Extracción de DNA Genómico (adaptado de Sambrook y Rusell, 2001)

Obtener pellet de cultivo microbiano en medio líquido ó sólido. Si es cultivo líquido pipetear 1.5mL en un tubo eppendorf y centrifugar 5min a 10000rpm.

Eliminar el sobrenadante evitando perturbar el pellet del fondo del tubo.

Congelar con hielo seco/acetona y descongelar a 37ºC (3 veces).

Adicionar 100µL de lisozima (40mg/mL lisozima, 40mM Tris·Cl – pH: 8), 20µL de TE (100mM Tris·Cl – pH: 8, EDTA 10mM), 24µL de Tritón 10% y 56µL de agua estéril, mezclar en vortex completamente y golpear en una superficie rígida para desprender el pellet.

Incubar a 65ºC por 30 minutos. Mezclar por inversión cada 10 minutos.

Adicionar 367µL de TE, 30µL de SDS al 10% y 3µL de proteinasa K (20mg/mL proteinasa K, 50mM Tris – pH: 8, 1.5mM de acetato de calcio), mezclar completamente empleando vortex e incubar 2 horas a 37°C. Mezclar por inversión cada 10 minutos.

Adicionar 6µL de RNAsa, mezclar por inversión e incubar 30 minutos a 37°C (cambiar punta entre cada tubo).

Adicionar 100µL de NaCl 5M y mezclar completamente en vortex.

Adicionar 80µL de CTAB/NaCl (10% CTAB, 0.7M NaCl) y mezclar completamente usando vortex e incubar 10 minutos a 65°C.

Adicionar 700µL de cloroformo/alcohol isoamílico mezclar completamente en vortex y centrifugar 5 minutos a 10000rpm.

Transferir el sobrenadante a un nuevo (DNA se encuentra disuelto en este fase) procurando no perturbar la interfase blanca.

Adicionar 700µL de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico mezclar completamente usando vortex y centrifugar 5 minutos a 10000rpm. Transferir el sobrenadante a un nuevo (DNA se encuentra disuelto en este fase) procurando no perturbar la interfase blanca (repetir 2 veces).

Adicionar 420µL de isopropanol para precipitar el DNA (Si existe gran cantidad de DNA, será posible visualizarlo a simple vista), mezclar por inversión.

Centrifugar 5 minutos a 14000rpm para obtener un pellet de DNA.

Eliminar todo el alcohol, empleando micropipeta de 100µL evitando succionar el pellet de DNA.

Adicionar 10µL de Acetato de Sodio (3M, pH 5.2) y mezclar completamente usando vortex ó por inversión.

Adicionar 250µL de Etanol 100% mantenido a -20°C. Mezclar en vortex y color el tubo en hielo seco por lo menos 5 minutos descongelar.

Centrifugar 5 minutos a 14000rpm y cuidadosamente eliminar todo el alcohol.

Adicionar 1mL de Etanol al 70%, mezclar por inversión y centrifugar 5 minutos a 14000rpm.

Cuidadosamente eliminar el Etanol y dejar evaporar completamente.

Adicionar 50µL de TE.

Almacenar a -20°C.

Electroforesis de DNA

Preparar un gel con 20mL de agua destilada adicionando 400µL de TAE 50X (Concentración final 1X); así como:

mg de Agarosa % en solución Tipo de DNA

100 0.5 DNA genómico

200 1 16S

400 2 rpoB

Calentar por un minuto empleando microondas (o el tiempo necesario para disolver bien la agarosa) y dejar enfriar a 55°C aproximadamente (esperar 5 min), vaciar el gel en la cámara de electroforesis y esperar a que gelifique.

Llenar la cámara de electroforesis con TAE 1X.

Los peines de 8 pozos tiene capacidad de 10µL y los de 15 de 5µL.

Adicionar 1µL de buffer de carga a cada muestra (1X), mezclar con 2µL de muestra y completar volumen con TAE 1X.

Correr los geles a 100V por 30min.

Teñir con solución de Bromuro de Etidio (0.5µg/mL) por 5 min y desteñir por 3min con agua.

Observar empleando luz UV (Transiluminador UV). Preparar buffer TAE 1X:

TAE 50X Aforo

5mL 250mL

10mL 500mL

20mL 1000mL

Preparar buffer de carga (azul) de acuerdo a las proporciones siguientes:

Reactivo Cantidad

10X Ficoll 400 (20%) 2g

EDTA de Sodio 0.1M, pH: 8 2mL (0.5M)

SDS (1%) 100mg

Azul de Bromofenol (0.25%) 25mg

Xilencialnol (0.25%) 25mg

Agua Aforar a 10ml

Preparar Bromuro de Etidio como sigue: Tomar 10µL de solución de Bromuro de Etidio (10mg/mL) y adicionar 190µL de agua 0.5 mg/mL Tomar 100µL de solución de Bromuro de Etidio (0.5mg/mL) y adicionar 100mL de agua 0.5 µg/mL

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Los oligonucleótidos (primers) se deben hidratar en una proporción 1/100.

Diluir los oligonucleótidos (primers) 1/10 para emplearlos en la PCR.

Master Mix 12.5µL

Primer 1 1µL

Primer 2 1µL

DNA 3µL (puede variar)

H2O 7.5µL (puede variar)

25µL

Las condiciones de reacción para el gen rDNA16S son:

Etapa Temperatura (°C) Tiempo (minutos) Ciclos

Desnaturalización inicial 95 15

Desnaturalización 94 1

35 Alineamiento 57 1

Extensión 72 1

Extensión final 72 10

4

Primers: 27F 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 1492R 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’

Las condiciones de reacción para el gen rpoB son:

Etapa Temperatura

(°C) Tiempo

(minutos) Ciclos Temperatura

(°C) Tiempo

(minutos) Ciclos

Desnaturalización inicial 94 3

Desnaturalización 94 1

10

94 1

25 Alineamiento 40 1.5 50 1.5

Extensión 72 2 72 2

Extensión final 72 10

4

Primers: rpoB 1698f 5’-AACATCGGTTTGATCAAC-3’ rpoB B2041r 5’-CGTTGCATGTTGGTACCCAT-3’ rpoB B2041rR 5’-CGCCCCCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCGTTGCATGTTGGTACCCAT-3’

Purificación de productos de PCR (protocolo de Qiagen)

Recortar la banda deseada de gel a purificar (aproximadamente 200mg en peso, para un banda de pozo doble a partir de un peine de 8 pozos).

Adicionar 600µL de buffer QG.

Incubar a 50°C por 10min, mezclar cada 2 ó 3 min.

Verificar que el color de la solución sea amarillo.

Adicionar 1 volumen de isopropanol / 1 volumen de gel, adicionar 200µL.

Transferir el líquido a la columna de QIAquick en dos partes.

Centrifugar por 1min a 14000rpm.

Adicionar 500µL de buffer QG y centrifugar 1min a 14000rpm.

Adicionar 750µL de buffer PE, dejar reposar 5min.

Centrifugar 1min a 14000rpm.

Centrifugar 1min a 14000rpm.

Colocar la columna en un tubo nuevo de 1.5mL.

Adicionar 40µL de buffer EB y dejar reposar 2 min.

Centrifugar 1min a 14000rpm.

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Reactivo 0% 40% 80% 100%

TAE 50X (1X) 2mL 2mL 2mL 2mL

Poliacrilamida 40% (37.5:1) 20mL 20mL 20mL 20mL

Formamida 0mL 16mL 32mL 40mL (40% v/v)

Urea 0g 16.8g 33.6g 42g (7M)

Glicerol 2mL 2mL 2mL 2mL

Agua 76mL ~40mL ~20mL

100mL 100mL 100mL 100mL

Poliacrilamida 40% (37.5:1): Pesar 38.96g de acrilamida y 1.04g de bis-acrilamida y aforar a 100mL. TAE 50X (1L): Tris 242g 40mM EDTA 18.612g 1mM Ácido acético 57.1mL 60mL 20mM pH: 8.3 APS 1%: Pesar 100mg de APS y disolver en 900µl de agua.

Para gelificar el gel adicionar 65µL de APS y 6.5µL de TEMED por cada 10mL de solución, para gelificar en 10min aproximadamente.

Los geles de la cámara Ettan Dalt Six tiene capacidad de 80mL aproximadamente.

Almacenar soluciones en refrigeración.

Reusar buffer TAE 1X fasta cuatro veces.

Elaboró

Dr. Cesar Garcia Diaz del departamento de Biotecnología e Ingeniería Química del Instituto

Tecnológico de Estudios Superiores de Monterrey Campus Estado de México (ITESM – CEM)

cgarciad@itesm.mx

Bibliografía

Sambrook J.F. and Russell D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Vols

1, 2 and 3. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. ISBN: 0879695773

Información personal de la Ing. Bioquímico y especialista en Biología Molecular y Expresión de

Proteínas Recombinantes:

M. en C. Claudia Ivonne Flores Pucheta, del departamento de Biotecnología y

Bioingeniería del Cinvestav (Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del

Instituto Politécnico Nacional, México) cflores@cinvestav.mx