos no pueden ser crecidos en FSL.

• Algunos hongos sólo esporulan en FSS.

• Los sistemas de fermentación a nivel industrial están más desarrollados para la FSL.

• Los sistemas de FSL son más fáciles de controlar (temp., pH., etc.).

El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB

• Medio de cultivo

• Relación C/N

• Actividad de agua

• Sistema de cultivo (FSL oFSS)

• Momento de la cosecha

• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc

El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB

• Medio de cultivo

• Relación C/N

• Actividad de agua

• Sistema de cultivo (FSL oFSS)

• Momento de la cosecha

• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc

Influencia del medio de cultivo sobre la eficiencia de las ascosporas de Talaromyces flavus contra

marchitamiento a VerticiliumSpores produced per petri dish

2 x 1010

4 x 1010

8 x 109

El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB

• Medio de cultivo

• Relación C/N

• Actividad de agua

• Sistema de cultivo (FSL oFSS)

• Momento de la cosecha

• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc

Relación C/N del medio de cultivo afecta la morfología de los conidios de Colletotrichum

truncatum

10:1 30:1 80:1

Relación C/N del medio de cultivo afecta la calidad de los conidios de Colletotrichum

truncatum

Parámetro de calidad

Relación C/N

1:10 1:30 1:80

Producción de conidios

+ ++ +

Velocidad de germinación

rápida lenta lenta

Formación de apresorios

Alto bajo bajo

Contenido de proteínas

alto bajo Bajo

El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB

• Medio de cultivo

• Relación C/N

• Actividad de agua

• Sistema de cultivo (FSL oFSS)

• Momento de la cosecha

• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc

Efecto del potencial de agua (WP) sobre la cantidad y calidad de conidios de

Trichoderma harzianum

Medio WP Biomasa Log conidia Germinación Mpa g/l por g (%)

RM8+0% glicerol -0.8 358 A 10.72 A 4.0 A

RM8+3% glicerol -2.0 492 D 10.75 A 15.3 B RM8+6% glicerol -2.8 447 C 10.86 B 35.9 C RM8+9% glicerol -3.7 444 C 11.04 C 67.3 D RM8+12% glicerol -4.8 400 B 10.76 A 37.0 D

El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB

• Medio de cultivo

• Relación C/N

• Actividad de agua

• Sistema de cultivo (FSL oFSS)

• Momento de la cosecha

• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc

Influencia del sistema de cultivo sobre la producción de conidios de Trichoderma

harzianum

Parámetro Sólido Líquido

Producción (log esporas/ml) 10.0 8.0

Tiempo de incubación (h) 76.0 48.0

Productividad (log esporas/ml/h) 8.1 6.3

Sistema de cultivo

Propiedades de esporas de Trichoderma harzianum producidas por FSS y FSL

Esporas producidas por Propiedad

FSS FSL

Resistencia a UV (LD50, min.)

4.0 2.4

Vida util (% ufc luego de 45 días a 25C)

100.0 15.0

Hidrofobicidad ++ -

Grosor de pared (nm) W2 W1 Total

119.0 116.0 235.0

30.0 150.0 180.0

El método de producción afecta la cantidad y calidad del inóculo del ACB

• Medio de cultivo

• Relación C/N

• Actividad de agua

• Sistema de cultivo (FSL oFSS)

• Momento de la cosecha

• Temperatura, pH, aereación, agitación, etc

Crecimiento de un microorganismo en medio de cultivo líquido

Efecto del momento de la cosecha sobre la viabilidad de clamidosporas de Gliocladium

virens

25C4C

88981.25 x 108160

82981.2 x 108135

73861.2 x 108120

62781.0 x 108113

29596.1 x 10791

17415.2 x 10787

12192.5 x 10664

00043

Viabilidad luego de 300 días Productividad

UFC ml –1

Cosecha (h)

Eyal et al., 1997

El método de producción puede afectar la morfología, cantidad y calidad de los

elemento de propagación

• Grosor de la pared de los conidios • Tipo y tamaño de los conidios• Velocidad de germinación• Hidrofobicidad• Vida útil• Productividad• Resistencia al UV• Eficiencia como biocontrolador

Formulación

Formulación

La mezcla de ingredientes y la forma de preparar un principio activo para su empaque, almacenamiento y expedición al lugar de uso.

Cuatro funciones básicas de la formulación:

• Estabilizar el principio activo.

• Ayudar en su manejo y aplicación.

• Protegerlo de factores ambientales adversos en el sitio de acción, y por lo tanto aumentar su persistencia.

• Aumentar su actividad en el sitio de acción, ya sea por aumento real de la actividad, y/o por aumento de la reproducción, contacto o interacción con el patógeno diana.

Problemas hallados durante la formulación de ACBs.

Cosecha

Estabilización

Almacenamiento

Aplicación

Post-aplicación

Tipos de formulaciones

Productos secos

Polvos, gránulos

Perlas de alginato, capsulas

Polvos mojables

Productos líquidos

Suspensiones acuosas u oleosas

Emulsiones w/o o o/w

Aditivos (excipientes)

• Carriers• Binders• Adherentes• Surfactantes• Emulsificantes• Humectantes• Desecantes• Protectores solares

Supervivencia de Pseudomonas fluorescens en diferentes carrier a 25°C

Carrier 0 30 60

Número de P. flourescens (10x UFC/g) a distintos días de almacenamiento

Turba 6.6 a 5.2 a 4.4 aTalco 6.8 a 3.7 c 2.9 bLignita 6.4 a 4.9 b 2.7 b

(Rabidran & Vidhyasekaran, 1996)

Número de conidias y clamidosporas de Trichoderma en tierra

0 10 20 30 40 50 600

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Sphagnum-bran, 4 C

Sphagnum-bran + Si, 4 C

Sphagnum-bran, 20 C

Sphagnum-bran + Si, 20 C

Weeks

log

cfu

/g i

no

cu

lum

Supervivencia de IK726 con y sin agregado de desecante

Formulación óptima se relaciona con:

• El ACB en particular

• Método de producción

• Excipientes