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OBTENCIÓN DE NISINA A PARTIR DE SUERO DE QUESERÍA

MEDIANTE LACTOCOCCUS

INTEGRANTES

BARRENO MAYRA QUILLUPANGUI CRISTINA

GEOVANNA SALAZAR VIZCAINO KARINA

BIOTECNOLOGIA

2009

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INDICE

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................................... 3

CONTAMINACIÓN AMBIENTAL POR LACTOSUERO ......................................................... 3

PROCESOS CONVENCIONALES ................................................................................................... 3

PROCESOS NO CONVENCIONALES ............................................................................................ 3

ANTECDENTES…………………………………………………………………………....................4

IMPORTANCIA Y JUSTIFICACION ....................................................................................... 4

OBJETIVOS ........................................................................................................................... 5

OBJETIVO GENERAL. .................................................................................................. 5

OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................... 5

HIPOTESIS ............................................................................................................................. 6

HIPOTESIS NULA: ........................................................................................................ 6

HIPOTESIS ALTERNA .................................................................................................. 6

ALCANCE .............................................................................................................................. 6

MARCO TEORICO ................................................................................................................. 6

CINETICA DE CRECIMIENTO DE LACTOCOCCUS .................................................. 7

PRODUCCION DE NISINA .......................................................................................... 8

MARCO METODOLOGICO .................................................................................................... 9

MUESTREO ................................................................................................................... 9

TECNICA DE AISLAMIENTO PARA

LACTOCOCCUS…………………………………………………………………….9

REVIVIFICACIÓN .......................................................................................................................... 9

AISLAMIENTO .............................................................................................................................. 9

SELECCIÓN ................................................................................................................................. 9

ADAPTACIÓN ............................................................................................................................. 10

PRESERVACIÓN ........................................................................................................................ 10

FACTIBILIDAD ......................................................................................................................11

BIBLIOGRAFIA .....................................................................................................................12

CRONOGRAMA ....................................................................................................................13

3

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Contaminación ambiental por lactosuero:

La industria láctea en el mundo genera 420 millones de leche en toneladas por año de las

cuales 145 mil millones de ton/año corresponden a suero lácteo.

La alta capacidad contaminante del suero de leche por su contenido en proteínas y lactosa

(materia orgánica) permite la reproducción de microorganismos produciendo cambios en el

DBO que varía entre 30,000 a 50,000 mg/l, además de la cantidad de ácido láctico presente

va alterar los procesos biológicos que se llevan a cabo en las plantas de tratamiento

aumentando los costos.

Según estudios realizados en la FAO han demostrado que en una fábrica de queso que

procesa 280.000 litros de leche cruda por día, por ejemplo, produce alrededor de 250.000

litros de suero líquido y puede contaminar tanta agua como una ciudad de 50.000

habitantes.

En el Ecuador existen 30 empresas industrializadas, se conoce que ALPINA es una de las

empresas que ha implementado un sistema de tratamiento de aguas desde el año 2005 y

las 250 empresas artesanales de las cuales se desconoce algún tratamiento de los residuos

lácteos. En nuestras industrias se produce 444.195 ton/año de lactosuero que es

descargado al drenaje y llega a ríos y suelos, causando un problema serio de contaminación

alterando sus propiedades fisicoquímicas ya que por cada 1,000 litros de lactosuero genera

aproximadamente 35 kg de demanda biológica de oxígeno (DBO) y 68 kg de demanda

química de oxígeno (DQO). En el caso de los suelos, disminuye el rendimiento de las

cosechas, pero además se observa el fenómeno de lixiviación. Este se presenta porque el

lactosuero contiene nitrógeno, convirtiéndose en un peligro para la salud de los animales y

humanos.

Para el tratamiento de suero lácteo, preferentemente se aplican tratamientos biológicos,

para ello se plantean procesos convencionales y no convencionales:

1. Los procesos convencionales depuran aguas residuales y no el suero en sí.

2. Los procesos no convencionales su objetivo es utilizar el residuo industrial para

obtener diversos productos de fermentación, utilizando levaduras y bacterias lácticas

en el lactosuero que puede ser utilizado como medio de cultivo para la producción de

biomasa, metabolitos (lípidos, alcoholes, ácidos orgánicos, etc.), y enzimas. En este

medio la lactosa es la principal fuente de carbono para los microorganismos.

4

ANTECEDENTES Se describieron por primera vez bacteriocinas como las colicinas producidas por Escherichia

coli (Gratia, 1925), Rogers (1928) identificó una sustancia de naturaleza peptídica (nisina),

producida por Lactococcus lactis subsp. lactis que inhibía a microorganismos Gram

positivos, incluyendo patógenos y alterantes de alimentos.

Se piensa que el 99% de las bacterias pueden producir cuando menos una bacteriocina y la

unica razón de que no se hayan aislado es debido a que han sido muy poco estudiadas

(Gordon y O’Brien, 2006).

De Vuyst y Vandame (1994) citan diferentes generos de microorganismos productores de

bacteriocinas dentro de los más empledos, Lactococcus lactis subsp lactis, Pediococcus

acidilactici, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Carnobacterium divergens

Lactobacillus helveticus, en función de sus características bioquímicas y modo de acción.

La nisina es la única bacteriocina autorizada como aditivo alimentario especialmente por su

actividad frente a los clostridios, reconocida por la FDA.

En países desarrollados como Estados Unidos, México, China se está prestando especial

interés el aprovechamiento de este residuo, en el Ecuador no se conoce datos de

aprovechamiento de suero por lo cual se toma como referencia Alpina-Ecuador que realiza

tratamientos de sus líquidos residuales para minimizar la carga orgánica, indicando que un

kilo gramo de leche puede obtener 100 gramos de queso y el 90% restante corresponde a

suero, contaminando, 2000 veces más que el agua residual doméstica, haciéndola más

difícil y costosa para tratar, de esta manera se aprovecha una cantidad de 33.600 toneladas

evitando tratar más de 1.507 toneladas de DQO, generando alimentos de valor agregado

como lactosa en polvo.

IMPORTANCIA Y JUSTIFICACION

El propósito de este proyecto es aprovechar el lactosuero ya que contiene la mayor parte de

los compuestos hidrosolubles, el 95% de lactosa, el 25% de las proteínas y el 8% de la

materia grasa de la leche, siendo un alimento de enorme desperdicio de nutrimentos.

Un aprovechamiento de este desperdicio lácteo se consigue mediante la utilización de

bacterias ácido-lácticas que son de importancia en la industria de alimentos, siendo

utilizadas para la obtención de ácido láctico, saborizantes, espesantes y bacteriocinas,

este grupo de microorganismos son empleados en la industria de alimentos para la

conservación y mejora tecnológica de los productos lácteos, cárnicos y vegetales

fermentados. Los conservantes artificiales presentan problemas para la salud humana, ya

5

que pueden formar toxinas butílicas, por lo que la utilización de nisina como conservante

natural es otra importante opción para su obtención.

Las bacteriocinas de las bacterias Lac, únicamente la nisina y la pediocina han encontrado

aplicaciones comerciales en la industria alimentaria. La Bacteria lactica que produce este

antibiotico es el lactococcus,

El impacto de este proyecto se enfoca en el aspecto ambiental y educativo; por la

reutilización previa de lactosuero cuyo destino final era el desfogue en drenajes y

posteriormente a ríos, alternativas de aprovechamiento y elaboración de aditivos

alimentarios que aporten con la conservación y alarguen el tiempo de vida útil de los

alimentos y promover a la investigación.

Los beneficiarios directos de este estudio serán las instituciones interesadas a brindar

servicios de remediación ambiental y/o industrias lácteas interesadas en obtener nuevos

recursos, los beneficiarios indirectos son los pobladores que mejorarían su calidad de vida y

se lograría proteger a la biodiversidad.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL.

Obtener microorganismos lácteos (LACTOCOCCUS) a partir del lactosuero para la

producción de nisina mediante un sistema de bioproceso.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Aislar y seleccionar microorganismos lactococcus a partir de una muestra de

lactosuero.

2. Adaptar un proceso con un sustrato fermentable (lactosa) para el desarrollo de

lactococcus.

3. Preservar el microorganismo lactococcus mediante crioviales con glicerol al 20%.

4. Propagar el crecimiento de lacctococus para producir biomasa y el metabolito nisina

5. Comprobar el efecto bacteriocina de la nisina en alimentos contaminados con

microorganismos patógenos y alterantes del genero gram positivos.

6

HIPOTESIS

HIPOTESIS NULA: No se obtuvo microorganismos (lactococcus ) a partir de lactosuero para la producción nisina.

HIPOTESIS ALTERNA:

Se obtuvo microorganismos (lactococcus ) a partir de lactosuero para la producción de

nisina.

ALCANCE

Este proyecto abarca la obtención de microorganismos lactococcus a partir del aislamiento,

selección, adaptación, preservación y propagación para producir bacteriocina (nisina).

MARCO TEORICO

BACTERIA FUENTE

DE ENERGIA

FUENTE DE

CARBONO CATEGORIA

GRUPO ACEPTOR DE ELECTRONES

METABOLISMO

LA

CT

OC

OC

CU

S

Reacciones de

Oxido-Reducción a partir de compuest

os orgánicos.

Compuestos

Orgánicos: Lactosa

QU

IMIO

RG

AN

OT

RO

FO

S

La lactosa del suero de queso sirve como donador y aceptor de electrones. Se da un proceso de FERMENTACION en que la Oxidación es parcial de los átomos de carbono presentes en la lactosa.

FERMENTACION catabolismo anaeróbico. Homofermentativas. Auxotrofo Son anaerobios aerotolerantes ya que carecen de catalasa, poseen peroxidasas y superóxido dismutasas que destruyen el H

2O

2 y el O

2-

que se forman en condiciones de aerobiosis. Produce un grupo de antibióticos polipeptídicos llamados nisinas.

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1,00E+02 3,20E+031,02E+05 3,28E+061,05E+08

3,35E+09

-5,00E+08

0,00E+00

5,00E+08

1,00E+09

1,50E+09

2,00E+09

2,50E+09

3,00E+09

3,50E+09

4,00E+09

0 5 10 15 20 25 30

CINETICA DE CRECIMIENTO DE LACTOCOCCUS

CINETICA DE CRECIMIENTO DE LACTOCOCCUS

Gráfico.1

BACTERIOCINA ESPECTRO DE ACCION

FORMACION DE LA NISINA

(A PARTIR DEL METABOLISMO DEL

LACTOCOCCUS)

NISINA

Es muy eficaz como conservador frente a bacterias Gram-positivas. No es eficaz con las bacterias Gram-negativas. Es capaz de impedir el desarrollo de clostridios y bacilos, destruyendo la pared de la espora. La sensibilidad a la nisina varía de unas bacterias a otras. La dosis mínima de eficacia no es siempre la misma.

En la síntesis de la nisina participan un grupo de genes ordenados como nisABTCIP, nisRK, y nisFEG que regulan la expresión del gen estructural nisA. El precursor inactivo NisA es modificado químicamente por los productos de nisB y nisC que deshidratan a los residuos de treonina y serina y originan la formación de los enlaces tioeter característicos de los antibióticos. Una vez modificado el precursor, este es transportado, procesado y secretado; para proteger a la célula productora, existen las proteínas NisL y NisFEG que le confieren inmunidad.

8

PRODUCCION DE NISINA

Gráfico.2

En la grafica.1 muestra una tendencia de crecimiento exponencial del lactococcus teniendo

como referencia una tasa de crecimiento de (µmax =0.523h-1) y un tiempo generacional de

(tg =1h) cuyo tiempo transcurrido es cada 5 horas, partiendo de una concentración inicial

de1x102ufc/ml.

El Lactococcus es un microorganismo auxotrofo capaz de fermentar la lactosa y producir

altas cantidades de acido láctico, ya que contienen un complejo proteolítico que les permite

hidrolizar la caseína, este exige un suministro exógeno de aminoácidos para su crecimiento,

siendo incapaz de efectuar su síntesis a partir de una fuente nitrogenada mineral simple. Es

capaz de producir algunas substancias antibacterianas entre las cuales destacan la nisina.

En la gráfica 2 existe una comparación entre el medio M17 y lactosuero donde sigue la

misma tendencia en ambos medios. Sin embargo, el pH disminuyó hasta alcanzar valores

de 4.2 en el cultivo crecido en suero de quesos mientras que en M17 se estabilizó en 5.5.

La producción de nisina en ambos medios aumenta progresivamente a lo largo del

crecimiento del lactococcus. No obstante, en los dos medios existe una disminución de los

niveles de actividad una vez que las células alcanzan la fase estacionaria, formando el

metabolito secundario (nisina).

9

MARCO METODOLOGICO

MUESTREO

El experimento se realizara en laboratorio de microbiología de la Facultad de ciencias

químicas con muestras de suero lácteo obtenidas de la fábrica de quesos La Andina en

Machachi Ecuador.

Las muestras de suero lácteo serán escogidas totalmente al azar y serán empacadas en

bolsas herméticas selladas y guardadas en una cooler, con hielo para mantener la muestra

fresca, una vez en el Laboratorio se mantendrán en refrigeración hasta los análisis. El

tiempo trascurrido entre toma de muestra y análisis es de un día

TECNICA DE AISLAMIENTO PARA LACTOCOCCCUS.

Revivificación:

Se toman 10ml de suero lácteo con 90 ml de caldo M17se debe incubar en condiciones de

anaerobiosis a 37ºC por 72horas en una estufa, para adaptar a los microorganismos que se

encuentran dañados o debilitados.

Aislamiento:

Realizar diluciones decimales desde 10-1 hasta 10-4 .Tomar el tubo de la dilución menos

concentrada y sembrar por estriado en superficie con el medio selectivo y diferencial M17

agar por duplicado, las cajas se incubaran a 37ºC por 48 horas, manteniendo las

condiciones de anaerobiosis.

Realizar una resiembra con el mismo medio selectivo y diferencial M17 agar por duplicado

para obtener cepas puras.

Para comprobar la pureza del cultivo, las colonias deben aislarse nuevamente en un medio

no selectivo como agar nutritivo a una temperatura de 37ºC por un día con el método de

estrías, ya que en el medio selectivo M17 puede ocurrir que una colonia característica del

microorganismo que estamos buscando pueda contener como contaminantes en muy bajo

número otros microorganismos que no hayan crecido en este medio por estar inhibidos, pero

al subcultivarlos en condiciones favorables puedan crecer.

Selección:

Se debe tomar las colonias que muestran distinta morfología en función tamaño, forma,

borde, elevación, transparencia, color y velocidad de crecimiento.

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Adaptación: A los lactococcus seleccionados se procede a pasar a suero de quesería pasteurizado

suplementado con caseína hidrolizada obteniéndose mejores resultados de producción de

nisina a una concentración de 15g por litro y a un pH menor de 5 después de 24 horas de

fermentación según el Centro de Estudios y de Investigación en Biotecnología (CIBIOT)

Colombia.

La determinación de la biomasa se realizó por peso seco:

1. Tarar cajas (105ºC) y enfriar en desecador

2. Inocular cepas en medio liquido

3. Previo a incubación retirar 5 ml para obtener blanco

4. Prepara inoculo concentración 1x102cel/ml sembrar 24h

5. Retirar 5ml del inoculo inicial y filtrar, para obtener peso seco.

6. Incubar a temperatura a 30ºC en anaerobiosis cada cepa

7. Por cada cierto tiempo retirar 5ml de suspensión y filtrar

8. Colocar el filtro en cajas y colocar en una estufa 105ºC

9. Retirar la caja, enfriar y pesar.

La actividad de la nisina se evaluó por difusión de agar:

Un método comúnmente utilizado para estudiar la acción antimicrobiana es el

método de difusión en agar.

1. Preparar una placa que contenga un medio con agar

2. Inocular de forma uniforme con el organismo control (listeria monocytogenes)

3. A continuación se colocan discos de papel filtro impregnado con concentraciones

conocidas de los diferentes antibióticos.

4. El antibiótico difundirá desde el papel filtro al agar en forma radial.

5. Se incuba la placa por 18/24 horas a 37ºC (respetar este parametro, porque

temperaturas menores pueden disminuir la velocidad del crecimiento del germen

y la difusion del antibiotico dando halos irregulares.)

Preservación:

Las cepas de Lactococcus aisladas se transfieren a caldo BHI con glicerol (40% v/v) y se

congelaron a -80 ºC hasta su posterior análisis.

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FACTIBILIDAD

TECNICA MEDIOS Y

REACTIVOS DISPONIBILIDAD

CANTIDAD DE

REFERENCIA

CANTIDAD NECESARIA

PRECIO

ml g ml g $/500g $

necesaria

LACTOCOCCUS LACTIS

M 17 BROTH CALDO si

950 48,25 110 11.38 68 1,55

Suero de Quesería con

caseína hidrolizada

si 1000 15 10 0,15 35 0,01

GLICEROL si 500 100 0.9 0,18 85 3,06

BHI si 1000 40 3 0,2 45 0,02

M 17AGAR si 950 48,25 80 4,06 68 0,55

AGAR NUTRITIVO si

1000 50 40 2 55 0,22

MUELLER-HINTON si

1000 38 250 9,5 40 0,76

CAJAS PETRI si ― ― ― ― ― 3,19

Antibiograma si ― ― ― ― ― 5

TOTAL 14,36

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BIBLIOGRAFIA:

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GARCÍA GARIVAY, QUINTERO RAMÍREZ Y LÓPEZ MUNGIA. Biotecnología Alimentaria. Editorial Limusa. Pag: 316-317.

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Cortada, Arelys; Rodríguez, Oxalis. Principales métodos de conservación de leches fermentada. Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 2, 2008. , Cuba: Instituto de Investigaciones para la Industria Alimenticia, 2009. p 4. http://site.ebrary.com/lib/bgeneralucesp/Doc?id=10287356&ppg=4. Copyright © 2009. Instituto de Investigaciones para la Industria Alimenticia. All rights reserved.

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http://www.universia.com.ar/contenidos/investigacion/unl/TECNOLOGIA/cs_alimentacion/648.htm

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ACTIVIDADES

2

No

viem

bre

200

9

28

No

viem

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29 N

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11 D

icie

mb

re 2

009

12 D

icie

mb

re 2

009

Recolección y Revisión de Documentos

1 MES

Muestreo X

Preparación de medios X

Inoculación y Revivificación

X

Preparación medios de aislamiento

X

Aislamiento X

Preparación medio para resiembra

X X

Resiembra X

Selección X

Criopreservación X

Imprevistos X X X

CRONOGRAMA

14