INSTITUTO NACIONAL DE SALUD PUBLICA

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS DE LA UNAM

Protocolo de Investigación:

EFECTOS ANEUGENICOS IN VITRO DEL ACETATO DE PLOMO EN LINFOCITOS HUMANOS DE SUJETOS CON

DIFERENTES NIVELES DE EXPOSICION CRONICA A PLOMO.

Carlos Roberto Leal Escalante PROGRAMA: MAESTRIA EN CIENCIAS EN SALUD AMBIENTAL

México, D.F., Febrero de 1996.

Con especial agradeciminto para mis maestros por las extraordinarias

sesiones que nos brindaron durante el curso de Genotoxicolgia en la Maestria en Ciencias en Salud Ambiental.

Profesor Titular: Dra. Patricia Ostrosky-Wegman. Jefa del Laboratorio de Genotoxicolgía del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la UNAM. Profesores Adjuntos: Dr. Emilio Rojas. M.C. Libia I. Vega. M.C. Gillermo Elizondo.

I N D I C E: I. Marco Teórico. II. Problema de Investigación. III. Hipótesis. VI. Material y Métodos. VI. Bibliografía.

I. Marco Teórico. Aún cuando los eféctos tóxicos del plomo y sus compuestos han sido estudiados por muchos años, gran cantidad de datos inconsistentes han sido públicados sobre sus propiedades clastogénicas, mutagénicas y carcinogénicas. Los compuestos inorgánicos del plomo han sido clasificados como posibles carcinogénicos para el hombre por la Agencia Internacional para la Investigación del Cancer (IARC,1980). Esta clasificación esta basada en estudios con animales de laboratorio, en los cuales el plomo, administrado por diferentes vias, ha causado principalmente tumores renales en ratas y ratones (IARC,1987). De manera adicional, el acetato de plomo, subacetato de plomo y óxido de plomo han demostrado incrementar el número de tumores inducidos por algunos compuestos orgánicos, incluyendo 2-(etilnitrosamina)etanol (Shirai,et al.,1984) y N-(4'fluoro-4 bifenil)-acetamida (Tanner y Lipsky, 1984). En contraste, la evidencia de carcinogenicidad por plomo en el humano es todavia inadecuada (Schiag,R.D.;1987). Mientras que un estudio reportó no encontrar evidencia de un mayor riesgo de morir por cáncer entre trabajadores de industrias relacionadas con el plomo, con respecto a la población general (Dingwall y Lane,1963), otro parecio mostrar evidencias de incremento en el riesgo de desarrollarlo al encontrar un elevado número de muertes por neoplasias malignas entre los trabajadores de una fundición pero no entre los de una planta de baterias (Cooper y Gaffey,1975); pero que al ser reevaluados por la IARC, dictaminó que los resultados de este último no eran significativos (IARC,1987). Muchos trabajos se han hecho para determinar la clastogenicidad de los compuestos de plomo, a través de investigar aberraciones cromosómicas en limfocítos de trabajadores expuestos a plomo. De cualquier manera los resultados siguen siendo contradictorios, lo que puede deberse en parte a diferencias en las condiciones de cultivo (Gebhart y Leonard,1991). Todavía más, no está claro aún si los compuestos inorgánicos del plomo tienen efectos clastogénicos por si mismos o aumentan las aberraciones cromosómicas inducidas, por compuestos que se forman simultaneamente o incrementan su concentración durante el cultivo de las células (Deknut y Leonard,1975; Nordenson y Beckman,1982; Forni,et al.,1980). La evidencia en relación a los potenciales efectos Genotóxicos directos del plomo en células de mamiferos sigue siendo debil y principalmente restringida a dosis tóxicas. Estudios en células de Hamsters Chinos V79, han mostrado qué tanto los compuestos solubles como insolubles de plomo al parecer tienen escasa actividad mutagénica en el locus hprt despues de 5 dias de incubación; adicionalmente, un aumento en el número de transformaciones celulares en células embrionarias de Hamster Syrian fué reportado después de tratarlas con acetato de plomo (Zelikoff,et al.,1988).

Este débil potencial mutagénico ha sido confirmado recientemente por otro reporte, donde el acetato de plomo fué mutagénico a dosis tóxicas en el locus gpt de E. Coli transferido a células V79 (Roy,N.K. y Rossmann.,1992). En otros estudios in vitro, ni el sulfuro de plomo (Zelikoff,et al.,1988) o el acetato de plomo (Zelikoff,et al.,1988; Hartwig,et al,1990), indujeron un número significativo de intercambios de cromátidas hermanas en células V79. Y tampoco ningun rompimiento de cadenas de DNA o enlaces cruzados DNA-proteínas fué detectado con disolventes alcalinos (Zelikoff,et al.,1988) o sedimentación nucleoide (Hartwig,et al,1990). Contrario a lo anterior, a dosis tóxicas tanto el acetato de plomo como el nitrato de plomo indujeron rompimientos en el DNA determinados por traslocación de posición (Roy,N.K. y Rossmann.,1992). No obstante lo anterior, cada vez hay más estudios que reportan evidencias sobre la pronunciada actividad comutagénica del plomo, cuando éste está en combinación con otros agentes capaces de dañar al DNA. En células V79 de hamsters chinos, el acetato de plomo parece aumentar las mutaciones producidas por UV en el locus hprt, así como el intercambio de cromátidas hermanas (Hartwig,et al,1990). La comutagenicidad hacia la luz UV fué recientemente confirmada en células G12; adicionalmente, se ha reportado un aumento en las mutaciones inducida por N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (MNNG) en presencia de plomo (Roy,N.K. y Rossmann.,1992).

II. Problema de Investigación

La aneuploídia es una condición resultante de la no diyunción de cromosomas homólogos durante la meiosis, en la cual, uno o más cromosomas faltan o son agregados al número normal de cromosomas somáticos. Si faltan dos cromosomas homólogos de un par, el resultado es nulisomia. La monosomía, trisomía y tetrasomía son condiciones genéticas en las que el sujeto tiene uno, tres, y cuatro cromosomas homólogos respectivamente, en lugar de los dos normales. Por arriba del número normal(2), es decir trisomía, tetrasomía etc. estas condiciones se conocen por polisomías (McKusick,1964;DuPraw,1971;Hook,1985). Esta distribución anormal del material genético entre las células hijas está asociado con eventos reproductivos (35% de los abortos expontáneos), y también se ha asociado con procesos de transformación maligna a nivel celular (Hassold,1985; Conti et al.,1986; Oshimura and Barrett,1986). Con diferentes sistemas de prueba se ha demostrado en el laboratorio que algunas sustancias químicas son capaces de inducir arresto mitótico y aneuplidía, a través de interferir en la polimeración de tubulina, al enlazarse éstas sustancias con radicales sulfihidrilos de moléculas proteicas (Hsu and Satya-Prakash,1985; Liang and Brinkley,1985).

Algunos de estos agentes tienen gran importancia por ser contaminantes ampliamente dispersos en el ambiente, como es el caso de herbicidas, fungicidas y solventes orgánicos (Liang and Brinkley, 1985). También se demostrado la suceptibilidad especial de algunos sujetos para ser blanco de este tipo de sustancias (Libia, Vega. et al,1995) De ahi la importancia de estudiar aquellos agentes que, por exposición ambiental, sean capaces de inducir aneuploídia en seres humanos. A. Forni y cols.(1980) colectaron linfocitos de 18 controles y 12 mujeres expuestos ocupacionalmente a plomo y los cultivaron 48 y 72 hrs. El experimento consistió en exponer in vitro a los linfocitos a acetáto de plomo (en dif. conc.). Dichos autores reportaron en su estudio una diferencia significativa en el número de cromátides y aberraciones cromosómicas en los linfocitos de las mujeres trabajadoras a las 72 hrs, en comparacion con los controles cultivados por el mismo lapso de tiempo. Lo que se propone nuestro estudio es investigar si exiten diferencias significativas, in vitro, entre los linfocitos de sujetos con diferentes niveles de exposición crónica a plomo (niveles extremos altos y bajos), sobre todo de origen ambiental, en términos de la capacidad del acetato de plomo para inducir en ellos aneuploídía, aberraciones cromosomicas y arresto mitótico. Han pasado 16 años desde los trabajos de Forni, y la controversia continua. De confirmarse la hipótesis del estudio, nos gustaria estar en condiciones de correr posteriormente otros experimentos (con los mismos sujetos), los cuales estarian orientados a establecer: 1) si entre ellos existe polimorfismo de la -Amino-Levulinato-Dehidratasa (particular al plomo), 2) estudiar posibles diferencias en los patrones de actividad de los diferentes mecanismos de reparación de DNA de esta población, y por último 3) hacer estudios in vitro, para establecer si hay diferencias en la capacidad mutagénica del acetato de plomo en los espermatozooides de sujetos con diferentes niveles de exposición crónica a plomo.

III. Hipótesis. En presencia de acetáto de plomo, los linfocítos activos in vitro de sujetos

con niveles más altos de exposición crónica a plomo, presentan una diferencia significativa en el número de intercambios de cromátidas hermanas, aberraciones cromosomicas y arresto mitótico, con respecto de los linfocitos provenientes de sujetos que tienen niveles más bajos de exposición crónica.

VI. Material y Metodos. Se seleccionarán, al azar, 10 sujetos (5 casos y 5 controles sanos) entre

aquellos con niveles altos y 10 (5 casos y 5 controles sanos) con niveles bajos. La selección se hará a partir de los sujetos (del estudio de casos y controles sobre exposición crónica a plomo e infertilidad masculina anéxo a este) que sean detectados con los niveles más extremos de exposición crónica a plomo, por niveles de plomo en hueso estimado a través de Fluoroscopia de R-X.

Se conducirán dos tipos de experimentos: un protocolo de experimento

estará orientado a investigar, in vitro, si el acetáto de plomo induce de forma diferencial aneuploidia y/o células poliploides, en linfocítos proliferantes activos de sujetos con diferentes niveles de exposición crónica a plomo. Y el otro estará diseñado para evaluar la indución de arresto mitótico y aberraciones cromosómicas en el mismo tipo de células, en presencia de acetato de plomo, cuando los donadores tienen diferentes niveles de exposición crónica a plomo.

Experiménto 1. (Efectos aneugénicos): Se tomarán muestras de sangre periférica de los participantes 10 sujetos (5

casos y 5 controles sanos) con niveles altos y 10 (5 casos y 5 controles sanos) con niveles bajos. Los donadores no deberán tomar ninguna droga o medicamento, por al menos una semana antes de que les sea tomada su muestra de sangre. Cultivos por duplicado para linfocitos se iniciarán como sigue: 0.5 ml. de sangre en 6 ml. de medio de cultivo RPMI, suplementado con 1% de L-glutamina y aminoacidos no esenciales (Gibco), 32 μM de bromodeoxyuridina (Sigma) y 0.2 ml. de fitohemaglutinina (PHA)(Gibco). Los cultivos serán incubados por 48 y 72 hrs (Forni,1980). a 37oC con exposición a acetato de plomo en las últimas 24 hrs. previas a la recolección de los linfocitos. Las dosis probadas estarán en el rango de 10-10 a 5 μM. Medios de cultivo y calcemida 10-2 μM. serán usados como controles negativos y positivos respectivamente.

Recolección de células y Cuantificación: 2 horas antes de recolectar a los linfocítos, se añadirán 0.2 ml. de calcemida

(Gibco) a los cultivos e incubarán por espacio de 2hrs a 37oC. Las células se centrifugarán 10 min. a 300 X g. En seguida, se procederá a remover el sobrenadante, para después colocar las células en una solución hipotónica: KCL 0.1 M (Dauford, 1984) a 37oC por 10 minutos. A continuación se fijarán las células, para después lavarlas con una solución enfriada de metanol-ácido acético 3:1. Las laminillas de microscopio serán en su caso preparadas para conteo de aneuploidía, primero, dejando caer suavemente las células sobre las laminillas (por goteo), en seguida secándolas por aire (a temperatura ambiente), para después teñirlas por el metódo de Perry y Wolff (1974).

Se analizarán 200 metafases en primera y segunda división, para determinar la frecuencia de células heteroploides, clasificándolas como hypoploides (cuando estén presentes menos de 46 cromosómas) e hyperploides (Cuando estén presentes aproximadamente 92 cromosómas).

Experiménto 2. (Arresto Mitótico y aberraciones cromosómicas): A fín de investigar posibles diferencias en la inducción de arresto mitótico

(efecto citoestático) por exposición in vitro de linfocitos a acetato de plomo. Se tomará una muestra de sangre periférica proveniente de donadores con diferentes niveles de exposición crónica a plomo (alta o baja). Se cultivarán linfocitos de sangre total (mismos sujetos participantes que en el experimento 1) y expondrán a diferentes concentraciones de acetáto de plomo (mismas concentraciones que en el experimento 1) en las 2 últimas hrs. del cultivo. Medios de cultivo y calcemida 10-2 μM. serán usados como controles negativos y positivos respectivamente.

Recolección de células y Cuantificación: A las 48 y 72 hrs de cultivo se colectarán las células (linfocitos), para

después centrifugarlas 10 min. a 300 X g. En seguida, se removerá el sobrenadante, para después colocar las células en una solución hipotónica: KCL 0.075 M a 37oC por 30 minutos. A continuación se fijarán las células, para lavarlas en seguida con una solución de metanol-ácido acético 3:1. Las laminillas serán entonces preparadas y teñidas tal y como está descrito en varios estudios (Gonsebatt et al,1992b).

Las proporciones de células con arresto mitótico serán determinadas por un

recuento en base al indice mitótico (MI), dado como el número de metafases en, al menos, 5000 células mononucleares, usando la siguiente formula:

MI = número de metafases / número total de núcleos contados. Los datos que se obtengan por tratamiento con colcemida serán tomados

como el 100% de metafases acumaladas, para cada individuo, los cuales se compararán con los datos que se obtengan de células tratadas con acetáto de plomo y los controles negativos.

Aberraciones cromosómicas estructurales. La posible inducción de aberraciones cromosómicas estructurales como

consecuencia de la exposición de los linfocitos al acetáto de plomo será investigada a diferentes concentraciones, a partir de 10-2 μM hasta dosis tóxicas, analizando las 100 primeras metafases con 46 centrómeros, para cada individuo. Los tipos de aberraciones a cuantificar serán:

a) Rompimientos definidos como una discontinuidad en la cadena del

DNA, más grande que el grosor de la cromátide ó como desplazamiento de una pieza.

b) Rearreglos, que abarcan ambos tipos de cromátide, figuras

caracterizadas por un arreglo anormal de los brazos de una o varias cromátides, en las que se forman configuraciones multiradiales y arreglos intercromosomales en forma de anillos y dicéntricos.

c) Multifragmentaciones, cuando se observan más de 10 rompimientos

en una células. d) Pulverizaciones, que comprenden células en las que todos los

cromosomas están fragmentados.

Análisis Estadístico. Se aplicará a los datos obtenidos una prueba de heterogeneidad de Chi2,

para comparar la respuesta de todos los individuos en los tres parámetros cuantificados en este estudio: células heteroploides, arresto mitótico (efecto citostático), y aberraciones cromosómicas estructurales. Las proporciones de heteroploídía y arresto mitótico serán comparadas usando una t de Student, ambas a P<0.05 . Se practicará un análisis de ANOVA de tres vías, para comparar individuos considerando todos los parámetros juntos, a una P<0.05. Lo anterior con el propósito de verificar si los individuos mantienen el mismo comportamiento a través de, todos los parámetros, para todas las concentraciones empleadas en el estudio con excepción del control positivo (colcemida 10-2 μM).

VI. Bibliografia. Cooper,W.C.; Gaffey,W.R. Mortality of lead workers. 1975. J. Occup. Med.

17:100-107. Conti, C., C. Aldaz, J. O'connell, A. Klein-Szanto and T. Slaga. Aneuploidy, an

early event in mouse skin tumor development. 1986. Carcinogenesis, 7, 1845-1848.

Dauford,N. Measurments of levels of aneuploidy in mammalian cells using a

modified hypotonic treatment. 1984. Mutation Res., 139,127-132. Deknudt,G.; Leonard,A. Cytogenetic investigations on leukocytes of workers

from a cadmium plant. 1975. Environ. Physiol. Biochem. 5:319-327. Dingwall-Fordyce,I.; Lane,R.E. A follow-up study of lead workers. 1963. Br. J.

Ind. Med. 20:313-315. DuPRAW,J. Ernest. Biologia Celular y Molecular. 1971. Ediciones

Omega,S.A. Barcelona. pp 638-655. Forni,A.; Sciame,A.; Bertazzi,B.A.; Alessio,L. Chromosome and Biochemical

studies in women occupationally exposed to lead. 1980. Arch. Environ. Health. 35:139-146.

Gebhart,E.; Rossman,T.G. Mutagenicity, carcinogenicity and teratogenicity.

In: Metals and their Compounds in the Enviroment. 1991. Merian,Ed. (editor), VCH.;617-640.

Gonsebatt,M.E., L. Vega, L.A. Herrera, R. Montero, E. Rojas, M.E. Cebrian and P. Ostrosky-Wegman. Inorganic Arsenic effects on human lymphocite stimulation and proliferation. 1992b. Mutation Res., 283, 91-95.

Hartwig,A.; Schlepegrell,R.; Beyersmann,D. Indirect mechanism of lead-

induced genotoxicity in cultured mammalians cells. 1990. Mutat. Res. 241:75-82.

Hassold, T. The origin of aneuploidy in humans, in V.L. Dellarco, P. VoyteK

and A. Hollander (Eds.), Aneuploidy. 1985. Plenum Press, New York, pp. 103-115.

Hook, E. Maternal age, paternal age and human chromosome abnormality:

nature, magnitude, etiology and mechanisms of effects, in: V.L. Dellarco, P. VoyteK and A. Hollander (Eds.), Aneuploidy. 1985. Plenum Press, New York, pp. 491-506.

Hsu and Satya-Prakash. Aneuploidy induced and mitotic arrestans in animal

cell systems posible mechanisms, in: V.L. Dellarco, P. VoyteK and A. Hollander (Eds.), Aneuploidy. 1985. Plenum Press, New York, pp. 279-304.

IARC. Some metals and metalics compounds In: IARC Monographs on

Evaluation of Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans. 1980. Vol 23; Lyon:International Agency for Research on Cancer; 1-210.

IARC. Overall evaluations of carcinogenicity: An updating of IARC vols. 1-42.

In: IARC Monographs on Evaluation of Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans. 1987. Supplement 7. Lyon:International Agency for Research on Cancer; 230-232.

Liang, J. and B. Brinkley. Chemicals probes and possible targets for the

induction of aneuploidy, in: V.L. Dellarco, P. VoyteK and A. Hollander (Eds.), Aneuploidy. 1985. Plenum Press, New York, pp. 491-506.

Libia Vega, María E. Gonsebatt, Patricia Ostrosky-Wegman. Aneugenic effect

of sodium arsenite on human lymphocytes in vitro: an individual suceptibility effect detected. 1995. Mutation Research 334:365-373.

McKusick, A. Victor. Human Genetics. 1964. Prentice-Hall, Inc. Englewood

Cliffs, New Jersey. pp. 12-23. Nordenson,I; Beckman,L. Occupational and Enviromental risks and around a

smelter in northern Sweden. 1982. VII Hereditas 96:175-181.

Oshimura, M. and C. Barret. Chemically induced aneuploidy in mammalian cells: mechamisms and biological significance in cancer. 1986. Environ. Mutagen., 8, 129-159.

Perry,P. and S. Wolff. New Giemsa Method for diferential staining of sister

chromatids. 1986. Nature, 26,156. Roy,N.K.; Rossman,T.G. Mutagenesis and comutagenesis by lead

compounds. 1992. Mutat. Res. 298:97-103. Schiag,R.D. LEAD In:Genotoxic and Carcinogenic Metals: Enviromental and

Occupational Ocurrence and Exposure. 1987. Advances in Modern Enviromental Toxicology VOLUME XI. Princenton Scientific Publishing Co.,Inc. New Jersey.

Shirai,T; Ohshima,M.; Masuda,A.; Tomano,S. and Ito,N. Promotion of

2(ethylnitrosamine)ethanol induced renal carcinogenesis in the rat by nephrotoxic compounds. Positive results with folic acid. 1987. J. Natl. Cancer Inst.72:477-480.

Tanner,D.C.; Lipsky,M.M. Effect of lead acetate on N-(4-fluoro-

4=biphenyl)acetamide-induced renal carcinogenesis in the rat. 1984. Carcinogesis. 5:1109-1113

Zelikoff,J.T.; Li,J.H.; Hartwig,A.; Wang,A.W.; Costa,M.; Rossman,T.G. Genetic

Toxicology of lead compounds. 1988. Carcinogenics. 9:1727-1732.