Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en
individuos colombianos
Camila Andrea González Quiroga
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química Bogotá D.C, Colombia
2019
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en
individuos colombianos
Camila Andrea González Quiroga
Tesis o trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de: Magister en Ciencias-Bioquímica
Directora Dr rer nat. CLAUDIA CONSUELO RUBIANO CASTELLANOS
Codirector Ph D. EDGAR EMIGDIO CRISTANCHO MEJIA
Grupo de Investigaciones Básicas en Bioquímica- LIBBIQ y Grupo de investigación en adaptaciones
a la hipoxia y al ejercicio.
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Departamento de Química
Bogotá D.C, Colombia 2019
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
3
<Calma en el alma> …Y aunque no ha sido fácil, amo esta vocación que me ha
enseñado a caer y levantarse, y a hacer de la ciencia un aprendizaje para la vida…
V.K
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
4
Agradecimientos
Agradezco a la Universidad Nacional de Colombia por la convocatoria nacional de proyectos para el fortalecimiento de la investigación, creación e innovación 2016-2018 que permitió la financiación del proyecto 37282. A la vicedecanatura de investigación de la facultad de ciencias y al departamento de Química. Al grupo de investigación en hormonas y principalmente a la Dra. Adriana Umaña y el Dr. Mauricio Urquiza. A mi directora, la profesora Claudia Rubiano que ha sido un apoyo constante a lo largo de mi proceso de formación en investigación. A mi familia LIBBIQ y a Andrés por ser una bonita coincidencia en este camino de la vida. A Dios, a mi madre y a todos mis amigos que fueron un apoyo constante en este proceso de aprendizaje que más que un título ha sido una de las lecciones más grandes que la vida me ha dado.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
5
Resumen
La condición de hipoxia hipobárica desencadena respuestas celulares y fisiológicas en organismos
aerobios. Esta condición provoca cambios en proteínas presentes en fluidos biológicos, como
producto de mecanismos moleculares que regulan procesos sistémicos, entre los que se destacan
angiogénesis, eritropoyesis y remodelación tisular (1) (2) (3) (4) (5) (6)(7). Hasta la fecha, se ha
establecido que existe una variación en el conjunto de proteínas circulantes en suero de individuos
nativos de tierras de baja altitud que se establecen en grandes altitudes (>5000 msnm), sin
embargo, no se conoce aún si estos cambios se dan también en la población andina que se desplaza
a altitudes moderadas (2000-3000 msnm) (8). Lo anterior es relevante teniendo en cuenta que
existen diferentes patrones de adaptación que varían de acuerdo con la ubicación geográfica y el
tiempo de residencia en altitud (9).
En este trabajo se realizó la evaluación de algunas variables hematológicas y un análisis
exploratorio de las proteínas que se expresan diferencialmente en suero sanguíneo de individuos
nativos y residentes en zonas de baja altitud expuestos a hipoxia hipobárica. Con este propósito,
se desarrolló una metodología para la obtención de perfiles de proteínas de buena resolución y
reproducibilidad, para lo cual se realizó la inmunodepleción de albúmina e inmunoglobulinas,
seguida de la precipitación de proteínas con ácido tricloroacético (TCA)-Acetona y electroforesis
bidimensional. El análisis comparativo de los geles obtenidos se realizó mediante el software Delta
2D 4.8.0, con el cual se obtuvieron perfiles de expresión diferencial de spots durante el tiempo de
seguimiento. Algunos spots se seleccionaron de acuerdo al fold change (FC) y al valor p para su
identificación mediante espectrometría de masas MALDI TOF TOF.
Entre las proteínas identificadas están la cadena gamma de fibrinógeno, el inhibidor 1 alfa de
antitripsina, hemopexina, la proteína de unión a retinol, transferrina y la apolipoproteína AI. Estas
son proteínas que se han relacionado con diferentes patologías y en este trabajo se estableció su
posible función en los mecanismos de ajuste fisiológico respecto a los procesos de transporte y
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
6
degranulación plaquetaria principalmente. Estos son resultados preliminares que constituyen una
base para la búsqueda de potenciales biomarcadores de la condición de hipoxia hipobárica.
Palabras Clave: proteínas, aclimatación, hipoxia hipobárica, electroforesis bidimensional.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
7
Abstract
The hypobaric hypoxia condition triggers cellular and physiological responses in aerobic organisms.
This condition causes changes in proteins present in biological fluids, as a product of molecular
mechanisms that regulate systemic processes, among which are angiogenesis, erythropoiesis and
tissue remodeling (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). To date, it has been established that there is a variation
in the set of circulating proteins in serum of native individuals of low altitude lands that are
established at high altitudes (>5000 m), however, it is not yet known if these changes also occur in
the Andean population that travels at moderate altitudes (2000-3000 m) (8). This is relevant
considering that there are different adaptation patterns that vary according to geographical
location and residence time at altitude (9).
In this work, the evaluation of some hematological variables and an exploratory analysis of proteins
that are differentially expressed in blood serum of native and resident individuals in low altitude
areas exposed to hypobaric hypoxia are presented. For this purpose, a methodology was developed
to obtain protein profiles of good resolution and reproducibility, for which the immunodepletion
of albumin and immunoglobulins was performed, followed by protein precipitation with TCA-
Acetone and two-dimensional electrophoresis. The comparative analysis of the obtained gels was
carried out using the software Delta 2D 4.8.0, with which profiles of differential expression of spots
were obtained during the follow-up time. Some spots were selected according to the foldchange
(FC) and the p-value for identification by MALDI TOF TOF mass spectrometry.
Among the identified proteins are the fibrinogen gamma chain, the antitrypsin 1 alpha inhibitor,
the hemopexin, the retinol binding protein, the transferrin and the apolipoprotein AI. These are
proteins that have been related to different pathologies and in this work their possible function
was established in the mechanisms of physiological adjustment with respect to the transport
processes and platelet degranulation mainly. These are preliminary results that constitute a basis
for the search for potential biomarkers of the hypobaric hypoxia condition.
Keywords: proteins, acclimation, hypobaric hypoxia, two-dimensional electrophoresis.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
8
Contenido Pag.
Resumen ...................................................................................................................................... 5
Lista de figuras……………………………………………………………………………………………………………………………10
Lista de tablas…………………………………………………………………………………………………………………………….11
Lista de Símbolos y abreviaturas………………………………………………………………………………………………..12
1. Introducción ........................................................................................................................... 14
2. Marco teórico ......................................................................................................................... 16
2. 1 Hipoxia ............................................................................................................................. 16
2.1.1 Hipoxia hipobárica ...................................................................................................... 17
2.1.2 Factores inducibles por hipoxia (HIFs) ......................................................................... 24
2. 2 Proteómica .......................................................................................................................... 27
2.2.1 Estudios proteómicos relacionados con hipoxia hipobárica ......................................... 32
3. Justificación ............................................................................................................................ 40
4. Preguntas de investigación ..................................................................................................... 41
5. Objetivos ................................................................................................................................ 42
5.1 Objetivo General ............................................................................................................... 42
5. 2 Objetivos Específicos ........................................................................................................ 42
6. Materiales y métodos ............................................................................................................. 43
6.1 Selección de los individuos que participaron en el estudio ................................................. 43
6.2 Toma de muestras de sangre y seguimiento ...................................................................... 44
6.3 Determinación de variables hematológicas ........................................................................ 45
6.4 Tratamiento de la muestra de suero .................................................................................. 46
6.4.1 Cuantificación de proteínas ............................................................................................ 47
6.4.2 Precipitación de proteínas .............................................................................................. 48
6.4.3 Electroforesis bidimensional 2D-PAGE ............................................................................ 49
6.4.4 Análisis de los geles obtenidos por 2D-PAGE ................................................................... 53
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
9
6.5 Identificación de proteínas por espectrometría de masas .................................................. 56
7. Resultados y discusión ............................................................................................................ 59
7. 1 Variables hematológicas .................................................................................................... 59
7. 2 Tratamiento de las muestras de suero y obtención de perfiles proteicos por 2D-PAGE....... 69
7.3 Análisis de geles obtenidos por 2D-PAGE ............................................................................ 73
7.4 Identificación de proteínas…………………………………………………………………………………………………86
8. Conclusiones y recomendaciones ......................................................................................... 101
8.1 Conclusiones ................................................................................................................... 101
8. 2 Recomendaciones .......................................................................................................... 102
9. Anexos .................................................................................................................................. 103
10. Bibliografía ......................................................................................................................... 130
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
10
Lista de figuras
Figura 1. Relación entre la altitud y la presión barométrica
Figura 2. Genes candidatos de la ruta de los HIFs en diferentes poblaciones
Figura 3. Respuesta de los HIFs en condiciones de normoxia e hipoxia
Figura 4. Generación de péptidos circulantes por actividad proteasa y proteinasa en el
microambiente celular
Figura 5. Abundancia de constituyentes sanguíneos
Figura 6. Vías relacionadas por KEGG con las proteínas reguladas por hipoxia
Figura 7. Flujo de trabajo para el análisis de spots en Delta 2D
Figura 8. Valores del porcentaje de hematocrito
Figura 9. Valores de la concentración de hemoglobina
Figura 10. Concentración de hemoglobina corpuscular media
Figura 11. Concentración de proteínas totales en suero completo
Figura 12. Depleción de Alb e IgGs en suero mediante el sistema ProteoPrep Blue
Figura 13. Imágenes del perfil de proteínas obtenido mediante 2D-PAGE
Figura 14. Agrupación de los geles correspondientes al seguimiento con Delta 2D
Figura 15. Gel fusión obtenido a partir del análisis de los geles de 2D-PAGE con Delta 2D
Figura 16. Agrupamiento jerárquico de los spots
Figura 17. Clusters de spots seleccionados por K-means para identificación
Figura 18. Gráfica de volcano para la muestra del día 56 del seguimiento de los individuos
Figura 19. Perfil de expresión diferencial para los spots identificados para cada individuo
Figura 20. Red de interacción de las proteínas identificadas usando STRING
Figura 21. Red de enriquecimiento para las proteínas identificadas usando Gonet
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
11
Lista de tablas
Tabla 1. Parámetros hematológicos en poblaciones a diferentes altitudes
Tabla 2. Principales respuestas de aclimatación a nivel sistémico bajo hipoxia hipobárica
Tabla 3. Toma de muestras de los individuos incluidos en el estudio
Tabla 4. Programa de isoelectroenfoque para tiras de 18cm
Tabla 5. Soluciones para revelado de geles con Azul de Coomassie G-250
Tabla 6. Características generales de los individuos incluidos en el estudio
Tabla 7. Asignación de spots de acuerdo al agrupamiento por K-means
Tabla 8. Identificación de spots correspondientes al proteoma sérico de individuos expuestos a
hipoxia hipobárica
Tabla 9. Enriquecimiento de términos GO de las proteínas identificadas por MS
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
12
Lista de Símbolos y abreviaturas
Abreviatura Término
ADH Hormona antidiurética Alb Albúmina AMS Mal agudo de montaña ANP Péptidos natriuréticos atriales APO AI Apolipoproteína AI ATP Adenosín trifosfato A1T1 Inhibidor 1alfa de antitripsina BCA Ácido bicinconínico BSA Albúmina sérica bovina CBP Proteína de unión a CREBBP cGMP Guanosín monofosfato cíclico CMS Mal crónico de montaña DTT Ditiotreitol 2D-PAGE Electroforesis bidimensional DIGE Electroforesis en gel diferencial eIF2a Factor de iniciación de la traducción 2a eNOS Óxido nítrico sintasa endotelial EPO Eritropoyetina ESI Ionización por electrospray FC Fold change FGF-2 Factor de crecimiento de fibroblasto Fgg Cadena gamma de fibrinógeno GO Gene ontology HACE Edema cerebral HAPE Edema pulmonar Hb Hemoglobina HCM Hemoglobina corpuscular media Hct Hematocrito HDL Lipoproteínas de alta densidad HIFs Factores inducibles por hipoxia HO-1 Hemo oxigenasa-1 HPLC-MS Cromatografía líquida de alta eficiencia acoplada a espectrometría de masas Hpx Hemopexina HUPO Organización del proteoma humano IAA Iodoacetamida IEF Isoelectroenfoque IgGs Inmunoglobulinas IL Interleuquina IL-1a Interleuquina 1 alfa
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
13
OIA Yodoacetamida IPGs Gradientes de pH inmovilizado iTRAQ Sondas isobáricas para cuantificación absoluta y relativa MALDI Desorción/ionización laser asistida por matriz MAPK Proteínas quinasas activadas por mitógenos MS Espectrometría de masas msnm Metros sobre el nivel del mar MW Masa molecular NO Óxido nítrico NOS Óxido nítrico sintasa OMS Organización mundial de la salud PDGF Factores de crecimiento derivados de plaquetas PDK1 Quinasa de la piruvato deshidrogenasa 1 PHDs Prolil hidroxilasas pI Punto isoeléctrico RBP4 Proteína 4 de unión a retinol ROS Especies reactivas de oxígeno SDS Dodecil sulfato de sodio TCA Ácido tricloroacético TEMED Tetrametiletilendiamina TF Transferrina TFA Ácido trifluoroacético TfR Receptor de transferrina TLR4 Receptor toll 4 TNFa Factor de necrosis tumoral alfa VDBP Proteína de unión a vitamina D VEGF Factor de crecimiento vascular endotelial VHL Von Hippel-Lindau VIH Virus de inmunodeficiencia humana
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
14
1. Introducción
La hipoxia es una condición en la que el suministro de oxígeno a los tejidos disminuye, lo que
constituye un factor de estrés que genera respuestas para compensar esta reducción y mantener
la homeostasis en las células. La hipoxia puede ser producto de factores externos como la actividad
física, la inhalación de monóxido de carbono, la asfixia y la exposición a grandes altitudes. Esta
última se conoce como hipoxia hipobárica y se define como la disminución de la presión parcial de
oxígeno por cambios en la presión atmosférica debido al aumento de la altitud.
La condición de hipoxia hipobárica es normal en residentes de zonas de altitud media y alta (2000-
5500 msnm) como Colombia, donde el 70% de la población vive a una altitud intermedia entre
2000 y 3000 msnm, y tiene efectos en los individuos que dependen del género, la edad, el estado
físico y la población de origen (19). Los principales responsables de la respuesta celular ante el
estímulo de hipoxia son los factores inducibles por hipoxia (HIFs: HIF-1,2,3). Estos son factores de
transcripción que desencadenan una respuesta poligénica, aunque también se han evidenciado
mecanismos de respuesta independiente de los HIFs en otras condiciones donde la hipoxia es
característica como son el cáncer y las isquemias.
Los efectos a nivel fisiológico producto de la hipoxia hipobárica varían de acuerdo con el tiempo y
el grado de exposición. De acuerdo con el tiempo de exposición pueden tener lugar dos procesos;
el primero es el proceso de aclimatación durante el cual se pueden generar respuestas agudas que
ocurren en un tiempo de segundos a horas y crónicas que tienen lugar cuando el estrés se prolonga
a días y meses. El segundo, es el proceso de adaptación que requiere años e incluso varias
generaciones y es representado por variaciones evolutivas en individuos residentes a gran altitud
(10) (11) (12).
Los cambios en la expresión génica durante la condición de hipoxia son indicadores de que el
organismo ha activado vías de señalización y rutas metabólicas en respuesta a este estímulo. De
esta forma, los genes y sus productos tienen un gran potencial como indicadores de estrés hipóxico
y por esta razón su análisis en fluidos biológicos principalmente, abarca un amplio campo de
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
15
estudio (13) (14) (7). A la fecha, muchos estudios sugieren que los cambios en el proteoma se
correlacionan con diferentes condiciones fisiológicas y fisiopatológicas, por lo cual su análisis tiene
un gran potencial clínico para la intervención terapéutica, la identificación de biomarcadores para
diagnóstico y también como posibles blancos terapéuticos (4) (8) (15).
Respecto al análisis del proteoma sérico durante la condición de hipoxia hipobárica, algunos
estudios han determinado cambios en el perfil de expresión de proteínas en individuos nativos a
nivel del mar en altitud y en nativos de grandes altitudes (>3500 msnm) (8) (16) (17).
Principalmente, se han reportado cambios en proteínas relacionadas con la respuesta inmune y
antiinflamatoria, estrés oxidativo y apoptosis. Sin embargo, a la fecha son pocos los estudios que
evalúan cambios en la expresión de proteínas durante el proceso de aclimatación a hipoxia
hipobárica por proteómica comparativa mediante electroforesis bidimensional, técnica que
constituye la base de análisis exploratorios para la identificación de proteínas con perfiles de
expresión diferencial en todo tipo de muestras biológicas (10) (16) (17) (18).
Por otra parte, en cuanto a la respuesta sistémica que tiene lugar en altitud se destacan algunos
cambios hematológicos que son determinantes para el transporte óptimo de oxígeno a los tejidos,
así como para el desarrollo de todas las funciones vitales. De esta forma, la evaluación de
parámetros hematológicos en individuos expuestos a la condición de hipoxia se ha usado como
indicador de los cambios a nivel fisiológico con el fin de aportar conocimiento sobre los mecanismos
de compensación que tienen lugar durante los procesos de aclimatación y adaptación en altitudes
variables para caracterizar diferentes poblaciones (19). En este trabajo, se propuso evaluar en
conjunto los cambios en algunas variables hematológicas y en el proteoma sérico durante el
proceso de aclimatación a hipoxia hipobárica mediante técnicas experimentales que permitieron
determinar la existencia de perfiles de expresión diferencial como una aproximación a la
comprensión de los mecanismos de respuesta celular y sistémica a hipoxia hipobárica (18).
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
16
2. Marco teórico
Más de 140 millones de personas viven en regiones por encima de los 2500 msnm en el mundo y
están distribuidas principalmente en África oriental, Asia central, América central y del sur (96). Por
lo anterior, cerca del 2% de la población mundial está expuesta a hipoxia hipobárica, lo que
representa un desafío para la supervivencia debido a que la vida de individuos en altitud (>2500
msnm) se asocia con cambios fisiológicos para compensar la disminución en la disponibilidad de
oxígeno (21) (10) (20).
2. 1 Hipoxia
La condición de hipoxia hace referencia a la disminución en la disponibilidad de oxígeno en las
células y tiene lugar cuando la demanda de oxígeno supera el suministro (concentración de oxígeno
de 1% o 12.5µM). Para explicar cómo los seres vivos responden a la condición de hipoxia, hay que
saber que todos los organismos pluricelulares tienen mecanismos para la detección de oxígeno, así
como para compensar su disminución. Inicialmente, la detección de oxígeno se atribuyó
exclusivamente a células especializadas ubicadas en órganos quimiorreceptores (células
carótideas, aórticas o células neuroepiteliales) que pueden responder a la disminución de la presión
de oxígeno en segundos o minutos con cambios en su excitabilidad, contractilidad o actividad
secretora. Sin embargo, ahora se conoce que todas las células nucleadas en el cuerpo humano
detectan la concentración de oxígeno y responden cuando su disponibilidad es reducida ya sea por
un estímulo agudo o crónico, con cambios a nivel molecular originados por una cascada de
transducción de señales que favorece la activación de factores de transcripción que inducen
cambios en la expresión génica (22) (23) (24).
En humanos, esta condición puede ocurrir por una variedad de factores fisiológicos y
fisiopatológicos como la actividad física, la inhalación de monóxido de carbono, la exposición a
grandes altitudes y la inflamación, entre otros. De acuerdo con los factores que condicionan la
disponibilidad de oxígeno en las células, hay diferentes tipos de hipoxia que se clasifican como
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
17
hipoxia hipobárica (disminución de la presión barométrica), isquémica (reducción del flujo
sanguíneo), histotóxica (incapacidad de las células de utilizar oxígeno por la acción de agentes
tóxicos) y anémica (disminución del oxígeno total unido a la hemoglobina). También existen
algunas condiciones clínicas bajo las cuales el epitelio alveolar está expuesto a hipoxia, rasgo que
es común en muchas patologías respiratorias como el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva
crónica; por lo tanto, la hipoxia tiene un rol importante en la patogénesis de las principales causas
de mortalidad en el mundo, que incluyen el cáncer, la isquemia cerebral, miocárdica y las
enfermedades crónicas que afectan el corazón y los pulmones (22). Sin embargo, hay que destacar
que la hipoxia también es una condición normal y necesaria durante procesos como el desarrollo
embrionario y el mantenimiento celular (8) (7).
2.1.1 Hipoxia hipobárica
El aire es una mezcla de gases compuesta principalmente por oxígeno y nitrógeno, cuyas presiones
parciales sumadas son iguales a la presión barométrica. La concentración de oxígeno en la
atmósfera (20,93%) es constante mientras que la presión parcial de oxígeno disminuye de forma
logarítmica a medida que cae la presión barométrica y aumenta la altitud (Figura 1). Por lo anterior,
la exposición de individuos a grandes altitudes genera la disminución de la cantidad de moléculas
de oxígeno en el aire inspirado respecto al nivel del mar (25). Esta condición se conoce como hipoxia
hipobárica y constituye un factor de estrés en los sistemas biológicos debido a que los organismos
aeróbicos requieren un suministro estable e ininterrumpido de oxígeno y por lo tanto existen
diferentes mecanismos para la homeostasis de oxígeno en procesos básicos como la respiración, el
metabolismo y la proliferación celular, entre otros.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
18
Figura 1. Relación entre la altitud y la presión barométrica. En la figura se indica el cambio de la
presión barométrica y la presión parcial de oxígeno respecto a la altitud en msnm, con lo cual pone
en evidencia que el aumento de la altitud da lugar a la condición de hipoxia hipobárica. En la figura
PiO2** y %V.I.* indican la presión parcial y el volumen inspirado de oxígeno respectivamente.
Tomado de: http://altitudchulec.blogspot.com/2012/12/ciudades-de-gran-altitud.html
La capacidad de los seres humanos para hacer frente a los entornos de gran altitud es mediada por
los procesos de adaptación y aclimatación representados por variaciones evolutivas y ajustes
transitorios respectivamente, que dependen del tiempo y la altitud. Sin embargo, a la fecha no se
han establecido tiempos específicos que den cuenta del proceso de aclimatación en humanos.
Históricamente andinos, etíopes y tibetanos son las poblaciones humanas que han estado
expuestas a hipoxia hipobárica por su asentamiento permanente durante periodos de tiempo
variables contemplados entre 5 y 50 mil años en regiones geográficas de gran altitud (>3500
msnm), tiempo suficiente para establecer mecanismos de adaptación que han permitido su
supervivencia (9) (26).
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
19
En 1878 el fisiólogo Paul Bert sugirió que la exposición a grandes altitudes implica cambios en
parámetros hematológicos como el porcentaje de glóbulos rojos y la concentración de
hemoglobina (Hb), porque su aumento mejora la capacidad de transporte de oxígeno en la sangre
para contrarrestar la disminución de la presión parcial de oxígeno en altitud (27). De esta forma, se
propuso que la respuesta hematológica universal de nativos a nivel del mar en altitud es aumentar
la concentración de Hb (28). Otro de los factores que se tiene en cuenta para evaluar el efecto de
la altitud en diferentes poblaciones es la cantidad de oxígeno que transporta la Hb o el porcentaje
de saturación de oxígeno, que disminuye de forma inmediata con la exposición aguda a altitudes
por encima de los 3000 msnm y se usa a menudo para determinar el grado de estrés fisiológico
(29). En consecuencia, como resultado de múltiples estudios se ha establecido que parámetros
hematológicos como la concentración de Hb, la saturación de oxígeno y el contenido arterial de
este en sangre constituyen diferencias fenotípicas entre nativos a nivel del mar expuestos a hipoxia
hipobárica y pobladores de grandes altitudes, por lo que se ha propuesto la existencia de patrones
de adaptación característicos de estos últimos respecto a los valores de referencia en individuos a
nivel del mar (30) (31) (32) (Tabla 1).
Tabla 1. Parámetros hematológicos en poblaciones a diferentes altitudes. (29)
Poblaciones de referencia
(Altitud:msnm)
% Saturación de oxígeno
Concentración de hemoglobina
(g/dl)
Contenido arterial de oxígeno (ml
O2/100 ml sangre)
Hipoxemia arterial
Eritrocitosis
Nivel del mar 97 15.3 21.1 Ausente Ausente
Etíopes (3530) 95 15.6 21.1 Ausente Ausente
Tibetanos (4000)
89 15.8 19.2 Presente Ausente
Andinos, Bolivia (4000)
92 19.1 24.4 Presente Presente
El patrón de adaptación andino clásico se caracteriza por una alta concentración de Hb, baja
saturación de oxígeno y un contenido de oxígeno arterial más alto que nativos a nivel del mar;
mientras que el patrón tibetano presenta una concentración de Hb con valores similares a los
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
20
nativos a nivel del mar hasta que se alcanzan altitudes extremas (≥5500 msnm), la saturación de
oxígeno es bastante baja y el contenido de oxígeno arterial es aproximadamente 10% más bajo que
su contraparte a nivel del mar. Por otra parte, el patrón etíope resulta comparable con pobladores
a nivel del mar respecto a las variables analizadas. Lo anterior pone en evidencia la existencia de
patrones de adaptación subsecuentes al tiempo de residencia en altitud, así como también
representa las diferencias a nivel fisiológico que tienen lugar durante los procesos de aclimatación
y adaptación. Como evidencia de esto último también se han observado diferencias entre nativos
tibetanos y chinos de la población Han que nacieron a una altitud cercana a nivel del mar y apenas
hace 50 años comenzaron a poblar el Tibet (33) (34) (35).
Respecto a la concentración de Hb, los andinos presentan un incremento en altitudes desde los
1600 msnm, mientras que los tibetanos residentes a altitudes por encima de 4000 msnm tienen
valores comparables con individuos a nivel del mar, por lo cual se ha propuesto que estos últimos
presentan una respuesta atenuada ante la condición de hipoxia hipobárica y su background
genético ha permitido mejoras en el transporte de oxígeno mediante una alta ventilación sostenida
en reposo, baja respuesta de vasoconstricción pulmonar hipóxica y mejor saturación arterial de
oxígeno en altitud (36). Como es evidente y a partir lo de los resultados de diferentes estudios, el
aumento de la concentración de Hb es variable de acuerdo con la altitud y la población de origen.
El estudio de las adaptaciones a hipoxia ha tenido lugar desde principios del siglo pasado, y solo
recientemente los estudios genómicos han permitido hacer comparaciones con el objetivo de
determinar las bases genéticas subsecuentes al proceso adaptativo. La evidencia actual sugiere que
hay variantes de los genes epas1 y egln1 que están relacionadas con la adaptación a hipoxia
hipobárica porque se han asociado con respuestas características en nativos de altitud, como por
ejemplo, la atenuación del aumento de la concentración de Hb como un factor protector frente al
aumento de la viscosidad de la sangre por eritropoyesis que puede afectar el flujo sanguíneo en los
tejidos y la entrega de oxígeno (36) (30). En este mismo sentido, con el desarrollo de estos estudios
se ha evidenciado que el proceso de adaptación implica cambios a nivel molecular que pueden
tener efectos pleiotrópicos. Por ejemplo, en un estudio realizado por Azad y colaboradores se
encontró un conjunto de 64 genes comunes entre dos de las tres poblaciones de referencia y de
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
21
estos se identificaron cuatro en común (pik3cb, hla-dqb1, cntnap2 y dlg2) para andinos, etíopes y
tibetanos relacionados con funciones del sistema inmune y circulatorio (31). Así mismo, se ha
evidenciado la existencia de patrones de adaptación entre las tres poblaciones con un conjunto de
genes candidatos de la ruta de los factores inducibles por hipoxia (HIFs) que son característicos de
cada población y otros que convergen en vías similares para mitigar o contrarrestar los efectos
negativos que puede generar la exposición a hipoxia hipobárica (9) (35) (Figura 2).
Figura 2. Genes candidatos de la ruta de los HIFs en diferentes poblaciones. Tomado de (9). En la
figura se destacan las tres regiones geográficas de poblaciones de humanos residentes en altitud y
en cada recuadro se nombran los genes candidatos de la ruta de los HIFs para cada población. Los
genes en color negro son característicos de cada población, en azul están los genes en común para
las tres poblaciones, en verde los genes compartidos entre tibetanos y andinos, en rojo los genes
compartidos por andinos y etíopes, y por último en púrpura los compartidos entre tibetanos y
etíopes.
De otro lado, y de acuerdo con la literatura, el proceso de aclimatación de habitantes a nivel del
mar en altitud requiere mecanismos a nivel muscular, metabólico, respiratorio, cardiovascular y
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
22
hormonal, que pueden o no estar plenamente comprometidos para garantizar la supervivencia y
la capacidad de realizar diferentes actividades. Durante el proceso de aclimatación se pueden
originar respuestas agudas y crónicas que tienen lugar cuando la exposición ocurre en un tiempo
de horas a días respectivamente y se generan cambios fisiológicos con el fin de maximizar la
entrega de oxígeno a los tejidos (20).
Aunque hay cambios fisiológicos que pueden conferir ventajas medibles en individuos en altitud,
se ha evidenciado que durante el retorno a nivel del mar estos cambios no se mantienen (38). Lo
anterior sugiere que algunos cambios que tienen lugar producto de la exposición prolongada a
hipoxia hipobárica pueden ser un efecto secundario de adaptaciones principales que se dan para
mejorar la entrega de oxígeno y compensar la regulación de diferentes vías durante y después al
estímulo, razón por la cual algunas son innecesarias posterior al proceso de aclimatación (26).
Como es evidente la respuesta a hipoxia hipobárica involucra diferentes mecanismos a nivel
molecular y fisiológico que son representados por los cambios que tienen lugar a nivel sistémico y
ponen en evidencia su complejidad (Tabla 2).
Tabla 2. Principales respuestas de aclimatación a nivel sistémico bajo hipoxia hipobárica.
Respuesta
Función
Hiperventilación Aumentar la presión parcial de oxígeno en la sangre (PaO2).
Hemoconcentración/Eritropoyesis
Incremento del número de glóbulos rojos por volumen de sangre o hematocrito.
Afinidad de la hemoglobina por el oxígeno
Disminución transitoria de la afinidad de la Hb por el oxígeno para facilitar la descarga de oxígeno.
Consumo de oxígeno
Disminución del consumo de oxígeno por regulación metabólica.
Diuresis
Excreción de iones de sodio y bicarbonato en la orina y retención de iones de hidrógeno para compensar la alcalosis respiratoria y contribuir a la regulación del pH corporal.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
23
Vasoconstricción pulmonar
Aumento del suministro de sangre a los alvéolos con mayor contenido de oxígeno para enriquecer aún más la relación ventilación/perfusión.
Gasto cardíaco Aumento para restaurar la entrega de oxígeno a los tejidos.
Angiogénesis
Formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de una red preexistente. Favorece la vascularización.
Metabolismo energético
Regulación del metabolismo energético anaeróbico favorecido por el aumento de transportadores como GLUT-1, GLUT-3 y enzimas glucolíticas.
La alteración de los mecanismos de respuesta ante la condición de hipoxia hipobárica puede
generar una serie de síntomas debido al ascenso a altitudes por encima de los 2500 msnm. Entre
los síntomas principales se destacan dolor de cabeza, falta de apetito, cansancio, debilidad,
irritabilidad, insomnio, náuseas y diarrea, que en su conjunto caracterizan el mal agudo y crónico
de montaña (AMS y CMS) (5) (39). El diagnóstico de estos efectos fisiopatológicos en la altitud es
evaluado por medio de un sistema de puntuación de consenso denominado Lake Louise para
determinar la gravedad de los síntomas. El AMS generalmente ocurre dentro de las primeras horas
y días posteriores al ascenso rápido (>2500 msnm) y generalmente se resuelve del día 1 al 3. La
prevalencia de AMS y CMS depende de la edad, el género, la población de origen, la velocidad de
ascenso y la altitud alcanzada, factores que determinan la susceptibilidad de los individuos. Su
incidencia es mucho más alta que la de las otras dos patologías que pueden presentar los individuos
en altitud como son el edema cerebral y pulmonar (HACE, HAPE) (40) (41) (32) (31).
Aunque el AMS y el CMS han sido ampliamente estudiados, los mecanismos bajo los cuales se
presentan no han sido completamente elucidados y se ha determinado que comparten
características con algunas patologías como el cáncer, las apneas del sueño y las isquemias. Debido
a estas similitudes, la comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la aclimatación y
los efectos negativos producto de la exposición a hipoxia hipobárica pueden contribuir al diseño de
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
24
nuevas herramientas clínicas y terapéuticas que contrarresten los efectos de la hipoxia en
diferentes condiciones (41).
2.1.2 Factores inducibles por hipoxia (HIFs)
Los HIFs son una familia de factores de transcripción que han sido descritos como mediadores de
la respuesta a hipoxia y están conservados en todas las especies de animales independientemente
de la presencia de sistemas especializados de transferencia de oxígeno como pulmones y corazón
(23) (42) (14). Inicialmente se identificaron como reguladores de la expresión del gen epo
(eritropoyetina), y posteriormente se determinó que son reguladores a nivel transcripcional de
múltiples genes en respuesta a la condición de hipoxia.
Específicamente, los HIFs son heterodímeros con dominios hélice-loop-hélice constituidos por dos
subunidades que se expresan constitutivamente en todas las células, una alfa que presenta tres
isoformas (HIF-1a, HIF-2a, HIF-3a) y una beta (42). La actividad de los HIFs es mediada por la
estabilidad de la subunidad alfa y depende de la concentración de oxígeno. En condiciones de
normoxia (concentración de oxígeno ~ 20-50µM) la subunidad alfa es rápidamente degradada (T
½: 5 min) debido a que las enzimas prolil hidroxilasas (PHD1, PHD2, PHD3) hidroxilan dos residuos
de prolina altamente conservados (402 y 564) que posteriormente son reconocidos por el complejo
de la proteína VHL (E3 ubiquitin ligasa) que poliubiquitina la subunidad alfa para que esta sea
reconocida por el proteosoma para su degradación (Figura 3) (42) (12). Por otra parte, en
condiciones de hipoxia la subunidad alfa (T ½: 30 min) se trasloca al núcleo y forma un
heterodímero con la subunidad beta y tiene lugar la unión de proteínas coactivadoras como p300
y CBP (acetiltransferasas de histonas) que forman el complejo de inicio para la transcripción de
genes que tienen elementos de respuesta a hipoxia (HREs: 5´-(A/G)CGTG-3´) en su región
promotora (4) (7)(42) (23) (24). Los HREs han sido identificados en la región reguladora de genes
que codifican para transportadores de glucosa (GLUT-1, GLUT-3), isoformas de enzimas glucolíticas
y genes implicados en diferentes procesos biológicos (43).
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
25
Figura 3. Respuesta de los HIFs en condiciones de normoxia e hipoxia. Tomado de (44). En la figura
se muestra la actividad de los HIFs en condición de normoxia e hipoxia, se puede observar la
degradación de HIF alfa por el proteosoma en condiciones de normoxia debido a la actividad de las
PHDs y en contraparte la traslocación de HIF alfa al núcleo para inducir la transcripción de genes
con HREs en condiciones de hipoxia.
Aunque existen diferentes vías de señalización que pueden modular la respuesta a hipoxia, la
regulación de los HIFs ocurre principalmente por la hidroxilación de HIF-1a por las PHDs, que son
sensores de oxígeno y tienen como cofactores hierro y α-cetoglutarato; en consecuencia, la
dependencia de oxígeno celular, intermediarios del ciclo de Krebs y la disponibilidad de hierro
explica el mecanismo de regulación de las PHDs para la degradación de los HIFs (23) (42) (45) (46).
Por otra parte, si HIF-1a no es degradado por las PHDs, su actividad transcripcional puede ser
bloqueada por asparaginil hidroxilasas que hidroxilan un residuo conservado de asparagina (Asn803)
y de esta forma inhiben la unión del complejo de proteínas coactivadoras para el inicio de la
transcripción (14) (24). Como otro mecanismo de regulación de los HIFs, también se ha reportado
que pueden ser degradados por el lisosoma de forma independiente de oxígeno (12).
La influencia de los HIFs en la expresión génica puede variar entre diferentes tipos de células y
depende de las tres isoformas de la subunidad alfa (42). Se ha determinado que HIF-1a tiene una
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
26
función general como parte de la maquinaria transcripcional en el núcleo de todas las células,
mientras que HIF-2a y HIF-3a tienen funciones concretas en la homeostasis de oxígeno y son tejido
específicas (7) (45) (12). Los HIF-1a y 2a han sido ampliamente estudiados debido a que regulan un
amplio espectro de funciones celulares y procesos biológicos, facilitando el suministro de oxígeno
a gran variedad de células y tejidos en respuesta a hipoxia (28) (7) (47). De forma interesante, la
expresión de HIF-2a es restringida a células renales, endoteliales, hepáticas y pulmonares, y tiene
un 48% de similitud en la secuencia de aminoácidos con HIF-1a (42). Específicamente, HIF-1a regula
la expresión de enzimas glucolíticas y su función está relacionada con el uso de oxígeno durante el
desarrollo fetal y postnatal, así como también ejerce control sobre vías apoptóticas que no están
bajo el control de HIF-2a; mientras que HIF-2a estimula el crecimiento tumoral y la angiogénesis
(47) (42). Cabe señalar además que HIF-1a desempeña un papel crítico en la respuesta inicial a
hipoxia severa (<0,1% de O2) entre las primeras 24 horas, mientras que HIF-2a actúa bajo la
condición de hipoxia crónica entre las primeras 48 y 72 horas.
Aunque como se ha mencionado hasta ahora los cambios inducidos por hipoxia en la expresión
génica dependen principalmente de los HIFs, estos se extienden mucho más allá de la regulación a
nivel transcripcional por los HIFs. A la fecha hay evidencia de mecanismos a nivel post-
transcripcional, post-traduccional y epigenético bajo esta condición. Respecto a este último, en
mamíferos se ha determinado que la hipoxia puede causar modificaciones por acetilación de
histonas y metilación en las islas CpG, así como también en las secuencias que corresponden a los
HREs, lo que sugiere que la modulación de la metilación en el ADN de genes regulados por los HIFs
tiene un rol importante en la respuesta molecular a hipoxia (4) (3). Como evidencia de esto se ha
demostrado que la condición de hipoxia altera los patrones de metilación en el promotor de epo,
por ejemplo, en líneas celulares donde el promotor no está metilado su expresión se ve
incrementada significativamente en respuesta a hipoxia, mientras que en líneas celulares con el
promotor metilado no se expresa el gen. Además de la regulación epigenética de epo, hay otros
genes que participan en la ruta eritropoyética que pueden estar bajo control epigenético, sin
embargo, este constituye un campo de investigación aun poco explorado (3).
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
27
Por último y como se ha reportado, los HIFs son regulados por varios circuitos de retroalimentación
negativa que sugieren la actividad de PHDs, microARNs y mTOR, entre otros, para modular la
expresión de numerosos genes y coordinar la respuesta sistémica (24). En resumen, su actividad es
una red bastante compleja que comprende varios mecanismos y cascadas de señalización, que
tienen potencial para la investigación en respuesta a condiciones fisiológicas y fisiopatológicas en
las que la hipoxia es característica (24) (22) (12).
2. 2 Proteómica
El término proteoma fue introducido por primera vez en el año 1995 para describir todo el conjunto
de proteínas que se expresan en un organismo, tejido o célula en condiciones específicas y su
estudio dio origen a la proteómica (48), una disciplina que aborda el estudio a gran escala de
productos génicos mediante métodos bioquímicos y de biología molecular para tener una
comprensión integral de diversos procesos celulares asociados a un estado biológico. Por otra
parte, el peptidoma constituye un subconjunto del proteoma representado por péptidos con peso
molecular de hasta 10 kDa y en consecuencia la principal diferencia en términos de propiedades
físicas con las proteínas es su peso molecular y por lo tanto su estructura.
Los péptidos pueden ser hormonas, factores de crecimiento y citoquinas que a menudo son
mediadores de procesos biológicos como productos derivados de la escisión proteolítica (49). A la
fecha, el cáncer y los trastornos basados en la inflamación se han asociado con patrones alterados
de proteólisis por metaloproteasas y otras enzimas (1). La alteración en la actividad de proteasas
genera péptidos a partir diferentes proteínas o de una misma proteína en varios residuos, y tiene
lugar en números procesos biológicos que incluyen la replicación del ADN, progresión del ciclo
celular, morfogénesis, remodelamiento de tejidos, crecimiento neuronal, hemostasia, cicatrización
de heridas, angiogénesis y apoptosis, entre otros. A su vez se ha reportado que la actividad de
proteasas es variada de acuerdo con el tipo de célula, lo cual representa diferencias en la
composición del proteoma de acuerdo con su fuente de origen (50).
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
28
Los péptidos respecto a las proteínas de las que se derivan o sus precursoras tienen mejor
permeabilidad en los tejidos debido a su tamaño, lo cual favorece su identificación en fluidos
biológicos, y a su vez ha permitido enfocar su estudio en la posible relación con patologías y/o
condiciones específicas como indicadores de cambios en la expresión de proteínas precursoras y
las proteasas correspondientes (50) (Figura 4).
Figura 4. Generación de péptidos circulantes por actividad proteasa y proteinasa en el
microambiente celular. Tomado de (51). Derivados de la actividad proteasa y proteinasa se
generan proteínas de bajo peso molecular y péptidos que se pueden mantener en circulación
sanguínea y son indicadores de diferentes contextos biológicos que tienen lugar en diferentes tipos
de células.
Respecto a la identificación de péptidos y proteínas en fluidos biológicos, es importante mencionar
que usualmente el suero es preferido para muchas pruebas bioquímicas debido a que los
anticoagulantes usados para aislar el plasma sanguíneo pueden interferir con pruebas específicas,
por lo cual actualmente la mayoría de los bancos de muestras clínicas consisten en muestras de
suero (52). Además, porque se han encontrado péptidos de abundancia relativa que están
presentes en suero y no son detectables en el plasma (15). Lo anterior es de suma importancia
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
29
teniendo en cuenta que el proceso de recolección de la muestra de sangre debe ser controlado
debido a que ex vivo se pueden generar múltiples péptidos como derivados de plaquetas y
componentes celulares por acción de enzimas en la cascada de coagulación (15).
Aunque el suero tiene una composición similar al plasma, este se caracteriza porque carece de los
factores de coagulación que involucran una cadena de proteínas y cofactores entre los cuales se
destacan trombina, fibrinógeno, calcio y transglutaminasa, entre otros. En suero más del 90% del
total de proteínas está representado por menos de 10 proteínas, siendo la albúmina (Alb) (65%:
45mg/ml) y las inmunoglobulinas (IgGs) (15%: 10mg/ml) las más abundantes, además de otros
constituyentes como citoquinas, factores de crecimiento y receptores (53). Por otra parte, la
diversidad de constituyentes séricos aumenta como producto de spliccing alternativo y
modificaciones post-traduccionales (54). Teniendo en cuenta lo anterior, la evaluación de péptidos
y proteínas derivados de fluidos biológicos es compleja considerando su diversidad y el rango de
concentración de otros constituyentes como sales, lípidos y carbohidratos (55) (15) (56) (53).
La concentración de proteínas en suero varía en un rango muy estrecho de acuerdo con su función
en áreas que incluyen inmunidad, coagulación, transporte de moléculas pequeñas, inflamación y
metabolismo lipídico (Figura 5); y por esta razón los fluidos sanguíneos han sido considerados como
una fuente potencial de biomarcadores. Los biomarcadores son moléculas que se puede medir y
evaluar objetivamente como indicadores de procesos biológicos normales, patogénicos o
respuestas farmacológicas frente a una intervención terapéutica, y se destacan por dos
propiedades fundamentales, especificidad y sensibilidad (48) (57).
Actualmente, se han postulado péptidos y proteínas de interés clínico con potencial para el estudio
de diferentes patologías como son apolipoproteínas (enfermedad cardiovascular), factores del
sistema complemento y protrombina (trastornos de la coagulación sanguínea), timosina (sistema
inmunitario), proteína de unión al factor de crecimiento insulínico y proteína de unión a vitamina
D (cáncer), que pueden estar presentes en concentraciones extremadamente bajas (ng/ml-pg/ml)
(58) (48) (59).
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
30
Figura 5. Abundancia de constituyentes sanguíneos. Tomado de (56). La concentración de
proteínas en fluidos como el suero y el plasma sanguíneo varia en un amplio rango de acuerdo con
su abundancia.
Debido a la dificultad de encontrar una única proteína o péptido asociado a una condición
específica, se ha llegado a un consenso mediante el cual las investigaciones se dirigen a la búsqueda
de un panel de biomarcadores que sean una huella característica de dicha condición debido a la
presencia de interferencias en fluidos biológicos, así como por la existencia de péptidos y proteínas
minoritarias que pueden ser enmascaradas por otras más abundantes que dificultan su detección
(60) (48). Es por esto que al considerar la complejidad de la muestra y la variabilidad analítica entre
los diferentes enfoques que permiten su análisis, es fundamental establecer la metodología más
simple y rápida que garantice la suficiente reproducibilidad y sensibilidad. Actualmente, el suero y
el plasma sanguíneo son la fuente principal para el estudio del proteoma y su caracterización es
una de las iniciativas de la HUPO (Human Proteome Organization, https://www.hupo.org/). La
identificación de las fuentes de variación entre individuos debido a factores fisiológicos (edad, sexo,
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
31
ciclo menstrual, ejercicio, estrés) y fisiopatológicos que permitan postular posibles biomarcadores
(48) (61).
La identificación de biomarcadores ha sido posible por los avances en el estudio del proteoma, que
a su vez ha tenido lugar debido a la integración de técnicas a gran escala para la identificación de
proteínas mediante métodos de ionización suave (MALDI y ESI) aplicados a la espectrometría de
masas (MS), que han mejorado la precisión y facilitado el análisis de datos con un alto rendimiento,
así como por la creación de bases de datos para compilar la información obtenida a partir de la
implementación de estas técnicas (61)(62). Desde su introducción, la proteómica se ha desarrollado
rápidamente como una herramienta de investigación aplicada a diversos campos de la ciencia
debido a las variaciones que tienen lugar en el proteoma por diferentes condiciones fisiológicas y
fisiopatológicas (63) (57).
La implementación de técnicas en proteómica incluye estrategias para la preparación de la muestra
que contemplan los procedimientos preliminares para el muestreo, la manipulación y el
almacenamiento, así como diferentes metodologías para la eliminación de proteínas de gran
abundancia (52) (53). Por lo anterior, la estandarización de los procedimientos de preparación de
la muestra de suero y/o plasma es crítica para la identificación de biomarcadores confiables, ya que
ligeros cambios en el procedimiento de preparación de la muestra pueden conducir a variaciones
en el perfil de péptidos y proteínas. Por otra parte, se debe tener en cuenta que factores como la
edad, el sexo y el estado nutricional determinan la composición del proteoma, y por lo tanto se
requiere de una consideración cuidadosa que a su vez depende de la calidad de la muestra, la
sensibilidad y la reproducibilidad de las técnicas empleadas para el análisis.
Aunque a la fecha existen diferentes técnicas para el estudio del proteoma como DIGE (Difference
gel electrophoresis), HPLC-MS (high performance liquid chromatography- mass spectrometry) y
iTRAQ (Isobaric tags for relative and absolute quantitation), la electroforesis bidimensional (2D-
PAGE) constituye la base de los estudios exploratorios del proteoma bajo diferentes condiciones
principalmente debido a su costo y a su enfoque exploratorio (61). La 2D-PAGE es aún una técnica
ampliamente usada porque permite separar mezclas complejas de proteínas y/o péptidos en un
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
32
solo experimento de dos dimensiones, en la primera dimensión las proteínas se separan en un
gradiente de pH hasta que su carga neta es igual a cero y corresponde con su punto isoeléctrico,
posteriormente en la segunda dimensión la separación ocurre en función del peso molecular (62).
Como resultado se obtiene un perfil en el que cada señal o “spot” corresponde a una o incluso
varias proteínas que se pueden comparar con otras muestras para identificar diferencias en los
perfiles de expresión (57). La resolución de esta técnica se debe a que la separación en las dos
dimensiones tiene parámetros independientes, por lo cual es útil para mezclas complejas de
proteínas. Sin embargo, la principal limitación de esta estrategia es la baja posibilidad de
automatización, lo cual la hace útil para el análisis de un número limitado de muestras (62) (49). La
implementación de esta técnica comprende varias etapas que son esenciales para obtener
resultados reproducibles que permitan identificar patrones de expresión diferencial. Actualmente,
el desarrollo de gradientes de pH inmovilizados (IPGs) acoplado a geles de poliacrilamida y la
introducción de métodos de tinción más sensibles ha simplificado y mejorado en gran medida la
capacidad, sensibilidad y reproducibilidad de los geles bidimensionales (49). Así mismo, el
desarrollo de diferentes programas o software de análisis de imágenes ha permitido realizar la
comparación y cuantificación objetiva de un gran número de spots de acuerdo con su intensidad,
para su posterior identificación por MS (57).
2.2.1 Estudios proteómicos relacionados con hipoxia
hipobárica
La regulación de la expresión de genes asociados con hipoxia de forma independiente y
dependiente de los HIFs está relacionada con la regulación positiva y negativa de péptidos y
proteínas que participan en diferentes procesos biológicos. Por lo anterior, el análisis del proteoma
constituye una herramienta importante que aborda el estudio a gran escala de productos génicos
para tener una comprensión integral de procesos celulares asociados a diferentes condiciones
fisiológicas y fisiopatológicas relacionadas con la hipoxia (63). Así mismo, el análisis del proteoma
desde diferentes enfoques ha permitido identificar cambios en la expresión, isoformas, localización
subcelular, modificaciones post-traduccionales e interacciones de un gran número de proteínas.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
33
A la fecha existe una base de datos no redundante y curada manualmente llamada HypO2DB
(http://www.hypoxiadb.com/) que integra la información de algunas de las proteínas que se ha
reportado son reguladas por hipoxia en humanos. Esta base de datos permite encontrar una lista
de proteínas que presentan cambios en su expresión en hipoxia bajo diferentes condiciones (% de
oxígeno) y de acuerdo con el tipo de tejido (endotelio, epitelio, entre otros) a partir de
publicaciones revisadas por pares que corresponden a evidencia experimental, y de modo general
agrupa las proteínas de acuerdo con los términos GO (Gene Ontology). También posee vínculos a
otros recursos como Uniprot (https://www.uniprot.org/), OMIM (Online mendelian inheritance in
man, https://www.omim.org/), PDB (Protein data bank, https://www.rcsb.org/), PubMed
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) y KEGG (https://www.genome.jp/kegg/), con este
último se han determinado las principales vías en las que participan estas proteínas (Figura 6) (11).
Figura 6. Vías relacionadas por KEGG con las proteínas reguladas por hipoxia. Tomado de:
http://www.hypoxiadb.com/facts.html. De acuerdo con la vinculación de KEGG a HypO2DB se ha
determinado que las proteínas que presentan cambios de expresión en hipoxia participan en
diferentes vías entre las que se pueden destacar mayoritariamente las relacionadas con procesos
metabólicos, vías asociadas con cáncer y la interacción receptor-citoquina.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
34
De acuerdo con la información en esta base de datos es evidente que hay un gran número de
proteínas reguladas por hipoxia que tienen funciones en diferentes procesos como la homeostasis,
la respuesta antiinflamatoria y antioxidante (5) (8) (16). Según se muestra en la figura 6, el 24% de
las proteínas que son reguladas por hipoxia participan en vías metabólicas que incluyen el
metabolismo energético, de los ácidos biliares y del grupo hemo. Como parte del metabolismo
energético, se ha determinado que hay un aumento en los transportadores de glucosa GLUT-1 y
GLUT-3 y en algunas enzimas glucolíticas como la gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa y
enolasa. Esto implica un cambio del metabolismo oxidativo al glucolítico anaeróbico de forma
rápida y reversible, favoreciendo el uso de glucosa y el aumento de la concentración de lactato
mediado por enzimas como la fosfofructoquinasa-1 y la piruvato quinasa. El aumento en la
producción de lactato tiene lugar durante la etapa aguda de aclimatación, sin embargo, con el
transcurso del tiempo de exposición, los niveles de lactato disminuyen a valores similares a los de
residentes a nivel del mar, efecto conocido como la paradoja del lactato. Lo anterior indica que
deben existir mecanismos para mantener la producción energética independiente de la vía
glucolítica, corroborado también por los cambios en los niveles de expresión de proteínas
implicadas en el metabolismo energético como la citocromo c oxidasa (64).
Lo anterior constituye evidencia de que el tiempo de exposición a la condición de hipoxia genera
efectos variables que alteran la composición del proteoma (63) (46). Durante la aclimatación las
principales vías de transducción de señales implican la actividad de proteínas quinasas (MAPK,
SAPK y PKC) y fosfatasas dependientes de calmodulina, así como de diversas isoformas de proteínas
quinasas C, que modulan la expresión génica y la función celular. Por ejemplo, se ha reportado que
la hipoxia activa la vía de señalización p38 (p38α, p38β, p38δ, p38γ), parte de la superfamilia de
proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK).
A la fecha hay algunos estudios proteómicos comparativos entre individuos que habitan en altitud
y a nivel del mar. Tanto Ahmad como Padhy y colaboradores identificaron un total de 12 y 36
proteínas que se expresan de forma diferencial en nativos de gran altitud respecto a controles a
nivel del mar (16) (65). Entre las proteínas reguladas positivamente se destacan la proteína de
unión a vitamina D (VDBP), hemopexina (Hpx), inhibidor 1 alfa de antitripsina (A1T1), cadena β de
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
35
haptoglobina, apolipoproteína AI y A-IV, transtiretina, la cadena beta de Hb, y la óxido nítrico
sintasa (NOS). Por otra parte, se encontró que entre las proteínas reguladas negativamente están
la transferrina (Tf), el componente 3 y 4 del sistema complemento, la proteína sérica amiloide, la
proteína de unión a retinol (RBP4), el angiotensinógeno y la angiotensina. En conjunto estos
estudios encontraron cambios en la expresión de proteínas que actúan como factores de respuesta
antiinflamatoria (16) (65). Otros estudios en humanos y modelos murinos también han encontrado
que la mayoría de las proteínas reguladas positivamente son proteínas de fase aguda que facilitan
el control rápido y eficaz del daño inflamatorio tras la exposición a la hipoxia, sugiriendo que la
inflamación es una característica de la respuesta de aclimatación a la hipoxia hipobárica (17) (16)
(61) (65).
Los estudios proteómicos también han evidenciado que las poblaciones nativas de grandes
altitudes tienen niveles plasmáticos más altos de óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) y
metabolitos derivados de óxido nítrico (NO) frente a controles a nivel del mar; lo que a su vez se ha
relacionado con la activación de una vía independiente para generar NO a través de la reducción
de nitratos y nitritos, que favorece la disponibilidad de NO y en conjunto sugiere la importancia de
su producción durante el proceso de aclimatación, debido a su función como vasodilatador (66).
Al respecto, un estudio realizado por Padhy y colaboradores evaluó el proteoma plasmático en
nativos Ladakhi (3520 msnm) y nativos a nivel del mar los días 1, 4 y 7 de exposición a hipoxia
hipobárica. En este estudio se identificó un total de 208 proteínas que presentaron variación en los
nativos Ladakhi respecto a los controles a nivel del mar y se demostró que la vía cininógeno
calicreína bradiquinina es la principal reguladora de la actividad de eNOS, una de las isoformas de
la NOS, que al igual que iNOS (inducible) depende de la actividad de los HIFs (10).
Por otra parte, también se han evidenciado cambios en péptidos natriuréticos atriales (ANPs) que
tienen una función importante en la respuesta a hipoxia y se han asociado con la actividad del
sistema adrenérgico, debido a que son secretados en la circulación rápidamente y maximizan el
transporte de oxígeno, así como el uso de energía a corto plazo. En este sentido, los ANPs se han
catalogado como hormonas que se caracterizan por sus propiedades diuréticas, natriuréticas y
vasodilatadoras, y se ha propuesto que la presión sanguínea es el principal estímulo para su
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
36
liberación (67). Los ANPs tienen receptores específicos, y su función biológica esta mediada por el
guanosín monofosfato cíclico (cGMP) como un segundo mensajero. Sin embargo, se ha demostrado
que los individuos que se aclimatan a grandes altitudes no presentan o presentan cambios mínimos
en los ANPs, por lo cual dichos cambios se han asociado exclusivamente con condiciones
patológicas en las que la natriuresis es alterada (68) (69) (68).
Como es conocido los niveles de múltiples hormonas en plasma pueden variar por factores como
la edad y el origen étnico, y de esta forma pueden influenciar la respuesta ante diferentes factores
de estrés como la hipoxia. Lo anterior teniendo en cuenta que la aclimatación es un proceso crítico
regulado en múltiples niveles que incluyen al sistema endocrino en relación con el balance de
fluidos por natriuresis y diuresis, así como también por variaciones en el requerimiento y la
disponibilidad de metabolitos fundamentales como el hierro, la glucosa y el NO (69). De esta forma,
se ha propuesto que la variación entre individuos respecto a la respuesta endocrina es significativa
y tiene lugar por un amplio grupo de hormonas como epinefrina, vasopresina, leptina, insulina,
cortisol, hepcidina, y grelina, entre otras. Estas diferencias se pueden atribuir a variaciones en el
tiempo de exposición y al ciclo circadiano de cada hormona, por lo cual no ha sido posible
establecer un consenso respecto a los procesos regulados por estas bajo la condición de hipoxia
hipobárica (69).
Los estudios integrativos a partir de las ciencias ómicas en hipoxia han permitido determinar los
cambios a nivel celular que tienen un efecto directo en la fisiología de los individuos expuestos a
hipoxia hipobárica. Como un ejemplo de esto, un estudio realizado por Chicco y colaboradores, que
tenía como objetivo evaluar el metabolismo energético en músculo esquelético después de
someter a 21 individuos nativos de bajas altitudes durante 16 días a 5260 msnm permitió evidenciar
diferencias considerables a nivel metabólico y proteómico en los individuos a nivel del mar y
después de 16 días de exposición a hipoxia hipobárica (70). Mediante biopsias de músculo se
determinó que hubo un aumento en 119 de 250 metabolitos que incluían intermediarios
glucolíticos, aminoácidos y ácidos grasos, lo que es indicador de una mayor disponibilidad de
sustratos metabólicos en músculo esquelético bajo hipoxia. También se realizó la evaluación del
proteoma y se evidenciaron cambios significativos en 38 proteínas, de las cuales 31 disminuyeron
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
37
y estaban representadas principalmente por las que tenían una función mitocondrial y glucolítica
(citocromo c oxidasa, succinato deshidrogenasa, gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa y piruvato
quinasa, entre otras). Por otra parte, 7 de las proteínas que presentaron variación, incrementaron
significativamente después de los 16 días y entre estas se destacaron enzimas de glucólisis
(fosfoglicerato quinasa), oxidación de ácidos grasos (carnitina O-palmitoiltransferasa) y la
subunidad catalítica del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial. Con los hallazgos de este
estudio parece que la condición de hipoxia retiene componentes específicos del metabolismo
muscular citosólico y mitocondrial en condiciones fisiológicas de reposo, en lugar de inducir un
cambio global de la vía aeróbica a la anaeróbica (70). También sugiere que la reducción de enzimas
en músculo esquelético es el reflejo de la reducción del gasto energético para mejorar la eficiencia
metabólica, lo cual es consistente con otros estudios y por lo cual se ha propuesto que la dinámica
mitocondrial mejora la eficiencia en la producción energética evitando la generación excesiva de
especies reactivas de oxígeno (ROS) en hipoxia (70).
Tomando como ejemplo el estudio anterior, los trabajos en proteómica para evaluar la condición
de hipoxia se han realizado mayoritariamente en plasma y en tejido muscular. Primordialmente,
los estudios realizados en fluidos como el plasma y el suero sanguíneo destacan su importancia
como una fuente útil de información que se puede obtener de forma mínimamente invasiva. Por
otra parte, la importancia de los estudios en músculo radica en que este tejido proporciona un
buen modelo de adaptación de hipoxia in vivo, ya que su tasa metabólica puede aumentar hasta
100 veces más que los niveles basales, y está sujeta a niveles fluctuantes de oxígeno durante el
ejercicio (71). Por ejemplo, se ha reportado que la exposición a hipoxia hipobárica prolongada
genera alteraciones en la estructura y el volumen de la densidad mitocondrial en el tejido muscular,
así como también hay evidencia de la acumulación de lipofuscina, un producto de peroxidación
lipídica. En este sentido, en músculo esquelético de modelos murinos se ha identificado la
expresión diferencial de proteínas mitocondriales (cadena A de ATPasa y subunidad alfa de la
hidroxiacil CoA deshidrogenasa, entre otras) bajo la condición de hipoxia frente a un grupo control,
con lo cual se ha concluido que la exposición a hipoxia hipobárica durante 30 días afecta la
expresión de las proteínas mitocondriales que participan en la producción de ATP (adenosín
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
38
trifosfato) y el metabolismo de lípidos, lo que disminuye la estabilidad de la membrana
mitocondrial y afecta la cadena de transporte de electrones (72).
Otro de los cambios en el músculo durante la condición de hipoxia hipobárica se ve reflejado en la
síntesis de proteínas, lo cual se relaciona con la pérdida de peso característica de habitantes de
tierras bajas en la altitud. De acuerdo con los resultados de estudios que evalúan la síntesis de
proteínas en músculo bajo la condición de hipoxia, se ha establecido que probablemente el
músculo es resistente a estímulos anabólicos y es más sensible a condiciones que regulan
negativamente la síntesis de proteínas musculares y favorecen la proteólisis muscular. Al parecer,
la regulación negativa de la síntesis de proteínas en el músculo ocurre por mecanismos
dependientes e independientes de los HIFs que implican la señalización del complejo 1 del objetivo
mecanicista de la rapamicina quinasa (mTORC1), que a su vez depende del grado de hipoxia, el
estado energético y la actividad física (73).
En un estudio realizado por Vigano y colaboradores (74), se evaluó el efecto de la exposición a
hipoxia hipobárica (4559 msnm) durante 7 y 9 días en proteínas en músculo esquelético mediante
DIGE acoplada a MS para determinar los mecanismos funcionales involucrados en la aclimatación,
y como resultado se evidenció que proteínas implicadas en el transporte de hierro, el ciclo de Krebs,
la fosforilación oxidativa y la respuesta a estrés oxidativo disminuyeron significativamente (74).
Entre estas se destacan la alfa-enolasa, un marcador de lesión por hipoxia tisular, la 2-oxoglutarato
deshidrogenasa, malato deshidrogenasa, aconitato hidratasa, superóxido dismutasa, glutatión
transferasa y las peroxiredoxinas 2 y 6, consideradas como marcadores del estado redox (74).
También se vio reducida la expresión de marcadores de la función mitocondrial como la beta
ATPasa, el complejo de la proteína ubiquinol-citocromo c reductasa y la mitofilina entre otras, y de
algunas proteínas involucradas en la beta oxidación (74). Por otra parte, se encontró que la
expresión de la guanidinoacetato N-metil transferasa implicada en la biosíntesis de creatina y el
metabolismo de aminoácidos está aumentada, así como el número de proteínas ubiquitinadas, lo
que indica que la oxidación de ácidos grasos y la ruta ubiquitina-proteasoma tienen mayor actividad
(74). En el mismo estudio se encontró que los marcadores de hipoxia como HIF-1a, la quinasa de la
piruvato deshidrogenasa 1 (PDK1), mTOR y el factor de iniciación de la traducción 2a (eIF2a), no
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
39
presentaron cambios en hipoxia aguda excepto mTOR que se redujo, lo que puede sugerir una
cascada de señalización independiente de mTOR. Los resultados respecto a mTOR son
contradictorios en comparación con otros estudios realizado en modelos murinos, que sugieren
que mTOR no está sujeto a cambios en la presión parcial de oxígeno (74) (71). Sin embargo, la
evidencia sugiere que mTOR potencia la actividad transcripcional de HIF-1a sin afectar sus niveles
de ARNm o la tasa de degradación y en consecuencia puede regular positivamente su actividad por
otros mecanismos, posiblemente de acuerdo con el tipo de célula y el estado fisiológico (12). Por
otra parte, mTOR es principalmente conocido por ser un regulador negativo de la traducción
mediante la fosforilación de eIF2a, y de esta puede tener control en la expresión de una amplia
variedad de proteínas durante la condición de hipoxia (12).
De acuerdo con los estudios realizados en músculo, se puede sugerir que la disminución en la
síntesis de ATP está mediada por la respuesta transcripcional posterior a la exposición a hipoxia
que parece afectar procesos anabólicos que requieren una alta demanda de ATP celular. Lo anterior
sugiere que la inhibición de la síntesis de proteínas puede ser necesaria para mantener la
homeostasis celular y proporciona una adaptación rápida a la disponibilidad reducida de oxígeno,
donde la única evidencia indirecta de la inhibición de la síntesis de proteínas es la disminución de
mTOR (73). En general, los cambios en el proteoma a partir de fluidos biológicos y tejido muscular
son compatibles con la disminución de enzimas del ciclo de Krebs y la fosforilación oxidativa, por
lo cual es evidente que en respuesta a la condición de hipoxia, el control del gasto de energía es
crucial y por lo tanto, disminuye la síntesis de proteínas en tejidos como el músculo para mantener
el suministro de energía al sistema nervioso central y al corazón (71).
Considerando la complejidad de la respuesta a hipoxia durante el proceso de aclimatación, el
análisis de los perfiles de expresión diferencial de proteínas a partir de fluidos biológicos y tejidos
de individuos y modelos murinos sometidos a hipoxia hipobárica respecto a los controles a nivel
del mar han permitido postular algunos mecanismos subyacentes al proceso de aclimatación y a la
susceptibilidad de los individuos frente al AMS y el CMS. Sin embargo, a la fecha aún es difícil
establecer un consenso entre los estudios reportados a causa de las diferencias en el tiempo y la
altitud (61).
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
40
3. Justificación
La hipoxia hipobárica es una condición que genera diferentes mecanismos de respuesta derivados
de cambios a nivel molecular para compensar la disminución en la disponibilidad de oxígeno. Estos
mecanismos dependen principalmente del tiempo y el grado de exposición a la altitud. En los
estudios realizados hasta la fecha se han demostrado cambios en variables hematológicas y en el
proteoma sérico y plasmático que están relacionados con el ajuste fisiológico durante los procesos
de aclimatación y adaptación a la altitud en nativos a nivel del mar en altitud y nativos de grandes
altitudes.
Actualmente no hay un consenso que permita determinar el tiempo requerido para el proceso de
aclimatación en humanos, y tampoco se ha llegado a un consenso respecto a los cambios en el
proteoma que tienen lugar durante este proceso en nativos de la región andina a altitudes
moderadas. El estudio de las proteínas implicadas en los mecanismos de respuesta a hipoxia
hipobárica puede también ser relevante en otras situaciones en las que la hipoxia es característica.
De acuerdo con un reporte en 2004 de la organización mundial de la salud (OMS), el 22,46% de las
muertes en todo el mundo ocurre debido a la condición de hipoxia, ya sea de forma directa o
indirecta por patologías como isquemias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y diferentes
tipos de cáncer, entre otras.
El estudio de los mecanismos implicados en la respuesta a hipoxia hipobárica así como la
comprensión de los cambios en el proteoma durante el proceso de aclimatación tiene un gran
impacto a nivel clínico debido a la importancia de las proteínas como moléculas funcionales
responsables del ajuste fisiológico en respuesta a hipoxia. Por lo anterior, en este trabajo se
propuso la evaluación del proteoma sérico durante el proceso de aclimatación para determinar la
posible relación con parámetros hematológicos como una aproximación de carácter exploratorio
para la búsqueda de potenciales biomarcadores asociados a hipoxia hipobárica.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
41
4. Preguntas de investigación
A partir de lo expuesto anteriormente, se plantearon los siguientes interrogantes que dieron
lugar al desarrollo de este trabajo:
● ¿Es posible identificar cambios en el perfil de proteínas en suero durante el proceso de
aclimatación de individuos expuestos a la condición de hipoxia hipobárica mediante la
técnica de 2D-PAGE?
● ¿Qué proteínas presentan perfiles de expresión diferencial y en qué procesos biológicos
participan?
● ¿Es posible identificar un patrón en el comportamiento de variables hematológicas durante
el proceso de aclimatación?
● ¿Hay relación entre los cambios en parámetros hematológicos y el proteoma sérico
durante el seguimiento de individuos expuestos a hipoxia hipobárica?
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
42
5. Objetivos
5.1 Objetivo General
Establecer diferencias en el perfil de expresión de proteínas circulantes en suero durante el
proceso de aclimatación de individuos colombianos expuestos a hipoxia hipobárica.
5. 2 Objetivos Específicos
● Evaluar algunas variables hematológicas durante el seguimiento de individuos originarios
de baja altitud expuestos a la condición de hipoxia hipobárica.
● Reducir la complejidad proteica del suero sanguíneo para su posterior caracterización
electroforética.
● Determinar las condiciones experimentales que permitan la cuantificación y el análisis del
perfil de proteínas circulantes en suero mediante 2D-PAGE.
● Identificar algunas de las proteínas que se expresan diferencialmente en suero sanguíneo
inmunodepletado durante el seguimiento de individuos expuestos a hipoxia hipobárica.
● Establecer la posible función de las proteínas identificadas durante el proceso de
aclimatación.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
43
6. Materiales y métodos
En este capítulo se presenta la metodología propuesta para el desarrollo de este trabajo que
comprende la selección de los individuos que participaron en el estudio, la toma de muestras de
sangre de los participantes, el tratamiento de las muestras para la determinación de algunas
variables hematológicas y la evaluación del proteoma sérico mediante 2D-PAGE, con la
subsecuente identificación de algunas de las proteínas diferencialmente expresadas.
6.1 Selección de los individuos que participaron en el
estudio
Para el inició de este trabajo se contactó a los estudiantes admitidos a la sede Bogotá de la
Universidad Nacional de Colombia provenientes de zonas con un umbral de altitud <1400 msnm
con los cuales se socializó el propósito y la idea general del proyecto vía correo electrónico antes
de su llegada a Bogotá. Posteriormente, el día 1 después de su llegada a Bogotá (2600 msnm) se
socializó el proyecto en su totalidad. Para la selección se solicitó a los participantes responder una
encuesta básica relacionada con su estado de salud y actividad física para determinar si cumplían
con los criterios de inclusión y exclusión propuestos. Una vez el proyecto fue socializado y los
individuos manifestaron libre y voluntariamente su deseo de participar firmaron el consentimiento
informado ellos o sus acudientes, en caso de ser menores de edad.
Criterios de inclusión
✓ Haber nacido a una altitud por debajo de los 1400 msnm y haber vivido a ese umbral de
altitud durante mínimo 2 años
✓ Tener al menos 16 años al momento de participar
✓ Aceptar y firmar el consentimiento informado (acudiente en caso de menores de edad)
✓ Estar en disposición de realizar el seguimiento durante 3 meses
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
44
Criterios de exclusión
✓ Estar en estado de embarazo o lactancia
✓ Haber viajado a zonas de alta altitud en los últimos 6 meses o haber permanecido más de
un día en altitud
✓ Usar algún medicamento bajo prescripción medica
✓ Tener alguna enfermedad hematológica, respiratoria o renal diagnosticada por un médico
✓ Ser fumador
✓ Realizar actividad física de alta intensidad de manera recurrente
✓ Tener algún plan de alimentación especial (Ej: vegetariano, vegano, etc.)
Este estudio, antes de ser puesto en marcha, fue evaluado y aprobado por el comité de ética de la
facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia en Acta 09-2017 para su realización e
incluye el formato del consentimiento y asentimiento informado que fueron debidamente
socializados y firmados por los participantes (Anexo A). Una vez se verificó que los participantes
cumplían con los criterios propuestos se realizó el seguimiento por tres meses desde su llegada a
Bogotá. Durante la ejecución de este proyecto se aplicaron los protocolos de bioseguridad
requeridos, y se garantizó la protección de la identidad de los participantes, la confidencialidad de
la información y el uso exclusivo de los datos por los investigadores.
6.2 Toma de muestras de sangre y seguimiento
Con cada individuo se realizó la determinación del peso y la estatura, y la toma de una muestra de
sangre de la vena antecubital (4ml) recolectada en tubos al vacío con EDTA y gel separador (BD
Vacutainer® SST™) para la determinación de variables hematológicas y la evaluación del proteoma
sérico respectivamente los días 1,3,5,12,19,26,56 y 86 desde su llegada a Bogotá (2600 msnm)
(Tabla 3). Lo anterior corresponde a un experimento de riesgo mínimo (Resolución 008430 de 1993,
MinSalud).
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
45
Tabla 3. Toma de muestras de los individuos incluidos en el estudio.
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8
Día 1 3 5 12 19 26 56 86
Una vez se realizó la toma de cada una de las muestras de sangre se siguió el protocolo para la
determinación de algunas variables hematológicas y la separación del suero sanguíneo. Para esto,
el tubo con gel separador se invirtió suavemente entre 5 y 10 veces, y se dejó reposar a
temperatura ambiente durante 30 minutos para centrifugar a 3000rpm por 10 minutos a
temperatura ambiente. Posteriormente se aisló el suero obtenido y se adicionó el volumen
necesario de coctel inhibidor de proteasas P8340 (Sigma) en una relación de 1μl por cada 400μl de
suero, se mezcló y se realizaron alícuotas de 500μl para almacenar a -80°C hasta su análisis. El uso
de inhibidor de proteasas garantiza cambios mínimos en los espectros de proteínas obtenidos por
MS en los análisis posteriores (75).
6.3 Determinación de variables hematológicas
El día correspondiente a la toma de muestras de sangre durante el seguimiento de los participantes
se realizó la determinación de la concentración de Hb y el hematocrito (Hct) por duplicado a partir
de la muestra recolectada en tubos con EDTA.
Para la determinación de la concentración de Hb se usó el equipo OSM3 (Radiometer, Dinamarca),
que permite la cuantificación fotométrica de Hb usando un pequeño volumen de muestra (75µl).
Paralelo a esto, se realizó la determinación del Hct por el método de microhematocrito. Para esto
se llenó un capilar con el volumen de muestra requerido dejando medio centímetro en uno de los
extremos y se selló manualmente. La muestra se centrifugó a 5000rpm durante 5 minutos. Una vez
transcurridos los 5 minutos, el capilar se colocó en el respectivo lector para determinar el valor del
hematocrito como porcentaje.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
46
6.4 Tratamiento de la muestra de suero
Debido a la complejidad de proteínas que componen el suero sanguíneo y la abundancia de
proteínas como Alb e IgGs que dificultan su caracterización mediante electroforesis, fue necesario
realizar el tratamiento de las muestras para reducir su complejidad. Con este objetivo se empleó el
sistema ProteoPrep® (Blue Albumin and IgG depletion kit, Sigma-Aldrich) diseñado para remover
Alb e IgGs de suero humano para análisis en proteómica. Para esto, previamente se realizó una
dilución en relación 1:100 de suero: cloruro de sodio 0.15M para la cuantificación de proteínas
usando ácido bicinconínico (BCA), posteriormente se tomó el volumen (25-100μl) correspondiente
a una cantidad de proteínas totales entre 2 y 2,5mg para la depleción. El procedimiento realizado
se siguió de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y como se describe a continuación.
El medio suministrado en el kit para el acondicionamiento de la columna se agitó suavemente hasta
verificar una suspensión uniforme antes de usar, posterior a esto se transfirió un volumen de 400μl
a la columna que se colocó en un tubo nuevo de colección de 2ml y se centrifugó a 10000rpm por
1 minuto para remover el buffer de almacenamiento. Luego se verificó que el buffer de
almacenamiento se hubiera recolectado en el tubo de colección y se descartó conservando el
mismo tubo de colección. Posterior a esto se adicionaron 400μl del buffer de equilibrio a la columna
y se centrifugó a 10000rpm por 1 minuto, se descartó el buffer de equilibrio y se continuó usando
el mismo tubo de colección. Se agregaron nuevamente 400μl del buffer de equilibrio y se centrifugó
como se indicó anteriormente, se descartó el tubo de colección y se colocó la columna en un tubo
de colección nuevo. Con este procedimiento se preparó la columna para colocar el volumen de
suero correspondiente y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después se
centrifugó a 12000rpm por 1 minuto en un tubo de colección nuevo. El eluido recolectado en el
tubo de colección se pasó nuevamente por la columna y se incubó a temperatura ambiente durante
10 minutos para garantizar que la depleción fuera óptima. Después, la columna se centrifugó a
12000rpm por 1 minuto en el mismo tubo de colección que en el paso anterior. Para retirar el
remanente de proteínas no unidas se agregaron 100μl de buffer de equilibrio en el centro de la
columna en el mismo tubo de colección. Luego se centrifugó a 12000 rpm por 1 minuto y se
recolectó el eluido que corresponde a las proteínas no unidas.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
47
Posterior a la recolección del eluido de proteínas no unidas, se realizó la elución de proteínas unidas
a la columna y para esto se transfirió la columna a un tubo de colección nuevo y se agregaron 150
μl del reactivo de extracción tipo 4 suministrado por el kit (Urea 7M, Tiourea 2M, 1% C7BzO, 40
Mm Trizma, pH 10.4) en el centro de la columna. Luego se centrifugó la columna a 12000rpm por
1 minuto y se agregaron nuevamente 150μl del reactivo de extracción tipo 4 conservando el mismo
tubo de colección. A continuación, se centrifugó a 12000rpm y se verificó la recolección de un
volumen de 300μl.
El procedimiento descrito se realizó dos veces para obtener un volumen de 200μl del eluido de
proteínas no unidas y 600μl del eluido de proteínas unidas a la columna. Finalmente, con el
volumen correspondiente al eluido de proteínas no unidas se preparó una dilución de 1:40 en
cloruro de sodio 0.15M para la cuantificación con BCA y el volumen restante se almacenó a una
temperatura de -20°C.
6.4.1 Cuantificación de proteínas
La cuantificación de proteínas totales se realizó mediante el método de BCA a partir de la muestra
de suero sanguíneo y posterior a la depleción de Alb e IgGs. Este método se fundamenta en que las
proteínas reducen los iones cúpricos a cuprosos (Cu2+ ----> Cu1+) bajo condiciones alcalinas, y estos a
su vez reaccionan con el BCA para formar un complejo púrpura estable que permite la detección
colorimétrica a 570nm. Este método de cuantificación tiene varias ventajas entre las que se puede
destacar que tiene un límite de detección menor que otros métodos (Bradford y Lowry), presenta
linealidad en un amplio rango de concentraciones (200-1000μg/ml), menor susceptibilidad frente
a otros métodos respecto a la presencia de detergentes en la muestra y el complejo formado
producto de la reacción es estable.
Para la cuantificación se realizó una curva de calibración por duplicado de concentraciones
estándar entre 0-1000μg/ml de BSA (Bovine Serum Albumin) y se preparó la solución de trabajo
para la cuantificación de los patrones de BSA y las muestras en placas de 96 pozos. Para la
cuantificación de las muestras de suero y los eluidos de proteínas no unidas posterior a la depleción
se prepararon diluciones en relación 1:100 y 1:40 en cloruro de sodio 0.15M respectivamente. Para
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
48
la cuantificación se mezclaron 200μl de la solución de trabajo con BCA y 25μl de cada dilución y los
patrones. Las muestras se incubaron a 37°C por 30 minutos y se leyó la absorbancia en el lector de
placas de Elisa a una longitud de onda de 570nm verificando la formación de un complejo púrpura
hidrosoluble. La concentración de proteína en las muestras se determinó por comparación con la
curva estándar de BSA y se realizó por duplicado para cada una de las muestras.
6.4.2 Precipitación de proteínas
El suero sanguíneo contiene además de proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos, lípidos y sales
que dificultan el proceso de migración de las proteínas durante la electroforesis, así como
interferencias con los diferentes métodos de tinción de los geles. Por lo anterior, se han establecido
diferentes metodologías para eliminar este tipo de interferentes del suero, entre las más comunes
se destacan la diálisis, la ultrafiltración y la precipitación (76).
La precipitación de proteínas constituye un paso fundamental para eliminar agentes
contaminantes, garantiza que las proteínas presentes en la muestra se concentren y a su vez
permite desintegrar complejos proteicos e inactivar proteasas en un solo paso. Aunque con este
objetivo hay diferentes métodos, la selección del método más adecuado depende de varios
factores como son las características de la muestra, el análisis posterior de la misma, el número de
muestras y su manipulación. De acuerdo con todos los factores anteriormente mencionados y por
revisión en la literatura el método más adecuado para la precipitación de proteínas es el
tratamiento de las muestras con ácido tricloroacético-acetona (TCA-acetona) que favorece el
análisis posterior por 2D-PAGE. Con este método las proteínas son desnaturalizadas y solubilizadas
mediante agentes caotrópicos, detergentes y agentes reductores que son compatibles con la
electroforesis (76) (62).
Para la precipitación de proteínas con TCA-acetona se siguió un protocolo reportado previamente
(77). A partir de los resultados de la cuantificación de proteínas se tomó el volumen de suero
sanguíneo depletado correspondiente a una cantidad de proteínas totales de 500μg (77). A este
volumen se agregaron 10µl de TCA frío para una concentración final de 10% y el volumen se
completó con agua a 100µl. La muestra se incubó a -10°C durante 1 hora, y posterior a esto se
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
49
centrifugó a 10000rpm por 15 minutos (4°C). Se retiró el sobrenadante con pipeta y al pellet se
agregó un volumen de 50µl de acetona fría (-20°C). Posterior a esto, se centrifugó nuevamente a
10000rpm por 5 minutos (4°C). El paso anterior se repitió nuevamente y se descartó el
sobrenadante con pipeta. Se verificó que el pellet estuviera completamente seco y se resuspendió
en 325μl del buffer de rehidratación (7M urea, 2M tiourea, 2% CHAPS, 0.2% anfolitos-Biolyte) para
proceder a realizar la primera dimensión de la electroforesis.
6.4.3 Electroforesis bidimensional 2D-PAGE
Para la 2D-PAGE se siguieron protocolos previamente descritos (77). Se tomó el volumen de la
muestra solubilizada en buffer de rehidratación que corresponde a 500μg de proteínas totales en
un tubo eppendorf de 1,5ml y se adicionaron 12µl de DTT (1M) y 3µl de azul de bromofenol (1%)
para una concentración final de 40mM y 0.002% respectivamente en un volumen final de 340µl.
Posterior a esto se colocó todo el volumen de la muestra en la cubeta para el isoelectroenfoque
entre los dos electrodos evitando la formación de burbujas y con ayuda de pinzas se retiró el
plástico protector de la tira y se colocó el gel de la tira hacia abajo verificando que quedara
sumergido en el volumen de la muestra. La cubeta se cubrió con la tapa y se colocó en el dispositivo
Protean® IEF cell (Biorad) para dejar en rehidratación pasiva por 1 hora a temperatura ambiente.
Se usaron tiras de un gradiente de pH de 5-8 y 18cm de largo teniendo en cuenta que la separación
de las proteínas es favorecida usando este formato de acuerdo con la complejidad de la muestra
(Biorad, ref 1632036).
Una vez terminó el tiempo de rehidratación pasiva, se colocaron 2ml de aceite mineral (Biorad)
sobre la tira comenzando por un extremo hacia el centro para que esta quede completamente
sumergida y así evitar la deshidratación y el sobrecalentamiento durante el proceso. En el equipo
se especificó el número de tiras que se colocaron para iniciar la fase de rehidratación activa, así
como también se verificó el programa de isoelectroenfoque a 20°C (Tabla 4).
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
50
Tabla 4. Programa de Isoelectroenfoque para tiras de 18cm (76).
Voltaje Tiempo (Horas) Etapa
0 1 Rehidratación Pasiva-Sin
corriente
50 11 Rehidratación Activa
250 0,5 Rampa Rápida
1000 0,5 Rampa Rápida
1000 1 Constante
4000 0,75 Rampa Rápida
4000 1 Constante
8000 1 Rampa Rápida
10000 Hasta 60000 Rampa Rápida
500 5 Paso de seguridad- Rampa lineal
Al terminar el programa se retiró la cubeta del equipo y con ayuda de pinzas se sujetó la tira en
posición vertical en la cubeta para eliminar el exceso de aceite mineral. Posterior a esto, se ubicó
la tira con la parte del gel hacia arriba en una placa de equilibrio, cuando fue necesario las tiras se
guardaron en la placa a -20°C o -80°C dependiendo del tiempo de almacenamiento requerido hasta
correr la segunda dimensión.
Para realizar la segunda dimensión, se descongeló el volumen necesario de buffer de equilibrio y
se dispuso en un tubo falcón de 15ml, teniendo en cuenta que por tira se requieren 3ml de buffer,
en este mismo tubo se pesó la cantidad de ditiotreitol (DTT) requerida para la reducción de las
proteínas en la tira, teniendo en cuenta que por tira se requieren 60mg de DTT. El DTT se solubilizó
por inversión del tubo y a cada una de tiras en la placa de equilibrio se agregaron 3ml de buffer de
equilibrio con DTT. La placa se colocó en agitación horizontal moderada durante 15 minutos a
temperatura ambiente. Luego se descartó esta solución y se colocó el volumen necesario de buffer
de equilibrio en un falcón de 15ml y se pesó la cantidad de yodoacetamida (IOA) requerida de
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
51
acuerdo con el número de tiras (125mg por tira). La IOA se solubilizó en la cantidad del buffer
requerido y se colocaron 3ml a cada tira para realizar el segundo lavado por 15 minutos a
temperatura ambiente con agitación horizontal.
Paralelo al tiempo del isoelectroenfoque se preparó un gel SDS-PAGE al 12% (p/v) en condiciones
denaturantes que consistió en realizar el montaje requerido y la mezcla de acuerdo con el número
de geles necesarios (agua, tris-HCl 1.5M pH8.8, acrilamida 30%, bisacrilamida 0.8%, SDS 10%,
persulfalto de amonio 10% y tetrametiletilendiamina (TEMED)). Inmediatamente después de servir
la acrilamida, se colocó isopropanol al 10% y se esperó el tiempo necesario hasta verificar la
completa polimerización de los geles. Se retiró el isopropanol y se colocó el mismo volumen buffer
de corrida 1X sobre el gel. Luego con ayuda de pinzas se colocó la tira de gradiente de pH con el gel
hacia el frente verificando que estaba en contacto con la acrilamida. Posterior esto se sembraron
10μl del marcador de peso molecular con ayuda de unas pinzas y papel filtro en el extremo
izquierdo del gel. Luego se colocaron sobre la parte superior de la tira aproximadamente 2 ml de la
solución selladora de agarosa al 1% (p/v) con azul de bromofenol (0.01%) para fijar la tira y
visualizar el frente de corrida.
Una vez listo el montaje, se llenó la cámara de electroforesis con buffer de corrida 1X, y los geles
se corrieron a 60V hasta que el frente de corrida llegó al final del gel. Al terminar la electroforesis
se desmontaron los geles y se visualizaron por tinción con azul de Coomassie coloidal. Para esto se
siguió un protocolo de tinción que requiere de 4 soluciones con agitación horizontal continua en
cubetas usando un volumen de 200ml de cada solución por gel (Tabla 5).
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
52
Tabla 5. Soluciones para revelado de geles con Azul de Coomassie G-250
Solución Composición Tiempo
1 Etanol 50%, Ácido fosfórico 2%, Agua 3 horas
2 Agua destilada Lavados cada 20 minutos
por 3 veces
3 Etanol 18%, Ácido fosfórico 2%, Sulfato
de amonio 15%, Agua
1 hora
4 Azul de Coomassie G-250 2% Adición a la solución 3 de 2
ml de Coomassie coloidal.
Posterior a los 3 días de tinción de los geles con la solución 4 se realizaron sucesivos lavados con
agua milli-Q para eliminar el background y se documentaron en un analizador de imágenes
(Biorad). Los geles se conservaron en una solución de ácido acético al 5% hasta cortar los spots que
fueron seleccionados posteriormente para la identificación por MS.
Como parte del método seleccionado para la tinción de los geles es necesario destacar que el
agotamiento de proteínas abundantes como Alb e IgGs no es suficiente por sí solo para detectar
variaciones en proteínas de baja abundancia, y en consecuencia actualmente se emplean
diferentes métodos de tinción altamente sensibles para la visualización como son los métodos
basados en agentes fluorescentes como Oriole y Sypro Ruby (Biorad) entre otros, que permiten
detectar cantidades de proteínas hasta de 1ng. Sin embargo, el alto costo de estos métodos de
tinción ha limitado su uso, por lo cual uno de los métodos más usados para la tinción se realiza con
azul de Coomassie coloidal G-250. Este tiene la capacidad de formar complejos con ciertos
aminoácidos básicos como arginina, tirosina, lisina e histidina proporcionando una sensibilidad
para la detección de proteínas de 10ng, no produce un background muy intenso en el gel, es de
fácil aplicación y es compatible con técnicas como MS.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
53
6.4.4 Análisis de los geles obtenidos por 2D-PAGE
La visualización de los geles después de la tinción se realizó para su respectiva documentación y
para exportar las imágenes en formato .TIFF. El análisis posterior para determinar las posibles
diferencias entre los geles pertenecientes a un mismo individuo a lo largo del seguimiento se realizó
con el software Delta 2D (Decodon). La elección del programa de análisis fue un criterio
fundamental debido a que con el tiempo se han desarrollado diferentes software que presentan
diferencias en el esquema de flujo de trabajo y tienen como fundamento dos categorías diferentes,
algunos tienen como criterio inicial la detección de spots y otros el solapamiento de las imágenes,
con este último enfoque se ha determinado que es posible evaluar de forma más rápida la
expresión diferencial de proteínas. Independientemente de la categoría a la que pertenece cada
software, su implementación garantiza que los resultados puedan ser evaluados objetivamente y
que sea posible extraer información respecto a los cambios de expresión a nivel de proteínas,
teniendo en cuenta que los algoritmos implementados en la detección de spots tienen como
objetivo superar la distorsión de las imágenes y las dificultades propias de la migración
electroforética que afectan la detección de spots, la cuantificación y la creación de perfiles de
expresión.
Delta 2D es un software que tiene como principio el solapamiento de imágenes. Esto permite
realizar la comparación entre las imágenes tomadas en diferentes tiempos y sus respectivas
réplicas, en este caso permitió realizar la comparación entre las imágenes obtenidas a lo largo del
seguimiento de cada individuo. Este software tiene un algoritmo de filtrado de imágenes para
eliminar el ruido de fondo. Esto permite optimizar la cuantificación y solapar las imágenes para la
asignación de spots mediante vectores en un gel fusión que incluye los spots de todos los geles
para su posterior modelamiento gaussiano. De esta manera es posible generar un mapa del
proteoma que es representativo de todo el experimento. Aunque la detección de los spots es
automática, la asignación de los vectores se realizó de forma manual para corroborar los resultados
del solapamiento entre los geles. La comparación entre los spots se realizó eligiendo como
parámetro la normalización del volumen que se usó para asignar el valor de fold change (FC). Para
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
54
seleccionar los spots que presentaron los mayores cambios en el tiempo se tuvo en cuenta el gel
fusión generado por Delta 2D para todos los puntos de tiempo de cada individuo (Figura 7).
Figura 7. Flujo de trabajo para el análisis de spots en Delta 2D. En el diagrama se especifican cada
uno de los pasos desde la adquisición de las imágenes para el análisis con Delta 2D hasta la selección
de algunos de los spots para su identificación por MS.
Luego de la asignación y filtrado de los spots, se realizó un análisis de agrupamiento con base en el
volumen normalizado. La normalización de volumen generalmente es la mejor opción para análisis
en proteómica porque en este tipo de estudios los valores de los volúmenes de cada spot no
presentan en un 100% una distribución normal debido a que entre los spots de mayor abundancia
hay mayor varianza. Existen diferentes tipos de algoritmos de agrupación (clustering) basados en
modelos de conectividad, centroides, distribución y densidad. Entre los más comúnmente usados
se destacan los algoritmos de agrupación jerárquica que se encuentran clasificados dentro de
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
55
modelos de conectividad y consisten en métodos no supervisados de aprendizaje de máquinas o
“machine learning”. Estos algoritmos de agrupamiento jerárquico están basados en diferentes
medidas de distancia (Euclidiana, Manhattan, etc) y utilizan como criterio una distancia mínima
para encontrar grupos que no deben superponerse. Además, tienen numerosas aplicaciones
porque permiten la visualización intuitiva de complejos pero pequeños conjuntos de datos para el
reconocimiento de patrones, análisis de imágenes y bioinformática. En este trabajo se realizó el
agrupamiento jerárquico de los spots mediante distancia euclidiana y se obtuvieron clusters que se
pueden visualizar como un dendograma.
Otro tipo de algoritmo ampliamente usado para el agrupamiento es K-means, este es un modelo
basado en centroides y determina la variación entre los datos para la asignación de grupos basado
en el cálculo de la mediana y no la media como comúnmente se hace, lo cual minimiza el error en
todos los grupos para que sean “compactos”. Las similitudes en los datos se miden comúnmente
con la distancia; partiendo de la hipótesis de que dos o más objetos estarán en un grupo particular
si están estrechamente relacionados en función de una distancia dada. Aunque existen varios
enfoques de agrupamiento, aún surgen dificultades para encontrar una técnica de agrupamiento
adecuada para determinados conjuntos de datos experimentales. Sin embargo, el análisis basado
en K-means es un método de agrupamiento por partición que está integrado en Delta 2D y se
empleó para la obtención de clusters de spots para cada individuo. Lo anterior con el objetivo de
evidenciar si algunos de los spots pertenecientes al mismo cluster tenían funciones biológicas
relacionadas, y debido a que se tiene como antecedente que este algoritmo es ampliamente usado
para el análisis de conjuntos de datos biológicos (78).
A partir del agrupamiento realizado con los valores del FC y el valor de p obtenido de la prueba t
de student para cada spot en Delta 2D, se identificó el punto de tiempo en el que se presentaba
mayor cambio usando diagramas de volcano. Este tipo de gráficas es ampliamente usado en el
análisis de grandes conjuntos de datos en ciencias ómicas. Finalmente, la combinación de estos dos
parámetros (FC≥2 y p≤0.05) fue el criterio para seleccionar los spots que fueron identificados
mediante MS (Figura 7).
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
56
6.5 Identificación de proteínas por espectrometría
de masas
A partir del análisis comparativo de las imágenes con Delta 2D se seleccionaron algunos spots entre
los dos individuos que cumplían con los criterios antes mencionados para su identificación. Aunque
un buen número de spots cumplieron con el criterio de selección, debido a limitaciones
presupuestales solo fue posible usar 12 de estos para su identificación. Los spots seleccionados
fueron cortados manualmente y se transfirieron a un tubo eppendorf de 0.6ml con agua Milli-Q
para su identificación por huella peptídica MS/MS mediante MALDI-TOF/TOF en la Unidad de
proteómica de la Universidad de Córdoba (España).
Según el protocolo seguido por la unidad de proteómica para la identificación de los spots, los
fragmentos de gel se digirieron con tripsina usando dos pasos de destinción de 30 minutos a 37ºC
con 100mM bicarbonato amónico/50% acetonitrilo; dos rondas de lavado con 25mM bicarbonato
amónico y dos más con 25mM bicarbonato amónico/50% acetonitrilo, durante 15 minutos cada
una; deshidratación con 100% acetonitrilo durante 5 minutos y secado de la muestra a temperatura
ambiente. A continuación, las muestras se hidrataron con 20ml de tripsina porcina (Promega)
preparada en 25mM bicarbonato amónico a 12.5ng/ml, durante 45 minutos a 4ºC; se retiró la
tripsina sobrante y se añadieron 20ml de 25mM bicarbonato amónico, incubando las muestras a
37ºC durante 12 horas o bien en microondas a 200W en dos pasos de 5 minutos.
La digestión se detuvo añadiendo a cada muestra 1ml de una solución de ácido trifluoracético (TFA)
al 10% en agua. Los péptidos resultantes de la digestión con tripsina, se purificaron mediante una
microcolumna de resina C18 (ZipTip, Millipore), eluyéndose directamente con una solución de
matriz (1,4mg/ml de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico preparada en 85% acetonitrilo, 15% agua,
0.1% TFA y 1mM NH4H2PO4) sobre la placa MALDI en un volumen de 2ml.
Tras la cristalización sobre la placa, las muestras se analizaron en un espectrómetro de masas
MALDI-TOF/TOF Ultraflextreme de Bruker, controlado por el software flexControl 3.4, en el rango
m/z de 700 a 3500Da en reflector y modo positivo.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
57
Los espectros MS fueron analizados con el software flexAnalysis 3.4. Se realizó calibración interna
de los espectros utilizando las relaciones masa/carga (m/z) de los péptidos resultantes de la
autolisis de la tripsina porcina (M+H+=842.509, M+H+=2211.104), obteniéndose de esta manera
una precisión en la medida de las m/z de ± 20ppm. De cada muestra se obtuvieron espectros de
fragmentación (MS/MS) de las ocho m/z más intensas.
La identificación de proteínas se realizó teniendo en cuenta los espectros MS y sus
correspondientes MS/MS sobre la base de datos de UniProt (UniProt: the universal protein
knowledgebase) utilizando MASCOT v2.6 (Matrix Science Ltd., London;
http://www.matrixscience.com) como motor de búsqueda, integrado en el programa Protein
Scape 4.0 (Bruker), con carbamidometilación completa de los residuos de cisteína y oxidación
parcial de los residuos de metionina. El error máximo permitido en la búsqueda fue de 50 ppm para
el precursor, 0.5Da para los fragmentos MSMS y el número máximo de errores en el corte de la
proteasa fue uno. Se consideraron positivas las proteínas identificadas con score superior a 60.
Es importante destacar que la identificación exitosa de proteínas depende de la calidad de los datos
generados por el espectrómetro de masas, el método empleado en la búsqueda de datos y los
motores de búsqueda. En este trabajo los resultados se corroboraron por huella peptídica
(búsqueda con los datos de masas) y MS/MS o LIFT (búsqueda con los datos de la fragmentación
de péptidos) que confirma en todos los casos el resultado de la búsqueda utilizando MASCOT.
Actualmente, MASCOT es el motor de búsqueda más usado y su sistema de puntuación estadístico
Mowse calcula la probabilidad de un emparejamiento aleatorio entre un pico del espectro y la
relación m/z calculada a partir de la secuencia de un péptido o fragmento para cada una de las
entradas de la base de datos. De acuerdo con el número de picos realmente emparejados y los
calculados por azar, se ordenan los candidatos en un ranking de puntuación o lista priorizada que
incluye las proteínas que presentan mayor probabilidad de corresponder con la proteína analizada
en función de su huella peptídica y el emparejamiento de péptidos.
Posteriormente, los códigos de acceso de Uniprot de las proteínas identificadas se cargaron en
STRING (http://string-db.org/) para obtener una red de interacción entre las proteínas
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
58
identificadas y luego se evaluó el enriquecimiento de los términos GO correspondientes de acuerdo
con la categorías de proceso biológico en STRING y Gonet (http://tools.dice-database.org/GOnet/)
para establecer su posible relación con el ajuste fisiológico que tiene lugar durante la aclimatación.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
59
7. Resultados y discusión
En este capítulo se presentan los resultados obtenidos junto con los respectivos análisis a partir de
la metodología propuesta para el desarrollo de este trabajo. Este comprende la evaluación de las
variables hematológicas, el análisis de los perfiles proteicos obtenidos, la identificación de spots y
su posible asociación con el proceso de aclimatación.
7. 1 Variables hematológicas
Para el desarrollo de este trabajo se contó con la participación de seis individuos que cumplieron
con los criterios de inclusión y exclusión propuestos, y a su vez manifestaron presentar hábitos de
alimentación saludable y tanto ellos como sus padres son procedentes de altitudes cercanas a nivel
del mar. Las características antropométricas de los individuos incluidos se muestran en la tabla 6,
uno de ellos (P5) fue excluido porque no continuó con el seguimiento.
Tabla 6. Características generales de los individuos incluidos en el estudio. *Índice de masa
corporal. Género: F: Femenino. M: Masculino.
INDIVIDUO GENERO EDAD
(Años)
ESTATURA
(cm)
PESO
(kg)
IMC*
(kg/m2)
LUGAR DE
ORIGEN-ALTITUD
(msnm)
P1 M 19 172,0 68,8 23,3 Saravena-223
P2 F 18 153,0 52,7 22,5 Arauca-125
P3 F 17 156,5 59,6 24,5 Yopal-390
P4 M 18 172,0 117 39,6 Arauca-125
P6 M 22 166,0 66,8 24,2 Saravena-223
P7 M 25 163,0 57,7 21,7 Arauquita-165
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
60
La evaluación de variables hematológicas ha sido la primera aproximación para la compresión de
los mecanismos fisiológicos que tienen lugar en la altitud durante la aclimatación, por lo cual fue
uno de los componentes de este trabajo. Entre las variables más estudiadas se encuentran masa
de Hb, el Hct y la concentración de Hb. En este trabajo se realizó la evaluación de estas dos últimas.
Específicamente, el Hct representa el porcentaje de glóbulos rojos en un volumen de sangre y
depende de su número y tamaño, y de otro lado, la concentración de Hb hace referencia a la
concentración de esta en un volumen determinado. Los valores de referencia a nivel clínico para el
Hct de individuos a nivel del mar están en un intervalo de 38-47% para hombres y mujeres, y el
promedio de la concentración de Hb para mujeres mayores de 21 años se ha reportado como 13.8
g/dl (12.0-15.6) y para hombres 15.5g/dl (13.5-17.5).
Los valores obtenidos de estas variables para los individuos incluidos en el trabajo se encuentran
dentro de los valores de referencia reportados (Figuras 8,9). Como se puede observar, hay
diferencias claras entre el promedio de la concentración de Hb y el porcentaje de Hct para mujeres
(P2, P3, Hb: 13,14g/dl-Hct: 40,8%) y hombres (P1, P4, P6, P7, Hb: 16,17 g/dl-Hct: 48,9%), que se
atribuyen al género principalmente, debido a que es evidente que el valor promedio es más alto
para los hombres respecto a las mujeres (Figuras 8,9).
Figura 8. Valores del porcentaje de hematocrito. A. Porcentajes de Hct para mujeres. B. Porcentaje
de Hct para hombres. En la figura se observa el promedio de los datos obtenidos para cada uno de
los individuos durante el seguimiento (M1-M8) correspondiente a los días 1,3,5,12,19,26,56 y 86.
Mujeres n=2 y hombres n=4. La línea punteada roja representa el intervalo de referencia del
porcentaje de Hct para mujeres y hombres. Las líneas verticales sobre cada barra representan el
valor máximo y mínimo.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
61
A.
B.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
62
Figura 9. Valores de la concentración de hemoglobina A. Concentración de Hb para mujeres. B.
Concentración de Hb para hombres. En la figura se observa el promedio de los datos obtenidos
para cada uno de los individuos durante el seguimiento para todas las muestras 1-8 del seguimiento
correspondiente a los días 1,3,5,12,19,26,56 y 86. Mujeres n=2 y hombres n=4.
A.
B.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
63
En cuanto a los valores iniciales y finales durante el seguimiento para la concentración de Hb y el
porcentaje de Hct se observó un incremento respecto al valor inicial excepto para el individuo 1 y
6 respectivamente (Figuras 8,9 Anexos B,C). En general, los resultados respecto a las dos variables
analizadas son heterogéneos entre los individuos, y por lo tanto es evidente que a lo largo del
seguimiento no hay ninguna tendencia de normalización, y aunque así fuera, sería discutible
establecer un punto de ajuste constante después de los tres meses de seguimiento que represente
una forma de aclimatación exitosa debido al tamaño de la muestra.
Con los resultados de las dos variables analizadas es posible determinar el valor de la Hb
corpuscular media con la relación ((Hb/%Hct) *100). Esta es una medida que establece la relación
entre la concentración de Hb y el Hct, y permite determinar la cantidad de Hb por glóbulo rojo. En
los primeros días de seguimiento, en los hombres se presenta un mayor incremento de la
concentración de Hb por glóbulo rojo respecto a las mujeres y posteriormente se observan cambios
menores, excepto para el caso de las mujeres que presentan un pico atípico en la muestra que
corresponde al día 56 del seguimiento (Figura 10). Esto puede ser debido a que ellas
probablemente se encontraban en la fase lútea de su ciclo menstrual y por esto se presenta un
efecto de hemoconcentración. Teniendo en cuenta que uno de los criterios de inclusión en el
estudio fue no realizar actividad física de alta intensidad, tal vez es de esperarse que a una altitud
moderada no ocurrieran cambios drásticos en las dos variables analizadas ya que la demanda de
oxígeno es menor en individuos sedentarios comparados con individuos activos.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
64
Figura 10. Concentración de hemoglobina corpuscular media. Valores promedio de la
concentración de Hb corpuscular media para todos los individuos durante el seguimiento. Los
puntos corresponden al valor promedio y las barras a los valores mínimos y máximos.
Por otra parte, en este trabajo se propuso un esquema de seguimiento de los individuos durante 3
meses con el objetivo de evaluar las respuestas agudas y crónicas que tienen lugar durante el
proceso de aclimatación, sin embargo, a la fecha no hay un consenso que permita determinar el
tiempo requerido para el proceso de aclimatación en humanos. Con los resultados de estudios que
han realizado la evaluación de variables hematológicas, se ha evidenciado que durante el proceso
de aclimatación hay cambios determinantes a nivel fisiológico que están relacionados con la
producción de EPO y son dependientes de la altitud, debido a que a mayor altitud se presentan
cambios significativos. Sin embargo, estos no se mantienen después de 24 horas en la mayoría de
los individuos, lo cual constituye evidencia de que con el tiempo se reduce la magnitud del estímulo
eritropoyético (13) (38).
Como es ampliamente conocido la concentración de Hb es un componente clave para el transporte
de oxígeno, sin embargo, su utilidad como marcador de aclimatación y adaptación altitudinal
todavía no es claro debido a que se han documentado diferencias en esta variable entre individuos
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
65
de diferentes poblaciones a la misma altitud, lo que pone en evidencia que los cambios además de
estar relacionados con el tiempo de exposición a la altitud, también dependen del origen étnico.
Por otro lado, aunque el ajuste hematológico más relevante durante la exposición a hipoxia
hipobárica es el incremento de la capacidad sanguínea para transportar oxígeno, los factores
determinantes para este ajuste son la disminución del volumen plasmático inicial (exposición
aguda) y el posterior incremento en la síntesis de Hb y eritrocitos (exposición crónica).
Bajo la condición de hipoxia, la respuesta eritropoyética se alcanza hasta que la presión arterial de
oxígeno disminuye aproximadamente a 65-70Torr, lo que se corresponde con una altitud entre
2500 y 3000 msnm. Por lo cual parece que a altitudes mayores a 2100 msnm ocurre la liberación
continua de EPO, sin embargo, no ha sido posible determinar un umbral bajo el cual se favorece su
producción y liberación sostenida (38). Así mismo, se ha determinado que hay grandes diferencias
en la respuesta eritropoyética de acuerdo al género, lo cual está relacionado con la carga de
testosterona y estrógenos en hombres y mujeres. Específicamente, el aumento de testosterona en
individuos expuestos a hipoxia hipobárica se ha relacionado con una respuesta favorable durante
la aclimatación debido a que esta hormona regula la eritropoyesis y la ventilación en diversas
especies de mamíferos, incluyendo humanos, así como también está relacionada con la
disponibilidad de hierro en el organismo, junto con la hepcidina. Por otra parte, se ha postulado
que las hormonas sexuales femeninas pueden modular la ventilación hipóxica al afectar la
secreción dopaminérgica del cuerpo carotídeo. De hecho, en un estudio de 2006 se reportó que los
esteroides ováricos estimulan la ventilación al disminuir el impulso inhibidor dopaminérgico
periférico, y los resultados demuestran que la regulación dependiente de la ventilación hipóxica
implica la interacción entre la EPO y los esteroides sexuales (79). En su conjunto, lo anterior
constituye evidencia de que las hormonas cumplen una función importante en el proceso de
aclimatación a pesar de que los mecanismos subyacentes siguen siendo poco conocidos (80).
Aunque la mayoría de los estudios ha sugerido que el patrón característico de nativos a nivel del
mar en altitud consiste en un aumento de la concentración de Hb y el porcentaje de Hct para
mejorar la capacidad aeróbica, esto puede tener un efecto negativo debido a que el aumento
excesivo de la concentración de Hb genera eritrocitosis y dificulta la oxigenación de los tejidos al
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
66
aumentar la viscosidad sanguínea y la resistencia vascular (13,18). Como un ejemplo de esto, el
aumento en nativos de grandes altitudes se ha asociado con policitemia y en las mujeres se ha
determinado que hay una menor incidencia de CMS en edad premenopáusica que aumenta luego
de la menopausia. Lo anterior constituye evidencia de que los efectos negativos producto de la
condición de hipoxia hipobárica tienen lugar cuando hay alteraciones en los mecanismos de
respuesta a esta condición (30), y por lo cual se ha establecido que el tiempo y el grado de
exposición son los factores fundamentales en la respuesta a hipoxia hipobárica.
Respecto al tiempo de exposición en altitud, en diferentes estudios se ha reportado que este factor
es determinante en cuanto a los cambios que se pueden presentar en la concentración de Hb y el
porcentaje de Hct en habitantes de tierras bajas, debido a que el aumento de glóbulos rojos
depende de la altitud y la respuesta eritropoyética del volumen inicial de glóbulos rojos, porque
tanto en hombres como en mujeres una concentración inicial baja de Hb genera un aumento más
dramático a mayores altitudes que aquellos con una concentración de Hb inicial más alta (81). Así
mismo, los individuos más jóvenes, independientemente del género, también presentan un
aumento más dramático a mayores altitudes que los individuos mayores de 60 años. Paralelo a
esto se ha determinado que el tiempo de exposición a altitudes por encima de los 4000 msnm debe
ser superior a 2 semanas para que tenga lugar un efecto estadísticamente significativo en la
concentración de Hb, así como a altitudes más bajas (1300-2950 msnm) se requieren tiempos de
exposición más prolongados (13).
En el análisis de variables hematológicas es importante destacar que el patrón de adaptación de
nativos de grandes altitudes difiere de los habitantes de tierras bajas, lo cual está directamente
relacionado con los mecanismos de respuesta regulados por los HIFs como principales mediadores
de la respuesta molecular y fisiológica a hipoxia que induce procesos a nivel sistémico como la
eritropoyesis (30). Dado los efectos pleiotrópicos de la cascada de señalización de los HIFs, no es
claro si la concentración de Hb es el objetivo fenotípico directo de la selección natural o si
representa un efecto de selección sobre otro rasgo fisiológico que está regulado por la señalización
de los HIFs (30).
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
67
Estudios previos en población colombiana universitaria a diferentes altitudes han determinado que
con el incremento de la altitud hay un incremento de la concentración de Hb y el Hct y este a su
vez es mayor en los hombres respecto a las mujeres, lo cual está de acuerdo con nuestros
resultados como se puede evidenciar por comparación entre la muestra inicial y final del
seguimiento (19). En este mismo sentido, las diferencias por género en el porcentaje de Hct, la
masa y la concentración de Hb se atribuyen principalmente a factores como el contenido de masa
muscular y grasa corporal, y los niveles de testosterona. Además, se ha establecido que la
determinación de estas variables en las mujeres en edad reproductiva depende de la fase del ciclo
menstrual y la carga hormonal principalmente (82). Lo anterior teniendo en cuenta que las
diferencias en la respuesta eritropoyética son dependientes del género y como se ha reportado las
mujeres presentan un menor incremento en las respuestas asociadas a eritropoyesis que los
hombres respecto a los valores en la concentración y masa de Hb, el Hct y la concentración de EPO,
lo cual se ha sugerido puede ser debido a que presentan mayores valores de la saturación arterial
de oxígeno como una ventaja ventilatoria por las hormonas sexuales femeninas que modulan la
respuesta eritropoyética (82) (83).
En diferentes estudios también se ha reportado que el incremento rápido y masivo de la
concentración de Hb y el Hct en altitud se debe a un efecto de hemoconcentración provocado por
un desplazamiento de fluidos hacia el intersticio. En consecuencia, durante la fase aguda de
aclimatación el incremento observado en estas variables puede ser causado por una reducción del
volumen de plasma y no por un incremento de la tasa de producción de eritrocitos, teniendo en
cuenta que el volumen de plasma puede disminuir debido a un efecto de deshidratación a causa
del patrón de respiración y la inspiración de aire frío y seco, así como por otros factores como la
ingesta reducida de líquidos y la diuresis (25). Lo anterior incrementa el contenido de oxígeno en
la sangre arterial a valores superiores a los observados al arribo a la altitud. Sin embargo, aunque
el volumen plasmático disminuye en la altitud, este aumenta nuevamente al regresar a menor
altitud, y esta capacidad de oscilación se ha evidenciado aún después de 20 años de exposición a
cambios continuos de altitud (82). Por lo anterior, la oscilación entre ciclos de hipoxia-normoxia, es
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
68
evidente tanto en el volumen total de sangre como en la concentración de Hb, el porcentaje de Hct
y la concentración de EPO plasmática (84).
De acuerdo con lo anterior, la respuesta diurética hipóxica se ha relacionado también con cambios
en la concentración de hormonas relacionadas con la diuresis, la natriuresis y la función renal. Por
ejemplo, existen reportes que indican la disminución en la fase aguda de aclimatación de los niveles
de aldosterona, la hormona antidiurética (ADH), y un aumento en los ANPs, lo que podría explicar
el comportamiento del volumen plasmático, sin embargo, los estudios sobre las variaciones de este
durante la hipoxia hipobárica son escasos. En este mismo sentido, un estudio demostró que,
aunque hombres y mujeres aumentan la producción de orina a los 3 días de exposición a 3500
msnm, solo en los hombres disminuyen los niveles de ADH y renina, mientras que, en las mujeres
este fenómeno se presentó a mayor altitud y tiempo de exposición, por otra parte, los ANPs
aumentaron en hombres a los tres días y en las mujeres no hubo cambios, lo cual se relaciona con
la pérdida del volumen plasmático en las mujeres.
Por último, el comportamiento observado para las variables evaluadas en los individuos incluidos
en el estudio corresponde con lo que se ha reportado en la literatura. Aunque estos parámetros
son evaluados comúnmente como indicadores del proceso de aclimatación, se ha establecido que
estos son variables de acuerdo con factores como la dieta, el género y la edad, y en consecuencia
no son suficientes para dar cuenta del proceso de aclimatación en humanos. Esto también sugiere
la existencia de mecanismos de respuesta diferencial inter e intraindividuos que dependen
principalmente del género y la edad (15,16). Por lo anterior, es evidente la necesidad de realizar la
determinación de otras variables hematológicas como la masa de Hb y la saturación arterial de
oxígeno que no dependen del volumen, así como la concentración de EPO que pueden ser
indicadores más objetivos de los cambios relacionados con el transporte de oxígeno en
comparación con las otras variables ya descritas. En el caso de la determinación de la masa de Hb,
el método para su determinación es sensible y ha sido útil para establecer diferencias entre
residentes de varias altitudes, así como para comprobar el efecto del entrenamiento físico. De
hecho, la evidencia sugiere el aumento en la masa de Hb en altitudes moderadas como efecto de
la aclimatación (15,16), aunque también es importante destacar que esta puede incrementar por
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
69
efecto del entrenamiento regular de resistencia, el uso de EPO humana recombinante y
transfusiones sanguíneas (84).
7. 2 Tratamiento de las muestras de suero y
obtención de perfiles proteicos por 2D-PAGE
La cuantificación de proteínas totales en las muestras de suero extraídas a lo largo del seguimiento
de cada individuo se realizó con BCA. Los resultados obtenidos muestran que la concentración de
proteínas totales en las muestras no fue homogénea (Figura 11). Este hecho puede atribuirse a
factores como diferencias en la dieta, variaciones genéticas, efectos del entorno, entre otros. Sin
embargo, la mayoría de las muestras se encuentra dentro del intervalo reportado de proteínas
totales en suero (60-80mg/ml) de adultos sanos y la baja concentración en algunas muestras puede
ser debida a la disminución en la cantidad de Alb que constituye más de la mitad de la cantidad de
proteínas totales en suero, lo cual se ha relacionado principalmente con la dieta de los individuos
(Anexo D) (55).
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
70
Figura 11. Concentración de proteínas totales en suero completo. En la figura se observa la
concentración de proteínas totales determinada con BCA de cada una de las muestras del
seguimiento (1-8) para los individuos P1, P2, P3, P6 y P7 (P1, P6 y P7: hombres y P1,P2: mujeres).
El intervalo señalado con líneas punteadas hace referencia a la concentración de proteínas totales
en suero de individuos sanos.
En cuanto a la depleción de Alb e IgGs se determinó el volumen de suero requerido para realizar la
depleción de una cantidad de proteínas totales entre 2 y 2,5mg teniendo en cuenta que esta es una
cantidad óptima para realizar dos lavados de la columna y recolectar un mayor volumen de la
fracción de proteínas unidas y no unidas a la columna. Para las muestras de suero con baja
concentración de proteínas totales se tomó el volumen que corresponde a una cantidad de 2,5mg,
y se garantizó que no se saturara la matriz de la columna. Es así como para la depleción se tuvo en
cuenta la cantidad de proteína y el volumen de suero a depletar (25-100μl) como recomienda el
fabricante. Como indicador de la eficiencia de la depleción se determinó que el porcentaje
promedio de recuperación de proteínas totales fue de 60% (Figura 12), para lo cual también hay
que destacar que la cantidad de Alb e IgGs en cada muestra es variable.
Mediante SDS-PAGE se puede observar la separación electroforética de una muestra de suero
sanguíneo depletada en condiciones reductoras, con lo cual se verificó la presencia de las proteínas
en los eluidos de proteínas no unidas y unidas a la columna (Figura 12).
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
P1 P2 P3 P6 P7
Co
nce
ntr
aci
ón
(m
g/m
l)
Individuos
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
71
Figura 12. Depleción de Alb e IgGs en suero mediante el sistema ProteoPrep Blue. A. Gel SDS-
PAGE 12%. M: Marcador de peso molecular. S: Suero sin depletar. EU: Eluidos de proteínas unidas
a la columna. ENU: Eluidos de proteínas no unidas o suero depletado. En todos los carriles se
cargaron 16 µg de proteínas totales. En el gel se destacan las bandas de peso molecular que
corresponden a la Alb (67kDa) y las IgGs, cadenas ligeras (25kDa) y pesadas (50kDa). B.
Representación del rendimiento promedio de la depleción de todas las muestras de suero, el suero
depletado tiene un 40% menos de Alb e IgGs.
A. B.
En la electroforesis se pueden observar bandas bien definidas de peso molecular variable, así como
también se observa la diferencia entre la cantidad de Alb en el eluido de proteínas no unidas y el
eluido de proteínas unidas a la columna, con lo cual se puede verificar que el proceso de depleción
fue eficiente aunque no completo.
Actualmente hay diferentes kits comerciales para realizar la inmunodepleción de las proteínas más
abundantes en el suero y el plasma sanguíneo, y se ha evidenciado que aunque sólo se realice la
inmunodepleción parcial de IgGs y Alb, el número de spots en un gel de 2D-PAGE aumenta
dramáticamente (53). En este sentido los resultados obtenidos de la depleción fueron un buen
punto de partida para las posteriores 2D-PAGE.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
72
7.3 Análisis de los geles obtenidos por 2D-PAGE
Debido al número de muestras sanguíneas recolectadas para cada uno de los participantes en el
estudio y a limitaciones presupuestales, para la evaluación del proteoma mediante 2D-PAGE se
seleccionaron únicamente dos individuos (P1 y P6) a los cuales se hará referencia en adelante como
individuos 1 y 2 respectivamente.
Con las muestras de suero depletadas se realizó la 2D-PAGE y se obtuvieron los geles para cada una
de las muestras del seguimiento de los dos individuos, con lo cual también se verificó la eficiencia
de la depleción, ya que no se observaron señales muy intensas que generen distorsión del perfil
electroforético (Figura 13, Anexo F). A continuación, se realizó el análisis comparativo de los geles
2D-PAGE para cada una de las muestras del seguimiento tomando como referencia o control la
muestra del día uno de cada individuo.
Figura 13. Imágenes del perfil de proteínas obtenido mediante 2D-PAGE. Geles obtenidos para el individuo 1
durante el seguimiento. Rango de gradiente de pH de 5 a 8 y valores de peso molecular en kDa del marcador de peso molecular.
Días 1 3 5 KDa 𝑝𝐻 5 8 5 8 5 8
45 35 25
Días 12 19 26 KDa 𝑝𝐻 5 8 5 8 5 8
45 35 25
Días 56 86 KDa 𝑝𝐻 5 8 5 8
45 35 25
En general, los geles de 2D-PAGE obtenidos a partir de las muestras de suero de los dos individuos
muestran una buena resolución en cuanto a la separación de los spots con un patrón de distribución
regular a lo largo de los geles y entre geles para el mismo individuo. En los geles se observan spots
bien definidos y patrones de separación de spots comparables, indicando que la metodología
empleada fue adecuada. Además, en los extremos de los geles, es decir a valores de pH menor de 5.5
y mayor a 7.5 no se observa un gran número de spots, lo cual evidencia una buena separación entre
los spots, teniendo en cuenta que las proteínas evaluadas se encuentran dentro del rango de pH
fisiológico.
Mediante la técnica de 2D-PAGE fue posible obtener perfiles electroforéticos para comparar la
expresión de spots de forma cualitativa y cuantitativa. Se minimizaron los coeficientes de variación
producto de factores inmersos en la técnica mediante la corrida de varios geles al tiempo bajo las
mismas condiciones para reducir la posibilidad de artefactos resultantes de la manipulación. Esto se
logró usando el sistema PROTEAN Plus Dodeca Cell (Biorad) y a través del uso de un software que
permitió el procesamiento y la comparación de imágenes. Aunque este tipo de análisis aún no es
completamente automatizado, es crucial para la cuantificación y la creación de perfiles de expresión
para el análisis estadístico, lo cual ha mantenido la técnica de 2D-PAGE vigente para el estudio de
proteomas (62) (85).
Con el uso del software Delta 2D inicialmente se llevó a cabo un control de calidad de las imágenes
obtenidas de los geles de 2D-PAGE. Para esto se cargaron las 16 imágenes que corresponden a cada
una de las muestras del seguimiento con su respectiva réplica y se seleccionó una imagen de
referencia que para este caso constituye la muestra del primer día del seguimiento para cada
individuo. Posteriormente, se realizó el agrupamiento de los geles de cada individuo y las imágenes
se alinearon o emparejaron de forma semiautomática (Figura 14).
Figura 14. Agrupación de los geles correspondientes al seguimiento con Delta 2D. Agrupación de las
imágenes correspondientes a los geles de uno de los individuos para la detección de spots con el
software Delta 2D. En la figura se observa la agrupación de las muestras (M1-M8) y su respectiva
réplica para el análisis, y en el centro se representa el gel que corresponde a la muestra control.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
75
Los spots detectados por el software se revisaron y editaron manualmente para crear un gel fusión
en el cual se realizó nuevamente la curación manual de los spots, cualquier spot que mostrara
anomalías debido a streaking (distorsión/rayas) o se considerara como artefacto se descartó. Los
spots de áreas muy saturadas o que mostraban algún tipo de tendencia a distorsionarse también se
descartaron independientemente de que mostraran o no un perfil de expresión diferencial entre las
muestras, esto con el fin de eliminar falsos spots y corregir falsos emparejamientos. El criterio para
la normalización de los spots fue el volumen ya que este permite corregir la variación técnica entre
muestras y a la vez otorga robustez al análisis para obtener un valor de intensidad normalizado de
cada spot en los diferentes geles.
Posteriormente se realizó el análisis de los perfiles de expresión para cada spot y se obtuvieron los
valores de la media, la desviación estándar, la tasa de cambio (ratio o FC) y el valor de p para cada
uno a partir de una prueba t de student usando el valor del volumen normalizado. Para el individuo
1 y 2 se detectaron un total de 1423 y 1771 spots respectivamente en el conjunto de geles que
corresponden al seguimiento. Estos fueron curados manualmente a partir de cada uno de los geles y
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
76
el gel fusión que es una imagen representativa de los perfiles proteicos obtenidos para cada una de
las muestras del seguimiento, con lo cual se llegó a un consenso en el gel fusión de 66 y 40 spots
respectivamente (Figura 15) (Anexo E).
Figura 15. Gel fusión obtenido a partir del análisis de los geles de 2D-PAGE con Delta 2D. En círculos
azules se encuentran los spots detectados y curados manualmente, y el número corresponde al ID de
los spots seleccionados (como se describe posteriormente) para su identificación por MS. A la
izquierda se muestran dos bandas del marcador de peso molecular como guía. A. Individuo 1. B.
Individuo 2.
A.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
77
B.
Con los resultados del análisis comparativo de las imágenes de los geles con Delta 2D se evidenció que hay
spots que presentan cambios en la intensidad a lo largo del seguimiento, lo cual se corroboró por el FC y
el valor de p a partir de una prueba t de student. La relación de estos dos valores se muestra en las gráficas
de volcano. El valor de FC es útil ya que es poco probable que el cambio en la intensidad de un spot sea el
resultado de un fenómeno aleatorio, además, la combinación con el valor de p constituye un criterio fuerte
para la selección de los spots que serían identificados mediante MS (Figura 7).
Para la comparación de los patrones de expresión de los spots obtenidos para cada individuo se usaron
las herramientas integradas en Delta 2D. Se realizó un análisis de agrupación jerárquica usando la función
HCl (hierarchical clustering) por distancia euclidiana y ligamiento completo (complete linkage). Los
resultados se visualizaron en un dendograma y un mapa de calor donde el color representa la intensidad
escalada de cada spot (filas) para cada una de las muestras del seguimiento (columnas), lo cual es un
primer paso para evaluar la calidad de los datos cuantitativos y a la vez identificar spots con un perfil de
expresión similar.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
78
Los valores del volumen normalizado para cada spot se usaron para realizar el agrupamiento jerárquico y
obtener grupos de spots representados en un dendograma. En el dendograma obtenido para el individuo
1 (Figura 16 A), se tienen dos grupos bien diferenciados (1 y 2) y de acuerdo con el mapa de calor, se
observa que en uno de los dos grupos (marcado como 1 en la figura) hay un aumento de la expresión a lo
largo del seguimiento con un pico en la muestra 7 correspondiente al día 56. En el segundo grupo, que
corresponde a un mayor número de spots respecto al grupo 1, se observa un aumento en la expresión
desde el inicio del seguimiento hasta la muestra 4 (día 12) y posteriormente disminuye, este grupo se
subdivide a su vez en 2 subgrupos (Figura 16.2A y 2B), de los cuales el 2A muestra un aumento en la
expresión en la muestra correspondiente al día 26.
Por otra parte, para el individuo número 2 se identificó un menor número de spots que se distribuyen en
dos grupos con menor similitud entre ellos comparados con el individuo 1 (Figura 16 B). En el segundo
grupo (marcado como 2 en la figura) disminuye la expresión entre las muestras 1 y 4 y posteriormente
entre la muestra 5 y 8 aumenta, entre los cuales se destacan algunos spots que presentan un pico en la
muestra 6 y 7. En el primer grupo se observa la tendencia contraria, y en la muestra 6 disminuye la
expresión para todos los spots pertenecientes a ese grupo. Algunos spots se seleccionaron de forma
preliminar mediante el análisis de clustering y posteriormente se ratificaron en la gráfica de volcano al
combinar el FC con el valor de p en el respectivo punto de tiempo donde el cambio fue mayor.
Figura 16. Agrupamiento jerárquico de los spots. Dendograma y mapa de calor obtenido para cada
individuo. Cada columna corresponde a una muestra con su respectivo replicado y cada fila a un spot
donde la escala de color indica si el nivel de expresión es bajo (azul) o alto (amarillo). A. Individuo 1. B.
Individuo 2. P1M1-M8: Muestras del seguimiento que corresponden a los días 1,3,5, 12,19,26, 56 y 86. En
el recuadro rojo se encuentran los spots seleccionados para identificación por MS.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
79
A.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
80
B.
Además del agrupamiento jerárquico, también se realizó un agrupamiento de los spots usando el
algoritmo K-means, con un valor K de 10 (Tabla 7).
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
81
Tabla 7. Asignación de spots de acuerdo al agrupamiento por K-means
Individuo 1 2
Cluster
N° de spots
% de spots
en el grupo
Cluster
N° de spots
% de spots en
el grupo
Cluster
1 11 16 8 20
2 7 10 6 15
3 5 7 6 15
4 4 6 4 10
5 4 6 3 7
6 4 6 3 7
7 2 3 3 7
8 9 13 4 10
9 11 16 2 5
10 11 16 2 5
Total 66 100 44 100
La aplicación de algoritmos de agrupamiento es una primera aproximación que permite suponer que
las proteínas que pertenecen a los mismos grupos están involucradas en procesos biológicos
relacionados, aunque no hay evidencia que permita determinar qué tipo de interacción (directa o
indirecta) hay entre las proteínas que se asignan al mismo grupo. Por ejemplo, puede ser que las
proteínas dentro del mismo grupo estén co-reguladas por una proteína reguladora común. En este
mismo sentido, el análisis de grupos o la validez de los resultados de agrupamiento clasificados entre
los métodos de aprendizaje no supervisado constituye una aproximación para establecer la posible
relación entre las proteínas que pertenezcan al mismo cluster y un proceso biológico determinado.
Figura 17. Clusters de spots seleccionados por K-means para identificación. En el recuadro rojo se
encuentran los spots seleccionados para identificación por MS. A: Individuo 1. B. Individuo 2.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
82
A.
B.
Con la finalidad de comprobar la distribución de los spots analizados en las muestras del seguimiento
para los dos individuos, así como su relación con el nivel de significancia estadística, se realizó una
gráfica de volcano para cada muestra del seguimiento. En esta gráfica se representan dos variables
fundamentales ya mencionadas, el valor de FC y el valor de p, aunque estas parecen ser dos
magnitudes muy diferentes, se definen como una medida directa de las diferencias entre los datos y
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
83
la asociación con la aplicación de pruebas estadísticas respectivamente, y la transformación
logarítmica permite establecer su relación. La gráfica de volcano es una gráfica de dispersión
bidimensional que representa (−log10) del valor p de la prueba t de student en el eje Y y el (log10) del
FC en el eje X (86). Por lo anterior, para la identificación de spots que presentaron cambios
significativos durante el seguimiento para cada individuo se tuvieron en cuenta las regiones de interés
en la gráfica que corresponden a los spots que se encuentran hacia la parte superior del gráfico que
están ubicados a la izquierda o a la derecha del eje central y que están más dispersos respecto al
origen (FC≥2, p <0.05) (Figura 18, Anexos H,I).
Figura 18. Gráfica de volcano para la muestra del día 56 del seguimiento de los individuos. Izquierda:
Individuo 1. Derecha: Individuo 2. En el eje Y de la gráfica se representa (–log10) del valor de p y en el
eje X el (log10) del FC para cada uno de los spots. En color naranja esta representados los spots que
cumplen con el umbral (línea roja punteada, FC≥2 y p <0.05) y en azul todos los demás. Los números
corresponden a los ID de algunos de los spots identificados.
Como se puede observar en las gráficas de volcano (Figura 18), hay spots con diferencias significativas
(p<0.05) en su expresión y valores de FC superiores a 2 (FC≥2) para los dos individuos. Teniendo en cuenta
estos dos criterios, se escogieron algunos spots para su identificación, sin descartar que hay otros que
cumplen con los dos criterios propuestos y pueden ser interesantes para su identificación en trabajos
posteriores. En este trabajo, a partir de los resultados obtenidos en el dendograma para el individuo 1 del
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
84
primer grupo se seleccionó el spot 938 y del segundo los spots 423, 392, 495, 496 y 498 para un total de
seis (Figura 16). Para el individuo 2, del primer grupo se seleccionó el spot 486 y del segundo grupo los
spots 401, 493, 299, 1277 y 523, para un total de seis spots (Figura 16).
Así mismo por comparación entre las gráficas para todas las muestras del seguimiento es posible
evidenciar que en la muestra correspondiente al día 56 del seguimiento para los dos individuos hay un
mayor número de spots que presentan cambios más representativos en cuanto a las otras muestras del
seguimiento, lo que puede sugerir que en este punto de tiempo pueden ocurrir cambios determinantes
durante la aclimatación (Anexo H). Lo anterior teniendo en cuenta que el estímulo principal al cual estaban
sometidos los individuos era la hipoxia hipobárica, por lo que es razonable asumir que las diferencias
detectadas a nivel del proteoma puedan ser atribuidas en gran medida a esta condición. Sin embargo, es
importante destacar que parte de los cambios en la expresión de proteínas en los individuos puede ser
debido a efectos no relacionados con el proceso de aclimatación.
Actualmente la evaluación de perfiles de expresión diferencial tanto de ARNs como de proteínas sigue
siendo un tema de investigación activo, por lo cual la gráfica de volcano, los mapas de calor y los gráficos
de agrupación se encuentran entre las herramientas visuales más útiles para el análisis de matrices que
son ampliamente usadas en experimentos ómicos, donde por lo general se consideran grandes conjuntos
de datos (86). Aunque sería interesante evaluar el nivel de repetibilidad de las diferencias específicas en
el proteoma de los dos individuos para determinar la relación en los resultados obtenidos durante el
seguimiento; nuestro objetivo no pretendía comparar las diferencias entre individuos sino los cambios en
el proteoma de cada individuo respecto al tiempo de seguimiento planteado, teniendo en cuenta
diferencias entre los individuos como el estado nutricional, la edad, el estado de salud y también debido
a limitaciones en el número de muestras en el presente trabajo.
7.4 Identificación de proteínas
Este trabajo como la mayoría de los estudios que usan la técnica de 2D-PAGE fue de tipo exploratorio
porque tuvo como objetivo generar hipótesis respecto a la posible función de las proteínas identificadas
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
85
mediante MS en el contexto biológico de la hipoxia hipobárica. Conceptualmente en este trabajo se
abordó el enfoque Bottom up que actualmente es el más usado en proteómica, teniendo en cuenta la
robustez y reproducibilidad de la espectrometría de masas MS/MS. Esta técnica fue elegida para el análisis
de spots por su rapidez y elevada sensibilidad para la identificación de proteínas a gran escala.
De acuerdo con el perfil de expresión obtenido para cada uno de los spots seleccionados para su
identificación por MS, se puede destacar que estos presentaron un perfil diferencial a lo largo del
seguimiento con picos de aumento o disminución que son más evidentes entre los días 19 y 86 del
seguimiento respecto a los primeros días (Figura 19). A partir de los spots seleccionados se identificaron
7 proteínas que presentaron cambios significativos en el proteoma de los dos individuos analizados y
respecto a las cuales se postulará su posible función durante el proceso de aclimatación a hipoxia
hipobárica. Todos los spots seleccionados se identificaron de forma exitosa excepto el spot 495 (Tabla 8).
Figura 19. Perfil de expresión diferencial de los spots identificados para cada individuo. En color azul se
representa la diferencia en el perfil de expresión para cada spot respecto al seguimiento en el tiempo.
m1v1 y m1v2 corresponden a la muestra y su respectiva réplica. En las gráficas se observa en el eje X las
muestras correspondientes al seguimiento con sus respectivas réplicas y en el eje Y el logaritmo del FC, el
número arriba en cada gráfica corresponde al ID de cada spot. A. Individuo 1. B. Individuo 2.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
86
A.
B.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
87
Tabla 8. Identificación de spots correspondientes al proteoma sérico de individuos expuestos a
hipoxia hipobárica.
Individuo
Spot ID
Grupo/
Cluster
FC*
Peso
molecular
teórico (kDa)
Punto
Isoeléctrico
teórico
Proteína
Código
Uniprot
1
423 2 ≥2 69.3 5.9 Albúmina P02768
392 1 ≥2 51.6 6.5 Hemopexina P02790
496 1 ≥5
51.5
5.4
Cadena gamma
de Fibrinógeno
P02679
498 1 ≥2
938 8 ≥2 23 5.8 Proteína de
unión a retinol
P02753
2
299 1 ≥5 77 6.8 Serotransferrina P02787
401 8 ≥2 69.3 5.9 Albúmina P02768
486 2 ≥2
46.7
5.4
Inhibidor 1 alfa
de Antitripsina
P01009 493 9 ≥2
523 1 ≥2
1277 1 ≥2 30.8 5.6 Apolipoproteína
AI
P02647
*Valor de FC en el gel fusión.
Respecto a las proteínas que se identificaron a partir del análisis de spots para el primer individuo,
los spots 496 y 498 corresponden a isoformas de la cadena gamma de fibrinógeno (Fgg) que difieren
en su punto isoeléctrico y están considerados en el mismo cluster que se caracteriza por presentar
un aumento en su expresión en la muestra del día 3 de seguimiento (Figura 19). Específicamente, el
fibrinógeno es un componente mayoritario del plasma que también está presente en suero
sanguíneo, y está constituido por dos conjuntos de tres cadenas polipeptídicas alfa, beta y gamma.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
88
Esta proteína actúa como sustrato para la formación de coágulos de fibrina y en la unión a plaquetas
para desencadenar la agregación plaquetaria, es producida en el hígado en respuesta a la
estimulación con citoquinas y tiene una vida media de 3 a 5 días, por lo cual se ha reportado puede
reflejar el estado del desarrollo tumoral e inflamatorio de un individuo. Por lo anterior, el fibrinógeno
se considera como una proteína que hace parte de la categoría de proteínas de fase aguda en la
respuesta temprana a diversos procesos como inflamación, traumatismo, entre otros (87), y su
incremento al tercer día del seguimiento puede estar relacionado con la condición de inflamación
que se ha reportado tiene lugar en hipoxia hipobárica (87).
Por otra parte, también se ha reportado que el factor de crecimiento de fibroblasto (FGF-2), la
interleuquina 1 alfa (IL-1a) y VEGF se unen al fibrinógeno y de esta forma potencian la proliferación
de células endoteliales y estimulan su actividad, lo cual pone en evidencia la participación del
fibrinógeno en procesos biológicos que se relacionan con la regulación del tono vascular y la
angiogénesis en hipoxia (88).
Otro de los componentes previamente mencionados por su alta abundancia en el suero sanguíneo es
la Alb, por lo cual constituye una de las dificultades en la obtención de perfiles electroforéticos
mediante 2D-PAGE, y es ampliamente aceptado el uso de diferentes sistemas de depleción para
obtener perfiles de buena resolución que a su vez permitan visualizar proteínas de baja abundancia.
La Alb fue de las proteínas identificadas por presentar cambios significativos respecto al FC durante
el seguimiento en los dos individuos (spot no. 423 y 401) (Anexo E), sin embargo, es controversial
establecer su posible función como biomarcador en cualquier condición fisiológica o fisiopatológica
debido a su alta abundancia.
En un estudio que realizó la evaluación del proteoma pulmonar en modelos murinos, se propone la
importancia de la Alb por su actividad antioxidante relacionada con el estrés oxidativo que tiene lugar
por exposición a grandes altitudes. La Alb se ha reportado como una proteína de fase aguda regulada
negativamente y uno de los principales antioxidantes en el líquido del revestimiento del tracto
respiratorio, que también incluye mucina, superóxido dismutasa, glutatión, ácido úrico y ácido
ascórbico. Lo anterior debido a que un grupo tiol libre en una cisteína convierte a la Alb en la proteína
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
89
con mayor capacidad para eliminar especies reactivas en suero, por lo cual se ha sugerido su
capacidad para amortiguar el estrés oxidativo. Aunque el perfil de expresión de la Alb no presenta
una tendencia clara a partir de los dos spots de los cuales se identificó, se puede observar su
disminución al día 19 de exposición (Figura 19), lo cual podría poner en evidencia que después de
varios días de exposición continua tiene lugar la acumulación de especies reactivas, y posteriormente
su expresión retorna a niveles basales, así mismo, la disminución en la expresión de Alb se ha
relacionado con una mayor expresión de mediadores proinflamatorios y la inactivación de anti-
proteinasas (89).
De otro lado, una de las funciones de la Alb es garantizar el transporte de hormonas tiroideas y del
grupo hemo, esta última como una función secundaria debido a que presenta menor afinidad por el
grupo hemo respecto a la Hpx, que es la principal proteína encargada del transporte de este grupo.
Esta última fue una de las proteínas identificadas en el proteoma sérico de uno de los individuos, y
es la encargada de unirse al grupo hemo para transportarlo al hígado para su degradación,
contribuyendo así al reciclaje de hierro. La Hpx reduce la reactividad del grupo hemo libre y permite
su distribución hacia los receptores CD91 en hepatocitos para su completa degradación por la hemo
oxigenasa-1 (HO-1). Lo anterior es relevante teniendo en cuenta que el grupo hemo libre proveniente
de la Hb puede activar el receptor TLR4 (toll-like receptor 4) en plaquetas y células del endotelio,
promoviendo la señalización proinflamatoria que puede generar isquemias y lesiones en diferentes
tejidos en modelos murinos.
La Hpx pertenece a la clasificación de proteínas de fase aguda y el aumento de su concentración
plasmática se ha relacionado con su función antioxidante en nativos de gran altitud y modelos
murinos expuestos a hipoxia hipobárica entre 0 y 24 horas (89). De acuerdo con su perfil de expresión,
esta proteína aumenta en la muestra del día 3 de seguimiento, lo que puede ser posible debido al
rápido incremento de la concentración de Hb ante el estímulo hipóxico y su posterior retorno a
niveles basales. Está proteína pertenece al mismo cluster que la Fgg (Figura 17), por lo cual también
puede estar implicada en procesos relacionados durante la fase aguda de la aclimatación.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
90
Otra de las proteínas identificadas a partir de la evaluación de los cambios en el proteoma fue RBP4,
(spot no. 938), que aumenta después del día 26 de seguimiento (Figura 19). RBP4 es la única proteína
transportadora de retinol en el plasma humano y se ha reportado que durante trastornos
inflamatorios su síntesis hepática se ve suprimida por citoquinas, lo cual depende de la duración y la
gravedad del estímulo. A su vez, la disminución de RBP4 genera la liberación de retinol en formas
fisiológicamente activas que favorecen el aumento de su concentración en sangre y su excreción en
orina, lo cual se ha reportado puede ser un indicador de estrés agudo respecto a individuos sanos. El
retinol libre se dirige a una variedad de receptores de la superficie celular, por lo cual se distribuye
en diferentes tejidos, principalmente en células epiteliales del plexo coroideo y órganos que
pertenecen al compartimento visceral (hígado, intestino delgado, médula ósea). Después de cruzar
la membrana celular se forman derivados retinoides que modulan la diferenciación de las células T
epiteliales y la regulación y maduración de las células B a través de la estimulación por citoquinas.
En nativos a nivel del mar en altitud, RBP4 se ha reportado como una proteína regulada
negativamente como en este trabajo, y se ha propuesto que tiene una posible función durante el
inicio de la inflamación endotelial vascular en estrés oxidativo debido a la secreción de TNF-a y un
conjunto variable de citoquinas IL-6, IL-1b, IL-2, IL -12, IL-10 (16). Por otra parte, en un estudio para
la identificación de biomarcadores en individuos con HAPE, se reportó que RBP4 se encontraba
aumentada en el plasma sanguíneo (92), por lo cual su aumento se puede sugerir como un indicador
de riesgo de sufrir efectos negativos por exposición a hipoxia hipobárica.
A partir de los spots seleccionados para el segundo individuo, se identificó la serotransferrina o
transferrina (Tf), una proteína responsable del transporte de hierro desde los sitios de absorción y
degradación del grupo hemo a los de almacenamiento y utilización, lo cual se puede relacionar con
el que hecho de que los valores para este individuo se encuentran entre los más altos respecto al
promedio de la concentración de Hb a lo largo del seguimiento (Anexos B, C). Lo anterior teniendo
en cuenta que la actividad de esta proteína está relacionada con el transporte de hierro para la
síntesis de Hb y su homeostasis como un factor protector ante los efectos negativos que se pueden
generar por exposición a hipoxia hipobárica. Previamente se ha reportado que la Tf es una proteína
regulada negativamente en nativos de grandes altitudes, lo cual se puede atribuir a la eritrocitosis y
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
91
al efecto tóxico del hierro libre. En su conjunto, la evidencia sugiere asociaciones importantes entre
la concentración de hierro y la fisiología de las respuestas ante la condición de hipoxia hipobárica
(90).
Respecto al perfil de expresión durante el seguimiento, la Tf presenta un pico en el día 26 que sugiere
que incluso después de varios días de exposición a hipoxia hipobárica (Figura 19), el transporte de
hierro es determinante, lo cual también puede tener explicación debido a que el hierro es cofactor
de las PHDs, enzimas encargadas de regular negativamente a los HIFs, de los cuales a su vez depende
la expresión de Tf. A su vez el aumento en la expresión de Tf se ha relacionado con la disminución de
la actividad de HIF-2a, que está implicado en los mecanismos de respuesta a la hipoxia crónica (91).
En general, los HIFs tienen un papel clave en la regulación de la expresión de proteínas relacionadas
con la homeostasis sistémica e intracelular de hierro mediante proteínas como el transportador de
metal divalente 1 (DMT1), la ferroportina 1 (FPN1), el citocromo b duodenal (Dcytb), el receptor de
transferrina (TfR), la hepcidina, y las proteínas reguladoras de hierro (IRPs). Estas proteínas están
involucradas en la absorción, el almacenamiento, la utilización y la exportación de hierro, y
constituyen un mecanismo de regulación a nivel transcripcional y post-transcripcional, que a su vez
depende de la disponibilidad de este (91).
En un estudio comparativo del proteoma entre nativos Ladakhi y controles a nivel del mar, se
encontró que la Tf aumenta su expresión mientras que la Hpx y la Fgg disminuyen en nativos de altitud
moderada (93), lo cual puede ser indicador de la importancia del transporte de hierro en altitud y la
disminución en la expresión de Hpx y fibrinógeno debido a la reducción en la degradación del grupo
hemo producto de la atenuación de la eritropoyesis y la inflamación respectivamente.
Por otra parte, en la identificación por MS es común observar que diferentes spots corresponden a
la misma proteína como es el caso de los spots 523, 493 y 486 que se identificaron como el A1T1.
Esto puede ser debido a la presencia de diferentes isoformas que varían en su punto isoeléctrico y se
pueden originar por variación alélica a nivel génico, corte y empalme alternativo (splicing) de ARN,
presencia de diferentes modificaciones post-traduccionales (glucosilación, fosforilación, etc) y/o
degradaciones parciales de la proteína.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
92
A1T1 es una proteína ampliamente conocida como un inhibidor de serina proteasas, elastasa de
neutrófilos, proteinasa 3 y catepsina G. También se ha caracterizado como una proteína
antiinflamatoria e inmunorreguladora independientemente de su actividad antiproteasa. En
individuos saludables, los niveles plasmáticos oscilan entre 0,9 y 2 g/L, mientras que en inflamación
aguda o infección sus niveles aumentan de cuatro a cinco veces respecto al rango normal (94). Varios
estudios han propuesto la relación entre los niveles bajos de A1AT con diabetes mellitus tipo II e
infección por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). En esencia, la importancia de A1T1 radica
en el mantenimiento de la homeostasis proteasa-antiproteasa, debido a su capacidad para inhibir
otras clases de proteasas como metaloproteasas y cisteína-aspárticas, por lo cual se considera un
inhibidor de amplio espectro, y es probable que sea más eficiente en la regulación de las respuestas
inflamatorias respecto a los inhibidores de proteasas específicas (94). Esta es una de las proteínas de
fase aguda más abundantes en la circulación e interactúa con otras moléculas que pueden provocar
oxidación, degradación, formación de complejos, autoensamblaje u otras modificaciones y así
generar nuevas formas moleculares con actividad biológica, lo cual puede explicar la complejidad de
sus funciones (94). A su vez, se ha demostrado que A1T1 puede presentar varias modificaciones post-
traduccionales entre las que se destacan la nitrosilación, oxidación, polimerización y/o interacción
con lípidos que pueden regular la respuesta inflamatoria (56) (94). Se ha propuesto que la síntesis y
liberación de A1AT es importante tanto en el proceso inflamatorio agudo como en la fase de
resolución, aunque los mecanismos de sus efectos siguen sin ser comprendidos completamente.
A1AT es un regulador fisiológico del gen angptl4 que codifica una proteína de fase aguda implicada
en la homeostasis de glucosa, la sensibilidad a la insulina y el metabolismo de lípidos. Este gen es
blanco de HIF-1a y se ha relacionado con angiogénesis, enfermedades cardiovasculares, crecimiento
tumoral, diabetes, inflamación y cicatrización de heridas (95). En la literatura se ha reportado que la
deficiencia de A1T1 genera daño tisular inducido por la elastasa como hiperextensibilidad de la piel,
enfermedad pulmonar obstructiva crónica y enfermedad hepática, por lo cual su regulación positiva
en hipoxia hipobárica se puede relacionar con un factor protector frente a HAPE. De acuerdo con las
propiedades antiinflamatorias de A1T1, se identificó otra proteína que pertenece a esta categoría
funcional y su expresión se ha encontrado aumentada en individuos con HAPE, es Apo AI. Esta
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
93
proteína desempeña un papel crítico en la protección de la función de la arteria pulmonar y las vías
respiratorias, así como en la prevención de la inflamación, el depósito de colágeno en el pulmón y la
regulación del metabolismo de lípidos para el mantenimiento de la composición lipídica normal (92).
Apo AI es el principal componente proteico de las lipoproteínas de alta densidad (HDL), y se ha
reportado que posee propiedades vasculares protectoras que proporcionan actividad antioxidante,
antiinflamatoria y antiapoptótica en el endotelio. En un estudio comparativo entre ratas Sprague
Dawley tolerantes y susceptibles a hipoxia hipobárica, se encontró que Apo AI es regulada
positivamente en animales susceptibles (61), por lo cual se espera que esta sea una proteína de
regulación negativa en individuos que no presentan ningún efecto adverso por exposición a hipoxia
hipobárica. Por otra parte, Apo AI también se ha descrito como un potencial biomarcador en cáncer
mediante diferentes enfoques proteómicos (87).
De acuerdo con los perfiles de expresión para Apo AI y A1T1, Apo AI presenta un aumento al día 26
del seguimiento (Figura 19), lo que puede sugerir su acción como antiinflamatorio y antioxidante
mientras que A1T1 presenta picos de aumento y disminución a lo largo del seguimiento y no hay un
consenso entre los perfiles de expresión de los tres spots a partir de los cuales se identificó, sin
embargo, en el intervalo comprendido entre los días 19 y 56 es donde presenta mayor variabilidad.
Por lo anterior, se puede sugerir que tanto Apo AI como A1T1 están implicadas en la fase crónica del
proceso de aclimatación y corresponden con la evidencia que las postula como marcadores del
proceso de adaptación en nativos de grandes altitudes.
Por otra parte, tres de las proteínas identificadas a partir de los spots seleccionados en el individuo 2
(Tf, A1T1 y Apo AI) pertenecen al mismo cluster (Figuras 16,17), y también tienen en común que son
proteínas de transporte relacionadas con la actividad antioxidante, y su importancia radica en su
capacidad para enfrentar el estrés oxidativo en la altitud. Un estudio previo que comparó las
proteínas plasmáticas de nativos de gran altitud respecto a las de un grupo control a nivel del mar
encontró que la Hpx, A1T1 y Apo AI estaban reguladas positivamente, mientras que RBP4 disminuyó
bajo la condición de hipoxia hipobárica (16). En este trabajo, todas las proteínas identificadas
presentaron patrones de expresión diferencial a lo largo del seguimiento y se caracterizan por
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
94
pertenecer al grupo de proteínas de fase aguda relacionadas con la inflamación y la capacidad
antioxidante, por lo cual su expresión puede facilitar el control rápido y eficaz del daño inflamatorio
y el estrés oxidativo (61).
Debido a que la respuesta integrada ante la condición de hipoxia hipobárica en humanos es poco
entendida, existen varias controversias sobre el tiempo en que ocurren adaptaciones específicas, el
grado de hipoxia en que ocurren y la especificidad de los tejidos en los que ocurren (63). En este
trabajo, se identificaron proteínas de alta abundancia en suero sanguíneo que se ha reportado están
relacionadas con diferentes patologías, por lo cual no se puede asegurar su función como
biomarcadores de la condición de hipoxia hipobárica. Lo anterior pone de manifiesto la necesidad de
caracterizarlas para comprender su mecanismo de regulación en procesos relacionados con el
requerimiento de energía de las células, la capacidad de transporte de oxígeno de la sangre y la
homeostasis durante la aclimatación (61).
De otro lado, para establecer la posible relación entre las proteínas identificadas se construyó una
red con STRING. Esta última es una base de datos biológicos construida a partir de numerosas fuentes
que integra información de interacciones proteína-proteína identificadas y predichas, ya sea directas
(físicas) o indirectas (funcionales) para un gran número de organismos. La red se construyó a partir
de evidencia experimental para Homo sapiens con un nivel de confianza alto (Figura 20), y en esta se
puede observar la posible interacción entre todas las proteínas identificadas excepto RBP4, por 6
nodos con 11 conexiones y un valor de p de enriquecimiento de 2.23e-10, que sugiere que estas
proteínas presentan más interacciones entre sí de lo que lo que se esperaría para un conjunto
aleatorio de proteínas de tamaño similar, y en consecuencia indica que participan en procesos
biológicos estrechamente relacionados.
Figura 20. Red de interacción de las proteínas identificadas usando STRING. Red obtenida usando
un score de alta confianza (0.700) sin nodos adicionales. Cada nodo denota una proteína, las líneas
representan interacciones entre las proteínas y el grosor indica el nivel de confianza asociado con
cada interacción. Los colores representan el proceso biológico en el que participan cada una de las
proteínas que se encuentran en la red. Rojo: degranulación de plaquetas. Azul: Modificación post-
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
95
traduccional de proteínas. Verde claro: Transporte mediado por vesículas. Morado: Regulación de la
producción de mediadores de la respuesta inmune. Verde oscuro: Transporte. Las siglas
corresponden a cada una de las proteínas, ALB: Albúmina, TF: Transferrina, APOA1: Apolipoproteína
AI, SERPINA: Inhibidor 1 alfa de antitripsina (A1T1), FGG: Cadena gamma de fibrinógeno. HPX:
Hemopexina.
STRING permite establecer la relación entre las proteínas de la red de acuerdo con los tres dominios
de los términos GO que corresponden a componente celular, función molecular y proceso biológico.
En la red se destacan los términos GO que corresponden a la categoría de proceso biológico debido
a que estos permiten establecer la posible relación entre las proteínas identificadas y el conjunto de
funciones moleculares en las que participan, para proponer su posible asociación con el ajuste
fisiológico que tiene lugar en la altitud. De esta forma, la anotación funcional reveló que los procesos
biológicos más representativos para estas proteínas están relacionados con degranulación de
plaquetas, modificación post-traduccional, transporte mediado por vesículas y regulación de
mediadores de la respuesta inmune, entre otros que ya se han reportado previamente (Tabla 9).
Aunque en la red RBP4 está representada como un nodo independiente, las siete proteínas
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
96
identificadas están implicadas en procesos relacionados con el transporte y la regulación de la calidad
biológica (Tabla 9). De acuerdo con la actividad de las proteínas identificadas, la función de transporte
puede estar relacionada con iones y moléculas pequeñas como hierro, el grupo hemo, lípidos y retinol
que son los respectivos ligandos de algunas de las proteínas como Tf, Hpx, Apo AI y RBP4
respectivamente, sin excluir a la Alb que tiene numerosos ligandos y a A1T1 que presenta una afinidad
moderada por la plasmina y la trombina. El término GO relacionado con la regulación de la calidad
biológica común para las proteínas identificadas pone en evidencia que estas proteínas participan en
diferentes procesos moleculares (mantenimiento de la localización celular y respuestas del sistema
inmune) estrechamente relacionados a nivel sistémico con la homeostasis de iones, moléculas,
fluidos corporales, la respuesta cardiovascular, la angiogénesis y la eritropoyesis, entre otros
procesos que tienen lugar durante la fase aguda y crónica de aclimatación a hipoxia hipobárica.
Tabla 9. Enriquecimiento de términos GO de las proteínas identificadas por MS. Resultados
obtenidos con STRING. Términos GO seleccionados por tasa de falso descubrimiento <0.01. Los
colores representan cada una de las proteínas relacionadas en la red que participan en cada proceso
biológico. Verde claro: Alb, azul: Apo A1, gris: Fgg, Amarillo: A1T1, Naranja: Tf, Rosado: Hpx y verde
oscuro: RBP4.
GO: Proceso Biológico
Término GO Descripción Tasa de falso
descubrimiento
Proteínas relacionadas en la
red
GO:0002576 Degranulación de plaquetas 2.41E-07
GO:0043687 Modificación postraduccional de proteínas 1.99E-05
GO:0016192 Transporte mediado por vesículas 0.00047
GO:0065008 Regulación de la calidad biológica 0.00079
GO:0002700 Regulación de la producción de mediadores de la respuesta inmune 0.00095
GO:0034375 Remodelamiento de lipoproteínas de alta densidad 0.0016
GO:0006810 Transporte 0.0016
GO:0034114 Regulación de la adhesión heterotípica célula-célula. 0.0018
GO:0006896 Endocitosis mediada por receptor 0.0025
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
97
GO:1900026 Regulación positiva de la extensión celular dependiente de la adhesión
0.0028
GO:0051180 Transporte de vitaminas 0.0037
GO:0002639 Regulación positiva de la producción de inmunoglobulinas 0.0043
GO:0043062 Organización de la estructura extracelular 0.0058
GO:0071702 Transporte de sustancias orgánicas 0.0067
GO:0048878 Homeostasis química 0.0067
GO:0006879 Homeostasis celular de hierro 0.0068
GO:0006826 Transporte de hierro 0.0074
GO:0050708 Regulación de la secreción de proteínas 0.0084
GO:0001523 Procesos metabólicos retinoides 0.0095
GO:0090277 Regulación positiva de la secreción de hormonas peptídicas 0.0107
Además del enriquecimiento de los términos GO en STRING, se uso la herramienta Gonet, este
recurso permite visualizar de forma general la relación entre los procesos biologicos y las proteínas
identificadas (Figura 21).
Figura 21. Red de enriquecimiento para las proteínas identificadas usando Gonet. Red obtenida
usando un score de alta confianza (2.73e-5) en Gonet. En naranja se destacan los códigos de Uniprot
de cada una de las proteínas (P02768: Alb, P02790: Hpx, P02679: Fgg, P02753: RBP4, P01009: A1T1,
P02647: Apo AI y P02787: T) y en verde de tono oscuro a claro la reelevancia de cada uno de los
procesos biológicos.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
98
Como se puede evidenciar en ambos casos, el término GO más representativo dentro de la categoria
de proceso biológico es la degranulación de plaquetas (Figuras 20,21). Este proceso es importante
porque permite la liberación de una gran cantidad de mediadores y moleculas de señalización a partir
de la activación de las plaquetas para inducir procesos como la cicatrización, la coagulación y la
angiogénesis. Este último, es un proceso clave durante la reparación de tejidos, y requiere de una
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
99
variedad de factores de crecimiento que actúan de diferente forma para asegurar la restauración y
funcionalidad de los vasos sanguíneos. Por otra parte, la importancia de la degranulación de
plaquetas durante la aclimatación a hipoxia hipobárica se debe a que las plaquetas liberan los
principales reguladores de la angiogénesis como son VEGF, FGF-2 y los factores de crecimiento
derivados de las plaquetas (PDGF), entre otros, que a su vez se unen a proteínas como el fibrinógeno.
Asi mismo, se ha propuesto que la liberación continua de estos factores de crecimiento promueve la
angiogénesis tanto in vitro como in vivo y tiene un efecto en la coagulación.
La participación de las plaquetas como actor principal durante la cicatrización convella al desarrollo
de diferentes fases que involucran la hemostasia, la inflamación, la proliferación y la remodelación.
En el contexto de la hipoxia hipobárica, la activación de vías relacionadas con inflamación y la
detección de moleculas de señalización relacionadas con este proceso han permitido sugerir que la
inflamación sistémica es una caracteristica fisiológica clave de los procesos de aclimatación y
adaptación. A su vez, las fases de activación, proliferación y migración de celulas endoteliales
favorecen la angiogénesis y disminuyen la probabilidad de presentar efectos negativos producto de
la exposición a hipoxia hipobárica debido al potencial de citoquinas, integrinas e interleuquinas
liberadas por plaquetas. Las plaquetas son células sin núcleo que se originan a partir de
megacariocitos en la medula ósea y están compuestas por organelos reservorios que se conocen
como gránulos densos, lisosomas y gránulos alfa. Estos últimos son el mayor reservorio de proteínas
en las plaquetas y son clave para su función, así mismo la liberación de VEGF y otros factores de
crecimiento es esencial en la angiogénesis.
Lo anterior es importante debido a que como se ha reportado previamente, la hipoxia induce la
expresión de mediadores proinflamatorios como PDGH y el factor activador de plaquetas (PAF). Estos
dos últimos tienen una función importante en el remodelamiento vascular y median la activación de
células inducidas por hipoxia y la liberación de citoquinas, por lo cual se ha propuesto que su
liberación puede estar relacionada con la progresión de efectos negativos en la altitud. En un estudio
proteómico, se identificaron proteínas expresadas diferencialmente en plaquetas bajo la condición
de hipoxia, relacionadas con la coagulación, así como también se han identificado en suero y plasma
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
100
sanguíneo, lo cual pone en evidencia la importancia del estudio del proteoma y la complejidad en los
mecanismos de respuesta a la condición de hipoxia.
A la fecha son pocos los estudios que evalúan el impacto de la condición de hipoxia en la función
plaquetaria en humanos, sin embargo, la literatura pone en evidencia la compleja red de interacción
entre la condición de hipoxia, la inflamación, la activación de plaquetas y la coagulación, que a su vez
están relacionados con diferentes procesos como el transporte y la exocitosis. En resumen, respecto
a las proteínas identificadas es importante destacar que la mayoría se clasifica como proteínas de
fase aguda relacionadas con hemostasia, inflamación, transporte y capacidad antioxidante, procesos
que se han relacionado con exposición a hipoxia hipobárica en nativos de gran altitud y en individuos
nativos a nivel del mar en altitud moderada como en este trabajo.
Por otra parte, aunque hay múltiples trabajos relacionados con hipoxia hipobárica en humanos (16),
estos se han centrado principalmente en el estudio de individuos a nivel del mar y en altitud, y en
ninguno de ellos se aporta información acerca de cambios en el proteoma sérico por exposición a
hipoxia hipobárica en el tiempo, también por la dificultad que tiene realizar este tipo de estudios. Por
lo anterior, el abordaje presentado en este trabajo es un primer acercamiento hacia la evaluación del
proteoma sérico durante el proceso de aclimatación a hipoxia hipobárica, y los resultados
corresponden con lo que se ha reportado en la literatura, aunque como se ha evidenciado, cada
individuo presenta una respuesta diferencial ante la condición de hipoxia hipobárica y esta está
relacionada principalmente con el género, lo cual se puede evidenciar en los resultados obtenidos
del componente hematológico principalmente. Por último, es importante resaltar que el diseño
experimental seguido en este trabajo es una aproximación adecuada para detectar diferencias en el
perfil de expresión de proteínas posiblemente relacionadas con el proceso de aclimatación.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
101
8. Conclusiones y recomendaciones
8.1 Conclusiones
1. La determinación de variables hematológicas en este trabajo pone en evidencia la existencia
de mecanismos de respuesta diferencial inter e intraindividuos ante la condición de hipoxia
hipobárica que dependen principalmente del género, por lo cual su utilidad como marcadores
de aclimatación a la altitud moderada es limitado.
2. Los valores en la concentración de hemoglobina y el porcentaje de hematocrito fueron más
elevados para los hombres respecto a las mujeres, y el incremento en las mujeres
participantes en este estudio fue ligero, lo que puede ser indicador de su capacidad para ser
más tolerantes al estímulo hipóxico.
3. La metodología de electroforesis bidimensional y posterior espectrometría de masas
permitió evaluar la expresión de proteínas a lo largo de un periodo de tiempo de 3 meses en
individuos expuestos a hipoxia hipobárica como una aproximación al ajuste fisiológico que
tiene lugar en la altitud.
4. La metodología usada en este trabajo permitió evidenciar que existen proteínas cuya
expresión cambia a lo largo del tiempo bajo la condición de hipoxia hipobárica. Algunas de
estas proteínas fueron identificadas y se encontró que participan en diferentes procesos
biológicos relacionados con la aclimatación entre los que se destacan degranulación de
plaquetas, transporte y procesos de respuesta de fase aguda.
5. Este trabajo es una primera aproximación para la evaluación de cambios en el proteoma
sérico en el tiempo de individuos expuestos a hipoxia hipobárica pertenecientes a la
población andina.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
102
8. 2 Recomendaciones
Estos resultados además de ser exploratorios y contribuir a la comprensión de los mecanismos
implicados en la aclimatación, generan varios interrogantes que pueden ser una guía para futuros
estudios. Con la metodología establecida se propone analizar un mayor número de muestras e
identificar un mayor número de spots para abordar un enfoque exploratorio más amplio, así como
determinar otras variables hematológicas que se complementen con pruebas a nivel molecular para
evaluar diferencias entre mujeres y hombres durante el ajuste fisiológico que tiene lugar en la altitud.
Así mismo, implementar técnicas proteómicas de mayor sensibilidad que aborden un enfoque
cuantitativo como iTRAQ y DIGE.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
103
9. Anexos
A. Formato de consentimiento informado y aval del comité
de ética
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
CONSENTIMIENTO INFORMADO
PROYECTO: “MicroARNs (miRNAs) y péptidos circulantes asociados con adaptación a hipoxia
ambiental en población colombiana”
Claudia Consuelo Rubiano; Edgar Cristancho; Camila González; Andrés García
INTRODUCCIÓN
Por medio del presente documento queremos invitarlo a participar del proyecto de investigación
titulado “MicroARNs y péptidos circulantes asociados con adaptación a hipoxia ambiental en
población colombiana” en el cual se pretende estudiar los cambios en algunos biomarcadores que se
encuentran en la sangre con el proceso de adaptación a la altura, al evaluar individuos de tierras bajas
(≤1800 msnm) que llegan a la ciudad de Bogotá (2600 msnm) y de esta manera poder relacionar
dichos marcadores con las variaciones fisiológicas del proceso adaptativo.
Este estudio fue aprobado por el comité de ética de la facultad de Ciencias de la Universidad Nacional.
Además, se desarrollará según la legislación Colombiana de Buenas Prácticas Clínicas (Resolución
número 002378 de 2008) y la Declaración de Helsinki, en los cuales se regula la confidencialidad de
la identidad de los sujetos, los consentimientos informados, los métodos, aval ético y el bienestar de
los individuos. De acuerdo a lo establecido en la Resolución No. 00843 de 1993 del Ministerio de Salud
este proyecto es de riesgo mínimo para los participantes.
PROCEDIMIENTOS
Para el desarrollo de la investigación es necesario que como participante del estudio se tomen 9
muestras de sangre a lo largo de 4 meses, distribuidas de la siguiente manera: 1. Al primer día de
llegada a Bogotá; 2. a los 3 días; 3. a los 5 días; 4. a las 2 semanas; 5. A las 3 semanas; 6. Al mes; 7 a
los dos meses; 8. A los tres meses; 9 a los cuatro meses.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
104
Este procedimiento se llevará a cabo en las instalaciones de la Universidad Nacional de Colombia,
bajo la dirección de los profesores Claudia Rubiano y Edgar Cristancho. Las muestras serán tomadas
por personal calificado (médico, enfermero(a) o bateriólogo(a)) y autorizado vinculado al proyecto.
Para las muestras se realizará citación previa por medio telefónico, una vez se encuentre en las
instalaciones se darán 5 minutos de reposo y para la toma de datos, posterior a esto se realiza la toma
de la muestra por venopunción a nivel braquial de 10 mL de sangre distribuidos en dos tubos que
serán utilizados para posteriores análisis de microRNAs, péptidos, hematocrito y hemoglobina.
Junto con la muestra de sangre es posible que se realicen otros procedimientos los cuales serán
notificados oportunamente. Estos procedimientos serán de tipo no invasivo y puede incluir la
medición de parámetros ventilatorios y espirométricos como la ventilación por minuto, la frecuencia
respiratoria, frecuencia cardíaca, VO2 y VCO2.
RIESGOS
A pesar de ser considerado un procedimiento de bajo riesgo y que no causa problemas a la mayoría
de los individuos puede provocar problemas inherentes a cualquier procedimiento médico y/o
quirúrgico como sangrado, hematomas, cambios en los signos vitales (Tensión arterial, respiración,
pulso) y desmayos.
BENEFICIOS
Se brindará a los individuos participantes del estudio un resultado con análisis por profesionales de
la salud de los parámetros hematológicos básicos.
CONFIDENCIALIDAD
Toda la información obtenida y los resultados serán tratados confidencialmente, esta información
será almacenada en una base de datos y al finalizar el estudio se le entregará un documento con los
resultados individuales de algunos parámetros medidos para su conocimiento. A menos que usted lo
permita, los resultados no estarán disponibles para terceras personas como empleadores,
organizaciones u otras instituciones o personas naturales o jurídicas.
TRATO DE LA MUESTRA
Las muestras de sangre obtenidas en el presente estudio se utilizarán para lo descrito anteriormente,
sin embargo, puede que queden remanentes de las muestras que podrían ser utilizados para fines
investigativos con otros propósitos. Sin embargo, es necesario su consentimiento y aprobación para
el uso de las muestras sobrantes, por tal razón solicitamos a usted que señale con una X la opción
que según su voluntad considere la mejor:
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
105
-Las muestras sobrantes pueden ser utilizadas con fines investigativos y solicito que se me informe
de los resultados obtenidos. ____
-Las muestras sobrantes pueden ser utilizadas con fines investigativos y no quiero que se me informe
de los resultados obtenidos, ____
-Quiero que las muestras sobrantes sean destruidas y no almacenadas una vez concluido este estudio.
____
DERECHOS Y RESPONSABILIDADES
Los participantes que firmen este documento tienen la responsabilidad de asistir a las citaciones
programadas, sin embargo, también tienen derecho a renunciar y anular este documento en
cualquier momento informando al grupo de investigación la decisión de no seguir participando en el
estudio sin ningún tipo de repercusión legal.
PALABRA FINAL
La persona __________________ explicó la naturaleza de este consentimiento informado, los
procedimientos a realizar y yo _______________________ identificado con CC _____________ me
he familiarizado con el documento, he tenido la oportunidad de hacer preguntas que han sido
respondidas, entiendo y comprendo los contenidos del mismo, por tal razón estoy de acuerdo en
participar en el estudio.
FIRMA
Nombre:
Teléfono:
Documento:
Fecha:
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
106
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
CONSENTIMIENTO INFORMADO
(Versión Padres de familia en caso de menores de edad)
PROYECTO: “MicroARNs (miRNAs) y péptidos circulantes asociados con adaptación a hipoxia
ambiental en población colombiana”
Claudia Consuelo Rubiano; Edgar Cristancho; Camila González; Andrés García
INTRODUCCIÓN
Por medio del presente documento queremos invitar a su hijo/a a participar del proyecto de
investigación titulado “MicroARNs y péptidos circulantes asociados con adaptación a hipoxia
ambiental en población colombiana” en el cual se pretende estudiar los cambios en la cantidad de
algunos biomarcadores que se encuentran en la sangre con el proceso de adaptación a la altura, al
evaluar individuos de tierras bajas (≤1800 msnm) que llegan a la ciudad de Bogotá (2600 msnm) y de
esta manera poder relacionar dichos marcadores con las variaciones fisiológicas del proceso
adaptativo.
Este estudio fue aprobado por el comité de ética de la facultad de Ciencias de la Universidad Nacional
de Colombia. Además, se desarrollará según la legislación Colombiana de Buenas Prácticas Clínicas
(Resolución número 002378 de 2008) y la Declaración de Helsinki, en los cuales se regula la
confidencialidad de la identidad de los sujetos, los consentimientos informados, los métodos, aval
ético y el bienestar de los individuos. De acuerdo a lo establecido en la Resolución No. 00843 de 1993
del Ministerio de Salud este proyecto es de riesgo mínimo para los participantes.
PROCEDIMIENTOS
Para el desarrollo de la investigación es necesario que a su hijo/a como participante del estudio se le
tomen 9 muestras de sangre a lo largo de 4 meses, distribuidas de la siguiente manera: 1. Al primer
día de llegada a Bogotá; 2. a los 3 días; 3. a los 5 días; 4. a las 2 semanas; 5. A las 3 semanas; 6. Al mes;
7 a los dos meses; 8. A los tres meses; 9 a los cuatro meses.
Este procedimiento se llevará a cabo en las instalaciones de la Universidad Nacional de Colombia,
bajo la dirección de los profesores Claudia Rubiano y Edgar Cristancho. Las muestras serán tomadas
por personal calificado (médico, enfermero(a) o bateriólogo(a)) y autorizado vinculado al proyecto.
Para las muestras se realizará citación previa por medio telefónico, una vez se encuentre en las
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
107
instalaciones se darán 5 minutos de reposo y para la toma de datos, posterior a esto se realiza la toma
de la muestra por venopunción a nivel braquial de 10 mL de sangre distribuidos en dos tubos que
serán utilizados para posteriores análisis de microRNAs, péptidos, hematocrito y hemoglobina.
Junto con la muestra de sangre es posible que se realicen otros procedimientos los cuales serán
notificados oportunamente. Estos procedimientos serán de tipo no invasivo y puede incluir la
medición de parámetros ventilatorios y espirométricos como la ventilación por minuto, la frecuencia
respiratoria, frecuencia cardíaca, VO2 y VCO2.
RIESGOS
A pesar de ser considerado un procedimiento de bajo riesgo y que no causa problemas a la mayoría
de los individuos puede provocar problemas inherentes a cualquier procedimiento médico y/o
quirúrgico como sangrado, hematomas, cambios en los signos vitales (Tensión arterial, respiración,
pulso) y desmayos.
BENEFICIOS
Se brindará a los individuos participantes del estudio un resultado con análisis por profesionales de
la salud de los parámetros hematológicos básicos.
CONFIDENCIALIDAD
Toda la información obtenida y los resultados serán tratados confidencialmente, esta información
será almacenada en una base de datos y al finalizar el estudio se le entregará un documento con los
resultados individuales de algunos parámetros medidos para su conocimiento. A menos que usted lo
permita, los resultados no estarán disponibles para terceras personas como empleadores,
organizaciones u otras instituciones o personas naturales o jurídicas.
TRATO DE LA MUESTRA
Las muestras de sangre obtenidas en el presente estudio se utilizarán para lo descrito anteriormente,
sin embargo, puede que queden remanentes de las muestras que podrían ser utilizados para fines
investigativos con otros propósitos. Sin embargo, es necesario su consentimiento y aprobación para
el uso de las muestras sobrantes, por tal razón solicitamos a usted que señale con una X la opción
que según su voluntad considere la mejor:
-Las muestras sobrantes pueden ser utilizadas con fines investigativos y solicito que se me informe
de los resultados obtenidos. ____
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
108
-Las muestras sobrantes pueden ser utilizadas con fines investigativos y no quiero que se me informe
de los resultados obtenidos, ____
-Quiero que las muestras sobrantes sean destruidas y no almacenadas una vez concluido este estudio.
____
DERECHOS Y RESPONSABILIDADES
Los participantes que firmen este documento tienen la responsabilidad de asistir a las citaciones
programadas, sin embargo, también tienen derecho a renunciar y anular este documento en
cualquier momento informando al grupo de investigación la decisión de no seguir participando en el
estudio sin ningún tipo de repercusión legal.
PALABRA FINAL
La persona _______________________ explicó la naturaleza de este consentimiento informado, los
procedimientos a realizar y yo ____________________ identificado con C.C. ______ como
representante legal de __________________________ me he familiarizado con el documento, he
tenido la oportunidad de hacer preguntas que han sido respondidas, entiendo y comprendo los
contenidos del mismo, por tal razón estoy de acuerdo que mi hijo/hija participe del estudio.
FIRMA
Nombre:
Teléfono:
Cédula:
Fecha:
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
109
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
ASENTIMIENTO INFORMADO
PROYECTO: “MicroARNs (miRNAs) y péptidos circulantes asociados con adaptación a hipoxia
ambiental en población colombiana”
Claudia Consuelo Rubiano; Edgar Cristancho; Camila González; Andrés García
INTRODUCCIÓN
Teniendo en cuenta que tanto niños como adolescentes son sujetos activos en ejercicio de sus
derechos y cuya autonomía y razonamiento moral se encuentra en un proceso continuo de
desarrollo; que además según la convención de las Naciones Unidas los menores de edad tienen
derecho de libertad, de conciencia y pensamiento es necesario que el participante directo de la
investigación decida de manera libre y voluntaria la participación en el estudio.
Por medio del presente documento queremos invitarlo a participar del proyecto de investigación
titulado “MicroARNs y péptidos circulantes asociados con adaptación a hipoxia ambiental en
población colombiana” en el cual se pretende estudiar los cambios en la cantidad de algunos
biomarcadores que se encuentran en la sangre con el proceso de adaptación a la altura, al evaluar
individuos de tierras bajas (≤1800 msnm) que llegan a la ciudad de Bogotá (2600 msnm) y de esta
manera poder relacionar dichos marcadores con las variaciones fisiológicas del proceso adaptativo.
Este estudio fue aprobado por el comité de ética de la facultad de Ciencias de la Universidad Nacional
de Colombia. Además, se desarrollará según la legislación Colombiana de Buenas Prácticas Clínicas
(Resolución número 002378 de 2008) y la Declaración de Helsinki, en los cuales se regula la
confidencialidad de la identidad de los sujetos, los consentimientos informados, los métodos, aval
ético y el bienestar de los individuos. De acuerdo a lo establecido en la Resolución No. 00843 de 1993
del Ministerio de Salud este proyecto es de riesgo mínimo para los participantes.
PROCEDIMIENTOS
Para el desarrollo de la investigación es necesario que a usted como participante del estudio se le
tomen 9 muestras de sangre a lo largo de 4 meses, distribuidas de la siguiente manera: 1. Al primer
día de llegada a Bogotá; 2. a los 3 días; 3. a los 5 días; 4. a las 2 semanas; 5. A las 3 semanas; 6. Al mes;
7 a los dos meses; 8. A los tres meses; 9 a los cuatro meses.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
110
Este procedimiento se llevará a cabo en las instalaciones de la Universidad Nacional de Colombia,
bajo la dirección de los profesores Claudia Rubiano y Edgar Cristancho. Las muestras serán tomadas
por personal calificado (médico, enfermero(a) o bacteriólogo (a) y autorizado vinculado al proyecto.
Para las muestras se realizará citación previa por medio telefónico, una vez se encuentre en las
instalaciones se darán 5 minutos de reposo y para la toma de datos, posterior a esto se realiza la toma
de la muestra por venopunción a nivel braquial de 10 mL de sangre distribuidos en dos tubos que
serán utilizados para posteriores análisis de microRNAs, péptidos, hematocrito y hemoglobina.
Junto con la muestra de sangre es posible que se realicen otros procedimientos los cuales serán
notificados oportunamente. Estos procedimientos serán de tipo no invasivo y puede incluir la
medición de parámetros ventilatorios y espirométricos como la ventilación por minuto, la frecuencia
respiratoria, frecuencia cardíaca, VO2 y VCO2.
RIESGOS
A pesar de ser considerado un procedimiento de bajo riesgo y que no causa problemas a la mayoría
de los individuos puede provocar problemas inherentes a cualquier procedimiento médico y/o
quirúrgico como sangrado, cambios en los signos vitales (Tensión arterial, respiración, pulso) y
desmayos.
BENEFICIOS
Se brindará a los individuos participantes del estudio un resultado con análisis por profesionales de
la salud de los parámetros hematológicos básicos.
CONFIDENCIALIDAD
Toda la información obtenida y los resultados serán tratados confidencialmente, esta información
será almacenada en una base de datos y al finalizar el estudio se le entregará un documento con los
resultados individuales de algunos parámetros medidos para su conocimiento. A menos que usted lo
permita, los resultados no estarán disponibles para terceras personas como empleadores,
organizaciones u otras instituciones o personas naturales o jurídicas.
TRATO DE LA MUESTRA
Las muestras de sangre obtenidas en el presente estudio se utilizarán para lo descrito anteriormente,
sin embargo, puede que queden remanentes de las muestras que podrían ser utilizados para fines
investigativos con otros propósitos. Sin embargo, es necesario su consentimiento y aprobación para
el uso de las muestras sobrantes, por tal razón solicitamos a usted que señale con una X la opción
que según su voluntad considere la mejor:
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
111
-Las muestras sobrantes pueden ser utilizadas con fines investigativos y solicito que se me informe
de los resultados obtenidos. ______
-Las muestras sobrantes pueden ser utilizadas con fines investigativos y no quiero que se me informe
de los resultados obtenidos. ____
-Quiero que las muestras sobrantes sean destruidas y no almacenadas una vez concluido este estudio.
______
DERECHOS Y RESPONSABILIDADES
Los participantes que firmen este documento tienen la responsabilidad de asistir a las citaciones
programadas, sin embargo también tienen derecho a renunciar y anular este documento en cualquier
momento informando al grupo de investigación la decisión de no seguir participando en el estudio
sin ningún tipo de repercusión legal.
PALABRA FINAL
La persona ________________________ explicó la naturaleza de este consentimiento informado, los
procedimientos a realizar y yo ___________________ identificado con TI _______________ me he
familiarizado con el documento, he tenido la oportunidad de hacer preguntas que han sido
respondidas, entiendo y comprendo los contenidos del mismo, por tal razón estoy de acuerdo en
participar en el estudio.
Nombre:
Fecha:
Edad:
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
112
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
113
B. Datos para la determinación de variables hematológicas
G P
M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8
Hb Hb 2 Pro Hb Hb 2 Pro Hb Hb 2 Pro Hb Hb 2 Pro Hb Hb 2 Pro Hb Hb 2 Pro Hb Hb 2
Pro Hb Hb 2 Pro
F P2 12,50 12,70
12,60 10,50
10,90 10,70 12,50 12,00
12,25 12,80 13,40
13,10 11,30 11,70
11,50
13,40 13,40
13,40
12,60
11,80
12,20
13,50
13,50
13,50
F P3 13,20 13,20
13,20 12,00
12,10 12,05 16,10 15,60
15,85 13,90 13,40
13,65 14,80 14,70
14,75
14,00 14,20 14,1
15,00
15,00
15,00
15,10
14,80
14,95
M P1 17,20 17,40
17,30 16,30
16,70 16,50 18,60 18,50
18,55 15,00 15,50
15,25 16,20 16,40
16,30
16,40 16,90
16,65
16,60
16,20
16,40
15,30
15,60
15,45
M P4 16,40 16,40
16,40 15,50
15,20 15,35 15,30 15,90 15,6 17,30 17,20
17,25 16,40 16,30
16,35
17,30 16,80
17,05
16,60
16,60
16,60
17,20
17,50
17,35
M P6 14,70 14,90
14,80 16,80
17,10 16,95 17,20 17,90
17,55 16,60 16,80
16,70 18,20 18,10
18,15
16,70 16,60
16,65
16,50
16,60
16,55
16,20
16,70
16,45
M P7 15,00 15,00
15,00 15,90
16,40 16,15 15,20 15,40 15,3 16,20 16,60
16,40 15,30 15,00
15,15
14,00 14,00
14,00
15,20
15,10
15,15
15,60
15,60
15,60
Tabla 9. Concentración de Hb. F: Femenino. M: Masculino. P: Participante. Hb y Hb2: Datos de la concentración de hemoglobina por duplicado
para cada individuo. Pro: Promedio de la concentración de hemoglobina.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
114
G P
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8
Hct Hct 2 Pro Hct Hct 2 Pro Hct Hct
2 Pro Hct Hct 2 Pro Hct Hct 2 Pro Hct
Hct 2
Pro Hct Hct 2 Pro Hct Hct 2 Pro
F P2 -- -- -- 35,0
0 34,0
0 34,50
43,00
43,00
43,00
39,30
39,00
39,10
40,20
41,00
40,60 40,0
0 41,0
0 40,50
38,00
38,50 38,20 41,20 41,2
0 41,2
0
F P3 -- -- -- 43,0
0 44,0
0 43,50
46,40
45,90
46,10
38,70
38,80
38,70
43,00
44,00
43,50 43,0
0 43,0
0 43,00
36,00
36,00 36,00 44,00 44,0
0 44,0
0
M P1 46,3
0 46,2
0 46,2
0 48,0
0 48,0
0 48,00
49,00
49,00
49,00
45,70
44,90
45,30
49,00
49,00
49,00 49,0
0 50,0
0 49,50
54,00
54,00 54,00 47,00 47,0
0 47,0
0
M P4 49,0
0 50,0
0 49,5
0 53,5
0 56,0
0 54,70
44,00
45,00
44,50
49,20
49,20
49,20
48,00
49,00
48,50 52,0
0 52,0
0 52,00
58,00
58,00 58,00 52,00 52,0
0 52,0
0
M P6 62,0
0 62,0
0 62,0
0 47,7
0 47,1
0 47,40
48,50
48,40
48,40
51,00
50,00
50,50
49,20
49,20
49,20 49,0
0 49,0
0 49,00
48,00
49,00 48,50 48,00 48,0
0 48,0
0
M P7 45,0
0 45,0
0 45,0
0 47,8
0 47,1
0 47,40
45,00
46,00
45,50
49,00
49,00
49,00
46,00
46,00
46,00 38,0
0 38,0
0 38,00
46,00
46,00 46,00 47,70 46,7
0 47,2
0
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
115
Tabla. Porcentaje de Hct. G: Género. F: Femenino. M: Masculino. P: Participante. Hct y Hct2: Datos del porcentaje de hematocrito por duplicado
para cada individuo. Pro: Promedio del porcentaje de hematocrito
P P2 P3 P1 P4 P6 P7
MUESTRA Hb Hct CHCM Hb Hct CHCM Hb Hct CHCM Hb Hct CHCM Hb Hct CHCM Hb Hct CHCM
M1 12,84 - - 13,45 - - 17,63 46,25 38,12 16,71 49,50 33,77 15,08 62,00 24,33 15,29 45,00 33,97
M2 10,91 34,50 31,61 12,28 43,50 28,23 16,82 48,00 35,04 15,64 54,75 28,57 17,28 47,40 36,45 16,46 47,45 34,69
M3 12,49 43,00 29,04 16,15 46,15 35,00 18,91 49,00 38,58 15,90 44,50 35,73 17,89 48,45 36,92 15,59 45,50 34,27
M4 13,35 39,15 34,10 13,91 38,75 35,90 15,54 45,30 34,31 17,58 49,20 35,73 17,02 50,50 33,70 16,71 49,00 34,11
M5 11,72 40,60 28,87 15,03 43,50 34,56 16,61 49,00 33,90 16,66 48,50 34,36 18,50 49,20 37,60 15,44 46,00 33,57
M6 13,66 40,50 33,72 14,37 43,00 33,42 16,97 49,50 34,28 17,38 52,00 33,42 16,97 49,00 34,63 14,27 38,00 37,55
M7 12,43 38,25 32,51 15,29 36,00 42,47 16,71 54,00 30,95 16,92 58,00 29,17 16,87 48,50 34,78 15,44 46,00 31,51
M8 13,76 41,20 33,40 15,24 44,00 34,63 15,75 47,00 33,50 17,68 52,00 34,01 16,77 48,00 34,93 15,90 47,20 33,69
Tabla. Determinación de la concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM). P: Participante. Hb: Promedio de la concentración de
hemoglobina. Hct: Promedio de la concentración de hematocrito. P2, P3: Mujeres. P1, P4, P6, P7: Hombres.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
116
C. Promedio de la concentración de hemoglobina y el hematocrito por individuo
Figura. Hematocrito por individuo. En la gráfica se observan los valores del porcentaje de hematocrito para cada uno de los individuos durante
el seguimiento.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
117
Figura. Concentración de hemoglobina por individuo. En la gráfica se observan los valores de la concentración de hemoglobina para cada uno
de los individuos durante el seguimiento.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
118
D. Cuantificación de proteínas totales con BCA
Individuo
Suero sanguíneo Eluido de proteínas no unidas: Suero depletado
Muestra Abs Abs Promedio Concentración
(ug/ul) Concentración final (ug/ul)
Cantidad para la
depleción (ug) 1 Eluido
2 Eluidos (ug)
Abs Abs Promedio Concentración
(ug/ul) Concentración final (ug/ul)
1
1 0,967 1,014 0,991 0,8366 83,664 2484,831 4969,662 0,352 0,365 0,359 0,251 10,051
2 0,887 0,881 0,884 0,7309 73,088 2485,005 4970,010 0,735 0,742 0,739 0,637 25,482
3 0,935 0,910 0,923 0,7691 76,912 2484,245 4968,491 0,742 0,759 0,751 0,649 25,970
4 0,749 0,746 0,748 0,5953 59,533 2482,537 4965,074 0,700 0,711 0,706 0,604 24,142
5 0,991 0,889 0,940 0,7865 78,649 2485,323 4970,645 0,578 0,649 0,614 0,510 20,406
6 0,773 0,784 0,779 0,6261 62,612 2485,685 4971,370 0,814 0,882 0,848 0,748 29,929
7 0,900 0,905 0,903 0,7493 74,926 2485,280 4970,559 0,323 0,326 0,325 0,217 8,670
8 0,958 0,855 0,907 0,7532 75,323 2485,650 4971,301 0,777 0,791 0,784 0,683 27,330
2
1 0,591 0,595 0,593 0,4419 44,191 1988,580 3977,160 1,001 1,006 1,004 0,906 36,244
2 0,684 0,684 0,684 0,5323 53,227 2485,720 4971,440 1,315 1,348 1,332 1,239 49,563
3 0,514 0,495 0,505 0,3540 35,402 1989,603 3979,206 0,377 0,382 0,380 0,273 10,904
4 0,798 0,798 0,798 0,6455 64,548 2485,104 4970,209 0,811 0,825 0,818 0,718 28,711
5 0,896 0,917 0,907 0,7532 75,323 2485,650 4971,301 0,587 0,63 0,609 0,505 20,203
6 0,929 0,927 0,928 0,7746 77,458 2478,649 4957,299 0,398 0,401 0,400 0,293 11,716
7 0,844 0,882 0,863 0,7100 71,003 2485,104 4970,209 0,476 0,486 0,481 0,376 15,025
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
119
8 0,917 1,015 0,966 0,8123 81,231 2485,680 4971,360 0,787 0,804 0,796 0,695 27,797
3
1 0,812 0,852 0,832 0,6792 67,925 2486,038 4972,075 0,730 0,749 0,740 0,638 25,523
2 0,758 0,823 0,791 0,6380 63,803 2488,332 4976,663 0,361 0,340 0,351 0,243 9,726
3 0,610 0,608 0,609 0,4578 45,780 1991,410 3982,820 0,376 0,367 0,372 0,264 10,579
4 0,662 0,573 0,618 0,4662 46,624 1990,829 3981,658 0,379 0,394 0,387 0,280 11,188
5 0,864 0,851 0,858 0,7046 70,457 2487,125 4974,250 0,696 0,692 0,694 0,592 23,675
6 0,785 0,820 0,803 0,6500 64,995 2489,310 4978,620 0,524 0,543 0,534 0,429 17,157
7 0,986 1,022 1,004 0,8500 85,005 2490,645 4981,291 0,359 0,374 0,367 0,259 10,376
8 0,880 0,896 0,888 0,7349 73,486 2483,813 4967,627 0,719 0,734 0,727 0,625 24,995
6
1 0,658 0,658 0,658 0,5065 50,645 2486,693 4973,386 0,432 0,457 0,445 0,339 13,543
2 0,950 0,950 0,950 0,7964 79,643 2484,846 4969,692 0,779 0,817 0,798 0,697 27,898
3 0,606 0,606 0,606 0,4548 45,482 1987,547 3975,094 0,671 0,650 0,661 0,558 22,315
4 0,852 0,852 0,852 0,6991 69,911 2488,818 4977,637 0,359 0,374 0,367 0,259 10,376
5 0,977 0,977 0,977 0,8232 82,324 2486,177 4972,354 0,719 0,734 0,727 0,625 24,995
6 0,597 0,597 0,597 0,4459 44,588 1988,620 3977,239 0,432 0,457 0,445 0,339 13,543
7 0,567 0,567 0,567 0,4161 41,609 1988,898 3977,795 0,427 0,433 0,430 0,324 12,954
8 0,684 0,684 0,684 0,5323 53,227 2485,720 4971,440 0,921 0,924 0,923 0,824 32,954
7
1 0,810 0,810 0,810 0,6574 65,740 2484,965 4969,930 0,531 0,541 0,536 0,431 17,259
2 0,587 0,587 0,587 0,4359 43,595 1989,668 3979,337 0,429 0,415 0,422 0,316 12,629
3 0,745 0,745 0,745 0,5929 59,285 2489,970 4979,940 0,512 0,529 0,521 0,416 16,629
4 0,828 0,828 0,828 0,6753 67,527 2485,005 4970,010 0,716 0,735 0,726 0,624 24,954
5 0,850 0,850 0,850 0,6971 69,712 2481,748 4963,496 0,871 0,785 0,828 0,728 29,117
6 0,726 0,726 0,726 0,5740 57,398 2485,343 4970,685 0,524 0,473 0,499 0,393 15,736
7 0,821 0,821 0,821 0,6683 66,832 2486,157 4972,314 1,051 1,09 1,071 0,974 38,964
8 0,819 0,819 0,819 0,6663 66,634 2485,432 4970,864 0,486 0,509 0,498 0,392 15,695
Tabla. Cuantificación de proteínas totales con BCA. Abs: Absorbancia
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
120
E. Análisis estadístico de los geles 2D con Delta 2D
Tabla. Resultados de los spots detectados en el seguimiento para el individuo 1.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
121
Tabla. Resultados de los spots detectados en el seguimiento para el individuo 2.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
122
F. Imágenes de geles 2D-PAGE Figura. Imágenes de los geles 2D-PAGE correspondientes al seguimiento del individuo 2. Geles obtenidos para el individuo 2 durante el
seguimiento. Rango de gradiente de pH de 5 a 8 y valores de peso molecular en kDa del marcador de peso molecular.
Días 1 3 5 KDa 𝑝𝐻 5 8 5 8 5 8 45 35 25
Días 12 19 26 KDa 𝑝𝐻 5 8 5 8 5 8 45 35 25
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
123
Días 56 86 KDa 𝑝𝐻5 8 5 8
45 35 25
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
124
G. Clusters para cada individuo obtenidos por K-means
Figura. Clusters del individuo 1. De abajo hacia arriba en el primer panel los cluster 1,2,3,4 y 5. De
abajo hacia arriba en el segundo panel los cluster 6,7, 8, 9 y 10.
Figura. Clusters del individuo 2. De abajo hacia arriba en el primer panel los cluster 1,2,3,4 y 5. De
abajo hacia arriba en el segundo panel los cluster 6,7,8, 9 y 10.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
125
H. Gráficas de volcano para los individuos analizados
Figura. Gráficas de volcano correspondiente a cada una de las muestras del seguimiento del
individuo 1. Los números corresponden a los ID de algunos de los spots identificados.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
126
Figura. Gráfica de volcano para correspondientes a cada una de las muestras del seguimiento del
individuo 2. Los números corresponden a los ID de algunos de los spots identificados.
I. Datos para gráficas de volcano
Tablas. Datos de FC y el valor de p calculados para realizar las gráficas de volcano
correspondiente a cada una de las muestras del seguimiento del individuo 1 y 6 respectivamente.
Los números corresponden a los ID de los spots identificados con Delta 2D y las celdas resaltadas
con color a los valores que cumplen con los criterios de (FC≥2,p<0.05).
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
127
Spot ID
Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8
Log FC -log p valor
Log FC -log p valor
Log FC -log p valor
Log FC -log p valor
Log FC -log p valor
Log FC -log p valor
Log FC -log p valor
496 1,370 8,777 0,113 1,551 0,083 5,305 -0,186 2,658 0,326 1,287 0,156 2,495 0,049 -0,397
498 1,291 8,770 0,265 2,108 0,238 2,854 0,299 2,328 0,264 0,828 -0,010 1,192 0,301 -0,076
495 1,014 8,728 -0,695 8,154 -0,428 7,553 -0,572 5,180 -0,429 2,658 -0,793 4,553 -0,175 -0,658
435 0,645 4,764 -0,193 4,366 0,017 2,187 -0,616 3,523 -0,170 3,398 -0,178 4,131 -0,402 -0,616
436 0,556 6,140 0,055 4,939 -0,230 4,527 -0,810 3,699 -0,399 1,199 -0,415 4,198 -0,237 -0,623
442 0,428 3,523 -0,054 2,022 -0,156 3,523 -0,592 4,000 -0,281 1,951 -0,144 4,499 -0,229 -0,653
402 0,373 4,000 -0,151 4,509 -0,035 3,097 -0,514 4,000 -0,446 2,032 0,192 3,155 -0,536 -0,499
429 0,339 8,283 -0,180 4,857 -0,003 0,896 -0,588 4,710 -0,197 2,959 -0,262 3,699 -0,485 -0,568
290 0,329 8,265 0,176 0,673 -0,174 3,000 -0,280 4,458 -0,719 4,000 -1,796 6,706 -0,100 -0,826
356 0,260 4,000 0,061 1,759 0,161 2,699 -0,053 3,046 -0,585 2,921 -0,370 4,483 -0,310 -0,652
416 0,259 8,120 -0,015 2,174 0,096 3,301 -0,147 3,699 -0,253 3,398 -0,155 4,764 -0,408 -0,678
392 0,253 8,106 -0,439 2,921 -0,400 4,553 -0,793 5,194 -0,545 3,155 -0,489 4,097 -0,209 -0,613
389 0,224 8,026 -0,177 2,959 -0,180 3,222 -0,420 4,910 -0,951 4,485 -0,380 5,851 -0,282 -0,767
284 0,138 7,688 0,139 1,298 0,027 3,523 -0,275 2,959 -0,889 5,383 -1,347 4,533 -0,296 -0,656
432 0,118 5,842 -0,072 3,699 0,050 2,658 -0,197 3,699 0,300 3,046 -0,148 3,301 -0,254 -0,519
1165 0,108 7,503 0,205 3,523 0,082 1,848 0,175 5,465 0,375 3,222 0,373 5,160 0,326 -0,713
353 0,090 2,620 -0,020 1,467 0,140 4,127 -0,007 2,194 -0,821 4,180 -0,006 1,186 -0,006 -0,074
348 0,087 3,699 0,010 1,301 -0,234 5,082 -0,415 4,234 -0,305 0,664 -0,174 5,472 -0,253 -0,738
352 0,082 3,398 -0,007 0,757 0,154 4,000 -0,038 2,678 -1,032 4,325 0,050 3,523 0,235 -0,547
544 0,080 7,269 0,041 5,951 0,041 7,133 -0,082 4,000 0,106 1,947 -0,091 3,523 -0,084 -0,547
471 0,068 7,141 -0,055 4,431 0,030 2,319 -0,193 6,119 -0,087 2,071 -0,265 4,550 -0,312 -0,658
423 0,052 5,087 -0,024 1,218 -0,066 3,097 -0,541 7,577 -0,180 1,870 -0,150 4,979 -0,165 -0,697
938 0,043 6,757 0,225 3,301 0,107 1,785 0,643 3,699 0,694 3,699 0,876 3,699 0,676 -0,568
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
128
347 0,041 5,757 -0,123 7,089 0,029 2,886 -0,345 4,506 -0,144 0,398 -0,109 4,719 -0,425 -0,674
343 0,037 3,398 0,103 5,275 -0,208 4,674 -0,359 4,413 -0,327 0,495 -0,169 5,488 -0,144 -0,739
354 0,037 3,222 -0,273 4,764 0,166 4,269 -0,342 3,699 0,142 0,584 -0,008 1,780 -0,458 -0,250
973 0,028 5,264 0,008 1,317 -0,061 3,523 -0,032 1,879 0,060 2,149 0,117 2,569 -0,003 -0,410
984 0,025 6,327 0,061 3,000 0,055 2,638 0,001 1,164 0,223 2,585 0,298 4,000 0,113 -0,602
812 0,019 6,067 0,016 1,648 -0,059 1,810 -0,001 0,070 0,125 4,389 0,249 3,523 0,161 -0,547
472 0,019 6,060 -0,068 2,553 -0,089 4,333 -0,267 5,020 -0,156 3,699 -0,201 3,699 -0,253 -0,568
395 0,010 5,547 -0,130 2,854 -0,249 6,780 -0,487 7,963 -0,412 3,398 -0,349 4,690 -0,223 -0,671
346 0,010 5,011 0,000 0,067 0,018 2,481 -0,138 4,171 -0,754 4,499 -0,075 2,620 -0,184 -0,418
606 -0,017 4,000 -0,298 2,921 -0,161 2,092 -0,433 2,886 -0,710 2,357 -0,374 4,000 -0,334 -0,602
692 -0,020 6,190 -0,062 3,398 -0,053 2,585 -0,069 3,155 0,106 4,000 0,084 6,007 0,061 -0,779
1085 -0,022 5,440 -0,049 2,770 0,031 1,889 -0,015 4,754 0,054 1,983 0,234 3,523 0,008 -0,547
539 -0,027 4,000 -0,093 5,243 -0,045 4,083 -0,215 5,444 -0,097 1,889 -0,119 3,046 -0,184 -0,484
285 -0,027 6,437 0,046 0,077 -0,025 1,672 -0,239 2,301 -1,046 5,407 -1,187 4,274 -0,567 -0,631
421 -0,038 4,799 -0,069 2,187 0,074 2,678 -0,286 3,523 -0,577 3,000 -0,194 4,975 -0,558 -0,697
534 -0,039 3,301 -0,089 4,287 -0,154 5,955 -0,429 5,670 -0,243 4,076 -0,231 4,332 -0,297 -0,637
476 -0,042 6,842 -0,155 4,009 -0,073 5,210 -0,327 4,262 -0,256 2,886 -0,298 4,000 -0,495 -0,602
345 -0,054 7,061 -0,214 4,146 -0,073 4,266 -0,457 4,000 -0,375 3,398 -0,426 4,483 -0,547 -0,652
1486 -0,068 7,269 -0,203 5,767 -0,074 3,301 -0,226 6,101 -0,033 1,623 -0,146 4,000 -0,205 -0,602
385 -0,080 7,428 -0,076 3,398 -0,184 6,321 -0,266 4,740 -0,799 4,733 -0,333 4,247 -0,567 -0,628
552 -0,092 7,559 -0,120 4,000 -0,102 4,000 -0,274 4,400 -0,157 2,060 -0,156 2,959 -0,338 -0,471
390 -0,096 7,604 0,103 4,000 -0,067 3,398 -0,146 4,215 -0,801 4,000 -0,400 5,963 -0,428 -0,775
469 -0,103 4,611 -0,146 3,523 0,057 3,398 -0,213 5,818 -0,259 3,523 -0,194 5,382 -0,194 -0,731
382 -0,111 7,740 -0,087 3,699 -0,060 2,553 -0,437 5,045 -1,018 4,489 -0,330 4,163 -0,426 -0,619
380 -0,111 5,830 -0,082 4,573 -0,085 2,149 -0,342 4,489 -1,013 6,149 -0,344 4,561 -0,362 -0,659
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
129
562 -0,114 7,767 -0,179 3,301 -0,012 1,458 -0,287 4,860 -0,035 0,924 -0,031 1,767 -0,213 -0,247
514 -0,115 7,777 -0,114 2,252 0,082 1,833 -0,074 2,051 -0,025 0,678 0,249 3,301 -0,375 -0,519
467 -0,135 4,406 -0,108 8,775 0,037 3,222 -0,162 4,277 -0,162 2,721 -0,228 5,839 -0,389 -0,766
1016 -0,136 7,947 -0,225 4,000 -0,173 2,770 0,039 2,824 0,183 2,553 0,174 2,699 0,033 -0,431
529 -0,141 2,292 -0,305 3,222 -0,133 2,229 -0,168 2,638 0,058 0,177 0,433 3,523 0,047 -0,547
380 -0,153 8,069 -0,316 4,613 -0,042 3,699 -0,445 4,000 -0,991 5,561 -0,395 6,248 -0,503 -0,796
424 -0,268 3,398 -0,102 3,699 -0,857 5,633 -0,369 4,029 -0,067 2,886 -0,168 5,466 -0,812 -0,738
312 -0,288 8,764 0,050 2,187 -0,547 3,398 -0,561 3,398 -0,721 3,699 -0,842 4,265 -0,804 -0,630
291 -0,292 8,780 -0,056 0,421 -0,237 5,588 -0,347 3,046 -0,652 3,046 -1,032 4,294 -0,726 -0,633
853 -0,307 7,062 -0,207 4,466 0,190 4,854 -0,290 4,460 -0,151 3,523 0,127 5,622 -0,227 -0,750
434 -0,324 8,907 0,022 2,328 0,010 1,450 -0,287 4,587 -0,403 4,000 -0,210 3,301 -0,889 -0,519
463 -0,368 5,049 -0,124 4,020 -0,057 4,228 -0,308 5,094 -0,558 4,917 -0,249 4,642 -0,321 -0,667
517 -0,384 5,833 -0,509 5,367 -1,013 4,788 -0,243 5,256 0,003 0,835 -0,173 3,699 -1,022 -0,568
862 -0,394 9,152 -0,183 3,222 0,344 5,682 -0,116 4,039 -0,126 2,456 0,295 4,124 -0,134 -0,615
518 -0,542 3,523 0,305 2,252 0,327 4,000 0,186 1,456 -0,383 1,971 0,612 3,398 -0,237 -0,531
314 -1,114 6,269 -1,041 4,971 -1,229 5,321 -0,975 6,636 -0,065 0,105 -0,686 4,812 -0,476 -0,682
263 -1,284 11,344 -1,268 4,719 -1,036 4,514 -0,824 6,532 -0,903 3,699 -2,097 5,227 -0,917 -0,718
297 -1,292 6,024 -0,996 4,959 -1,456 6,478 -1,328 5,289 -0,498 0,983 -0,863 4,804 -0,507 -0,682
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
130
Spot ID
Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8
Log FC -log p valor Log FC
-log p valor Log FC
-log p valor Log FC
-log p valor Log FC
-log p valor Log FC
-log p valor Log FC
-log p valor
299 0,267 2,770 -0,277 -0,442 0,050 1,475 0,112 1,979 0,863 4,658 -0,237 1,762 -0,186 1,951
169 0,263 2,745 -0,156 -0,438 0,020 0,398 0,034 0,741 -0,019 0,462 0,468 3,699 -0,023 0,740
1277 0,195 2,523 0,073 -0,402 0,207 3,097 0,234 2,638 0,664 4,742 -0,264 3,097 0,150 1,967
523 0,125 2,046 0,272 -0,311 -0,025 0,443 0,417 2,620 0,976 4,848 -0,019 0,325 0,497 3,699
231 0,115 2,796 0,100 -0,447 0,510 3,301 -0,457 3,699 0,386 2,770 -0,213 1,399 0,074 2,409
246 0,076 2,041 0,106 -0,310 0,261 3,155 -0,350 3,301 0,607 4,009 -0,483 3,155 -0,215 3,097
529 0,076 2,638 -0,012 -0,421 0,026 1,592 -0,025 0,798 -0,243 3,301 0,001 0,083 -0,081 2,538
332 0,066 1,955 0,001 -0,291 -0,081 1,939 0,192 2,745 0,189 2,481 0,490 4,143 0,134 2,658
559 0,055 1,189 0,132 -0,075 0,038 1,039 0,092 1,788 -0,096 2,125 -0,042 1,467 0,054 1,445
310 0,047 1,333 0,073 -0,125 0,031 1,093 0,218 2,444 0,049 1,470 0,200 2,824 -0,063 1,487
307 0,031 0,651 0,128 0,187 -0,060 1,335 0,142 2,076 -0,264 2,398 0,148 2,180 -0,095 1,644
553 0,016 1,536 -0,043 -0,186 -0,029 1,631 -0,095 2,347 -0,538 4,051 -0,045 2,319 -0,235 3,222
277 0,006 0,401 0,138 0,397 0,009 1,130 -0,017 0,453 -0,488 4,495 -0,009 1,190 -0,385 4,614
508 0,001 0,044 0,055 1,358 -0,021 2,009 0,317 3,699 0,615 4,573 -0,003 0,322 0,205 4,141
333 0,000 0,021 0,091 1,682 -0,079 2,229 0,132 2,194 0,133 2,959 0,365 4,027 -0,033 1,478
347 -0,042 4,261 -0,234 -0,630 -0,256 4,000 0,053 1,347 0,448 4,001 0,173 2,469 0,028 1,821
476 -0,048 1,240 0,027 -0,093 0,486 4,502 -0,434 4,099 -0,527 3,699 -1,398 4,780 -0,592 3,523
487 -0,061 1,762 -0,021 -0,246 0,007 0,938 -0,431 4,111 -1,155 4,444 -0,088 3,000 -0,377 4,000
916 -0,078 1,708 0,057 -0,232 -0,551 4,446 -0,141 2,409 -0,182 3,699 0,119 5,325 -0,123 2,678
431 -0,080 1,656 -0,076 -0,219 -0,074 1,979 -0,674 3,301 -0,857 3,523 -0,015 0,665 -0,465 3,222
566 -0,080 2,237 -0,256 -0,350 -0,185 3,155 -0,660 4,000 -0,327 3,301 -0,161 3,046 -0,520 3,523
262 -0,090 2,310 0,101 -0,364 -0,035 1,670 0,038 1,775 -0,184 2,745 0,047 1,996 -0,164 2,959
535 -0,091 1,807 0,002 -0,257 0,003 0,097 0,015 0,608 -0,381 4,115 -0,044 2,538 -0,015 1,305
304 -0,105 2,260 0,001 -0,354 -0,164 3,000 0,136 1,740 -0,214 3,301 0,091 1,618 0,221 2,167
486 -0,126 3,097 -0,092 -0,491 0,001 0,093 -0,597 4,365 -1,180 4,493 -0,130 3,398 -0,788 4,461
276 -0,127 1,801 0,069 -0,256 -0,344 2,569 0,037 0,898 -0,205 1,695 0,098 1,790 -0,247 2,301
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
131
296 -0,141 2,155 -0,090 -0,333 -0,093 1,900 0,005 0,148 -0,257 2,678 0,307 3,301 0,084 1,507
326 -0,148 2,602 -0,097 -0,415 -0,130 3,046 -0,305 3,523 -0,231 3,523 -0,201 3,398 -0,237 3,398
341 -0,182 3,097 0,088 -0,491 -0,260 3,523 0,086 2,420 0,347 4,032 0,228 3,699 -0,010 0,756
1934 -0,186 2,041 -0,005 -0,310 -0,206 2,187 0,165 1,900 -0,197 2,056 0,483 3,699 0,286 2,409
447 -0,199 3,155 0,002 -0,499 0,140 3,097 0,049 1,087 -0,312 3,398 0,143 2,456 -0,184 3,000
337 -0,201 2,481 -0,048 -0,395 -0,340 3,155 0,037 1,633 0,060 1,971 0,145 2,745 -0,261 3,046
401 -0,229 3,222 -0,251 -0,508 0,033 1,223 -0,415 3,222 -0,156 2,886 -0,609 3,523 -0,279 2,721
493 -0,230 2,824 -0,315 -0,451 -0,253 3,097 -0,767 3,699 -0,126 2,215 -0,315 3,155 -0,506 3,523
225 -0,291 3,222 0,138 -0,508 0,050 1,955 0,195 1,833 -0,425 3,523 0,294 2,638 0,117 1,827
609 -0,292 3,097 0,132 -0,491 0,595 4,701 -0,243 2,432 -0,214 2,357 -0,975 4,000 -0,260 2,921
540 -0,425 2,377 -0,762 -0,376 -0,627 3,699 -0,474 2,337 0,501 5,173 -0,524 2,051 -0,164 2,854
236 -0,474 4,156 0,114 -0,619 0,162 2,886 -0,072 1,971 -0,200 4,000 0,015 0,401 0,090 1,672
990 -0,481 3,301 -0,322 -0,519 -0,149 3,097 -0,485 3,699 -0,445 3,699 0,062 2,469 -0,582 3,699
1031 -0,511 3,301 -0,521 -0,519 -0,210 3,155 -0,509 3,523 -0,491 3,699 -0,148 3,000 -0,317 3,523
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
132
10. Bibliografía
1. Iii EFP, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, et al. Mechanisms of disease Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer GLOSSARY. 2002;359:572–7.
2. Kulshreshtha R, Ferracin M, Wojcik SE, Garzon R, Alder H, Agosto-Perez FJ, et al. A MicroRNA Signature of Hypoxia. Mol Cell Biol [Internet]. 2007;27(5):1859–67. Available from: http://mcb.asm.org/cgi/doi/10.1128/MCB.01395-06
3. Brown CJ, Rupert JL. Hypoxia and Environmental Epigenetics. High Alt Med Biol [Internet]. 2014;15(3):323–30. Available from: http://online.liebertpub.com/doi/abs/10.1089/ham.2014.1016
4. Tsai YP, Wu KJ. Epigenetic regulation of hypoxia-responsive gene expression: Focusing on chromatin and DNA modifications. Int J Cancer. 2014;134(2):249–56.
5. Julian CG, Subudhi AW, Hill RC, Wilson MJ, Dimmen AC, Hansen KC, et al. Exploratory proteomic analysis of hypobaric hypoxia and acute mountain sickness in humans. 2014;(top 10):937–44.
6. Sarkar S, Banerjee PK, Selvamurthy W. High altitude hypoxia: An intricate interplay of oxygen responsive macroevents and micromolecules. Mol Cell Biochem. 2003;253(1–2):287–305.
7. Huang Y, Lin D, Taniguchi CM. Hypoxia inducible factor (HIF) in the tumor microenvironment: friend or foe? Sci China Life Sci [Internet]. 2017;2–3. Available from: http://link.springer.com/10.1007/s11427-017-9178-y
8. Yang J, Li W, Liu S, Yuan D, Guo Y, Jia C, et al. Identification of novel serum peptide biomarkers for high-altitude adaptation: a comparative approach. Sci Rep [Internet]. 2016;6:25489. Available from: http://www.nature.com/srep/2016/160506/srep25489/full/srep25489.html
9. Bigham AW. ScienceDirect Genetics of human origin and evolution : high-altitude adaptations. Curr Opin Genet Dev [Internet]. 2016;41:8–13. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.gde.2016.06.018
10. Padhy G, Gangwar A, Sharma M, Himashree G, Singh K, Bhaumik G, et al. Plasma kallikrein-bradykinin pathway promotes circulatory nitric oxide metabolite availability during hypoxia. Nitric Oxide - Biol Chem [Internet]. 2016;55–56:36–44. Available from:
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
133
http://dx.doi.org/10.1016/j.niox.2016.02.009
11. Khurana P, Sugadev R, Jain J, Singh SB. HypoxiaDB: A database of hypoxia-regulated proteins. Database. 2013;2013:1–12.
12. Fábián Z, Taylor CT, Nguyen LK. Understanding complexity in the HIF signaling pathway using systems biology and mathematical modeling. J Mol Med [Internet]. 2016;94(4):377–90. Available from: http://dx.doi.org/10.1007/s00109-016-1383-6
13. Porcelli S, Marzorati M, Healey B, Terraneo L, Vezzoli A, Bella S Della, et al. Lack of acclimatization to chronic hypoxia in humans in the Antarctica. Sci Rep [Internet]. 2017;7(1):18090. Available from: http://www.nature.com/articles/s41598-017-18212-1
14. Smith TG, Robbins PA, Ratcliffe PJ. The human side of hypoxia-inducible factor. Br J Haematol. 2008;141(3):325–34.
15. Tammen H, Schulte I, Hess R, Menzel C, Kellmann M, Mohring T, et al. Peptidomic analysis of human blood specimens : Comparison between plasma specimens and serum by differential peptide display. 2005;3414–22.
16. Ahmad Y, Sharma NK, Garg I, Ahmad MF, Sharma M, Bhargava K. An Insight into the Changes in Human Plasma Proteome on Adaptation to Hypobaric Hypoxia. PLoS One. 2013;8(7).
17. Ahmad Y, Sharma NK, Ahmad MF, Sharma M, Garg I, Bhargava K. Proteomic identification of novel differentiation plasma protein markers in hypobaric hypoxia-induced rat model. PLoS One. 2014;9(5).
18. Kumar GK, Klein JB. Oxygen Sensing in Health and Disease Analysis of expression and posttranslational modification of proteins during hypoxia. 2004;1178–86.
19. Trompetero González AC, Mejía EC, Benavides Pinzón WF, Serrato M, Landinéz MP, Rojas J. Comportamiento de la concentración de hemoglobina, el hematocrito y la saturación de oxígeno en una población universitaria en Colombia a diferentes Alturas. Nutr Hosp. 2015;32(5):2309–18.
20. Windsor JS, Rodway GW. Heights and haematology: The story of haemoglobin at altitude. Postgrad Med J. 2007;83(977):148–51.
21. West JB. Are Permanent Residents of High Altitude Fully Adapted to Their Hypoxic Environment? High Alt Med Biol [Internet]. 2017;18(2):ham.2016.0152. Available from: http://online.liebertpub.com/doi/10.1089/ham.2016.0152%0Ahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28256920
22. Fraga A. Actas urológicas españolas. 2009;33(9):941–51.
23. Semenza GL. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hipoxia.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
134
invited review. 2000;1474–80.
24. Semenza GL. Oxygen-dependent regulation of mitochondrial respiration by hypoxia-inducible factor 1. Biochem J [Internet]. 2007;405(1):1–9. Available from: http://biochemj.org/lookup/doi/10.1042/BJ20070389
25. San T, Polat S, Cingi C, Eskiizmir G, Oghan F, Cakir B. Effects of high altitude on sleep and respiratory system and theirs adaptations. Sci World J. 2013;2013(i).
26. D’Alessandro A, Nemkov T, Sun K, Liu H, Song A, Monte AA, et al. AltitudeOmics: Red Blood Cell Metabolic Adaptation to High Altitude Hypoxia. J Proteome Res. 2016;15(10):3883–95.
27. Gunga H, Kirsch KA, Roecker L, Kohlberg E, Tiedemann J, Steinach M, et al. Erythropoietin regulations in humans under different environmental and experimental conditions. 2007;158:287–97.
28. Haase VH. HIF-prolyl hydroxylases as therapeutic targets in erythropoiesis and iron metabolism. Hemodial Int. 2017;21(Suppl 1):S110–24.
29. Beall CM. Andean, Tibetan, and Ethiopian patterns of adaptation to high-altitude hypoxia. Integr Comp Biol [Internet]. 2006;46(1):18–24. Available from: https://academic.oup.com/icb/article-lookup/doi/10.1093/icb/icj004
30. Cheviron ZA, Brumfield RT. Genomic insights into adaptation to high-altitude environments. Heredity (Edinb) [Internet]. 2012;108(4):354–61. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/hdy.2011.85
31. Azad P, Stobdan T, Zhou D, Hartley I, Akbari A, Bafna V, et al. High-altitude adaptation in humans: from genomics to integrative physiology. J Mol Med. 2017;95(12):1269–82.
32. MacInnis MJ, Koehle MS. Evidence for and Against Genetic Predispositions to Acute and Chronic Altitude Illnesses. High Alt Med Biol [Internet]. 2016;17(4):281–93. Available from: http://online.liebertpub.com/doi/10.1089/ham.2016.0024
33. Bailey DM, Davies B. Physiological implications of altitude training for endurance performance at sea level: a review. Br J Sports Med [Internet]. 1997;31(3):183–90. Available from: http://bjsm.bmj.com/cgi/doi/10.1136/bjsm.31.3.183
34. Wu T, Wang X, Wei C, Cheng H, Wang X, Li Y, et al. Hemoglobin levels in Qinghai-Tibet: different effects of gender for Tibetans vs. Han. J Appl Physiol [Internet]. 2005;98(2):598–604. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15258131
35. Lorenzo FR, Huff C, Olenchock B, Tashi T, Gordeuk V, Wuren T, et al. HHS Public Access. 2015;46(9):951–6.
36. Peng Y, Cui C, He Y, Ouzhuluobu, Zhang H, Yang D, et al. Down-regulation of EPAS1
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
135
transcription and genetic adaptation of tibetans to high-altitude hypoxia. Mol Biol Evol. 2017;34(4):818–30.
37. Luo Y, Wang Y, Lu H, Gao Y. ‘Ome’ on the range: update on high-altitude acclimatization/adaptation and disease. Mol BioSyst [Internet]. 2014;10(11):2748–55. Available from: http://xlink.rsc.org/?DOI=C4MB00119B
38. Ge R, Witkowski S, Zhang Y, Alfrey C, Sivieri M, Karlsen T, et al. Determinants of erythropoietin release in response to short-term hypobaric hypoxia. 2002;75231:2361–7.
39. Askew EW. Work at high altitude and oxidati v e stress : antioxidant nutrients. Toxicology [Internet]. 2002;180(2):107–19. Available from: http://ovidsp.ovid.com/ovidweb.cgi?T=JS&PAGE=reference&D=emed5&NEWS=N&AN=2002392739
40. Lu H, Wang R, Li W, Xie H, Wang C, Hao Y, et al. Cytokine arrays analysis of plasma from acute mountain sickness susceptible and resistant individuals. Int J Clin Exp Med [Internet]. 2016;9(9):18645–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/s41598-018-19818-9
41. Imray C, Booth A, Wright A, Bradwell A. Acute altitude illnesses. BMJ. 2011;343(7820):1–10.
42. Soni S, Padwad YS. HIF-1 in cancer therapy : two decade long story of a transcription factor. 2017;(March).
43. Pescador N, Cuevas Y, Naranjo S, Alcaide M, Villar D, Landázuri MO, et al. Identification of a functional hypoxia-responsive element that regulates the expression of the egl nine homologue 3 ( egln3/phd3 ) gene. Biochem J [Internet]. 2005;390(1):189–97. Available from: http://biochemj.org/lookup/doi/10.1042/BJ20042121
44. Aquino-gálvez A, González-ávila G. El papel del factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1) en la fibrosis pulmonar idiopática. 2011;69(3):170–7.
45. Schönenberger MJ. Hypoxia signaling pathways: modulators of oxygen-related organelles. Front Cell Dev Biol [Internet]. 2015;3(July). Available from: http://journal.frontiersin.org/Article/10.3389/fcell.2015.00042/abstract
46. Solaini G, Baracca A, Lenaz G, Sgarbi G. Hypoxia and mitochondrial oxidative metabolism. Biochim Biophys Acta - Bioenerg [Internet]. 2010;1797(6–7):1171–7. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.bbabio.2010.02.011
47. Federal D. E L F ACTOR I NDUCIDO POR LA H IPOXIA-1 ( HIF-1 ). 2009;1.
48. José G, Laura F, María M. Proteómica clínica y nuevos biomarcadores en los líquidos biológicos. Med Clin (Barc). 2008;131(11):426–34.
49. Chevalier F. Highlights on the capacities of “Gel-based” proteomics. Proteome Sci.
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
136
2010;8:1–23.
50. Hu L, Ye M, Zou H. Recent advances in mass peptidome analysis. 2009;433–47.
51. Araujo RP. The amplified peptidome : the new treasure chest of candidate biomarkers David H Geho , Lance A Liotta , Emanuel F Petricoin , Weidong Zhao and. 2006;50–5.
52. Luque-garcia JL, Neubert TA. Sample preparation for serum / plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. 2007;1153:259–76.
53. Gianazza E, Miller I, Palazzolo L, Parravicini C, Eberini I. With or without you — Proteomics with or without major plasma / serum proteins. J Proteomics [Internet]. 2016;140:62–80. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.jprot.2016.04.002
54. Tirumalai RS, Chan KC, Prieto DA, Issaq HJ, Conrads TP, Veenstra TD. Characterization of the Low Molecular Weight Human Serum Proteome. Mol Cell Proteomics [Internet]. 2003;2(10):1096–103. Available from: http://www.mcponline.org/lookup/doi/10.1074/mcp.M300031-MCP200
55. Adkins JN, Varnum SM, Auberry KJ, Moore RJ, Angell NH, Smith RD, et al. Toward a Human Blood Serum Proteome. Mol Cell Proteomics [Internet]. 2002;1(12):947–55. Available from: http://www.mcponline.org/lookup/doi/10.1074/mcp.M200066-MCP200
56. Anderson NL, Anderson NG. The Human Plasma Proteome. Mol Cell Proteomics [Internet]. 2002;1(11):845–67. Available from: http://www.mcponline.org/lookup/doi/10.1074/mcp.R200007-MCP200
57. Strohkamp S, Gemoll T, Habermann JK. Possibilities and limitations of Two Dimensional Gel Electrophoresis (2-DE ) -based analyses for identifying low-abundant tumor markers in human serum & plasma. 2016;
58. Diseases H, Medicine H. Progress in Mass Spectrometry-Based Proteomics in Hypoxia-Related Diseases and High-Altitude Medicine. 2017;21(6):1–9.
59. Bueno Y, Muñoz G, Torres R. Implementación de técnicas sencillas de remoción de proteínas mayoritarias de plasma Sanguíneo para análisis por electroforesis bidimensional (2D). Rev Colomb Quim. 2011;40(2):131–48.
60. Ahmad Y, Sharma N. An Effective Method for the Analysis of Human Plasma Proteome using Two-dimensional Gel Electrophoresis. 2009;2(12):495–9.
61. Gao Z, Luo G, Ni B. Progress in Mass Spectrometry-Based Proteomics in Hypoxia-Related Diseases and High-Altitude Medicine. Omi A J Integr Biol [Internet]. 2017;21(6):305–13. Available from: http://online.liebertpub.com/doi/10.1089/omi.2016.0187
62. Magdeldin S, Enany S, Yoshida Y, Xu B, Zhang Y, Zureena Z, et al. Basics and recent advances
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
137
of two dimensional- polyacrylamide gel electrophoresis. Clin Proteomics [Internet]. 2014;11(1):16. Available from: http://clinicalproteomicsjournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/1559-0275-11-16
63. Hinkelbein J, Jansen S, Iovino I, Kruse S, Meyer M, Cirillo F, et al. Thirty minutes of hypobaric hypoxia provokes alterations of immune response, haemostasis, and metabolism proteins in human serum. Int J Mol Sci. 2017;18(9).
64. Bartlett M, Bartlett MF, Lehnhard RA. The lactate paradox: A review The lactate paradox : a review. 2015;(March).
65. Padhy G, Sethy NK, Ganju L, Bhargava K. Abundance of Plasma Antioxidant Proteins Confers Tolerance to Acute Hypobaric Hypoxia Exposure. 2013;14(3).
66. Zhao Y, Vanhoutte PM, Leung SWS. Vascular nitric oxide: Beyond eNOS. J Pharmacol Sci [Internet]. 2015; Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.jphs.2015.09.002
67. Sachidhanandam M, Singh SN, Sharma YK, Salhan AK, Ray US. Plasma proANP1-98Response During High Altitude Stress: Effect of Age and Ethnicity. Wilderness Environ Med [Internet]. 2010;21(1):11–6. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.wem.2009.12.021
68. Arjamaa O, Nikinmaa M. Natriuretic peptides in hormonal regulation of hypoxia responses. AJP Regul Integr Comp Physiol [Internet]. 2008;296(2): R257–64. Available from: http://ajpregu.physiology.org/cgi/doi/10.1152/ajpregu.90696.2008
69. Stacey M, Hill N, Alwis N De. Endocrine Aspects of High Altitude Acclimatization and Acute Mountain Sickness. :33–7.
70. Chicco AJ, Le CH, Gnaiger E, Dreyer HC, Muyskens JB, D’Alessandro A, et al. Adaptive remodeling of skeletal muscle energy metabolism in high-altitude hypoxia: Lessons from AltitudeOmics. J Biol Chem [Internet]. 2018;(1):jbc.RA117.000470. Available from: http://www.jbc.org/lookup/doi/10.1074/jbc.RA117.000470
71. De Palma S, Ripamonti M, Viganò A, Moriggi M, Capitanio D, Samaja M, et al. Metabolic modulation induced by chronic hypoxia in rats using a comparative proteomic analysis of skeletal muscle tissue. J Proteome Res. 2007;6(5):1974–84.
72. Chen J, Gao Y, Liao W, Huang J, Gao W. Hypoxia Affects Mitochondrial Protein Expression in Rat Skeletal Muscle. Omi A J Integr Biol [Internet]. 2012;16(3):98–104. Available from: http://online.liebertpub.com/doi/abs/10.1089/omi.2011.0023
73. Pasiakos SM, Berryman CE, Carrigan CT, Young AJ, Carbone JW. Muscle protein turnover and the molecular regulation of muscle mass during hypoxia. Med Sci Sports Exerc. 2017;49(7):1340–50.
74. Viganò A, Ripamonti M, De Palma S, Capitanio D, Vasso M, Wait R, et al. Proteins modulation
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
138
in human skeletal muscle in the early phase of adaptation to hypobaric hypoxia. Proteomics. 2008;8(22):4668–79.
75. Hulmes JD, Bethea D, Ho K, Huang S-P, Ricci DL, Opiteck GJ, et al. An Investigation of Plasma Collection, Stabilization, and Storage Procedures for Proteomic Analysis of Clinical Samples. Clin Proteomics. 2004;1(1):017–32.
76. Rodríguez R. Análisis de perfiles de expresión proteica en plasma de pacientes con cáncer de colon. 2014;1–110. Available from: http://www.bdigital.unal.edu.co/43038/
77. Urrego WA. Implementación de una metodología para la separación de proteomas de plasma humano mediante electroforesis bidimensional Implementation of a methodology to separate human plasma proteomes by two-dimensional electrophoresis Implementação de uma metodologia. 2015;44(3):30–8.
78. Oyelade J, Isewon I, Oladipupo F, Aromolaran O, Uwoghiren E, Ameh F, et al. Clustering Algorithms : Their Application to Gene Expression Data. 2016;237–53.
79. Gassmann M, Soliz J. Erythropoietin modulates the neural control of hypoxic ventilation. Cell Mol Life Sci. 2009;66(22):3575–82.
80. Gonzales FG. Hemoglobin and testosterone: importance on high altitude acclimatization and adaptation. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2011;28(1):92–100.
81. Rasmussen P, Siebenmann C, Díaz V, Lundby C. Red cell volume expansion at altitude: A meta-analysis and Monte Carlo simulation. Med Sci Sports Exerc. 2013;45(9):1767–72.
82. Benavides Pinzón WF. Ubicación altitudinal del umbral hipóxico para la masa total de hemoglobina en poblaciones colombianas. Universidad nacional de Colombia. 2013.
83. Pe O. Diurnal changes of arterial oxygen saturation and erythropoietin concentration in male and female highlanders. 2016; 4:1–7.
84. Schmidt W. Effects of Intermittent Exposure to High Altitude on Blood Volume and Erythropoietic Activity. 2002;3(2).
85. Berth M, Moser FM, Kolbe M, Bernhardt J. The state of the art in the analysis of two-dimensional gel electrophoresis images. 2007;1223–43.
86. Li W. Volcano Plots in Analyzing Differential Expressions with mRNA. :1–30.
87. Isabel S, Rodríguez C. Búsqueda de biomarcadores en plasma de pacientes con leucemia linfoide aguda. Universidad Nacional de Colombia. 2018.
88. Mosesson MW. Fibrinogen and fibrin structure and functions. 2005;1894–904.
89. Ahmad Y, Sharma NK, Ahmad MF, Sharma M. The proteome of Hypobaric Induced Hypoxic
Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos
139
Lung : Insights from Temporal Proteomic Profiling for Biomarker Discovery. Nat Publ Gr [Internet]. 2015;(May):1–20. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/srep10681.
90. Silva B, Faustino P. Biochimica et Biophysica Acta An overview of molecular basis of iron metabolism regulation and the associated pathologies. BBA - Mol Basis Dis [Internet]. 2015;1852(7):1347–59. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.bbadis.2015.03.011
91. Man-man XU, Jun W, Jun-xia XIE. Regulation of iron metabolism by hypoxia-inducible factors. 2017;69(31571054):598–610.
92. Ahmad Y, Shukla D, Garg I, Sharma NK, Saxena S, Malhotra VK, et al. Identification of haptoglobin and apolipoprotein A-I as biomarkers for high altitude pulmonary edema. Funct Integr Genomics. 2011;11(3):407–17.
93. Regulation F, Renin B. Plasma Proteomics of Ladakhi Natives Reveal Functional Regulation Between Renin–Angiotensin System and eNOS–cGMP Pathway. 2016;00(00):1–10.
94. Janciauskiene S, Welte T. Well-Known and Less Well-Known Functions of Alpha-1 Antitrypsin. Its Role in Chronic Obstructive Pulmonary Disease and Other Disease Developments. 2016;13(August).
95. Frenzel E, Wrenger S, Immenschuh S, Koczulla R, Mahadeva R, Deeg HJ, et al. Acute-Phase Protein α 1-Antitrypsin −− A Novel Regulator of Angiopoietin-like Protein 4 Transcription and Secretion. 2019.
96. Niermeyer S, Zamudio. S, Moore L. The People. En High Altitude An Exploration of Human Adaptation. Seattle, Washington, USA: Marcel Dekker. 2001; 43-44.