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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO
FACULTAD DE INGENIERÍA PESQUERA Y DE ALIMENTOS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE UNA
BEBIDA A BASE DE TÉ VERDE ( Camellia sinensis) Y CAMU
CAMU (Myrciaria durbia) ENDULZADO PARCIALMENTE CON
STEVIA (Stevia rebaudiana)
Proyecto de Tesis para optar el Título de Ingeniero de Alimentos
Por: Bach. Katherine Andrea Martínez Grados Bach. César Gustavo Fuente-Rivera Vernazza
Callao, Noviembre de 2012
PERU
1
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE UNA
BEBIDA A BASE DE TÉ VERDE ( Camellia sinensis) Y CAMU
CAMU (Myrciaria durbia) ENDULZADO PARCIALMENTE CON
STEVIA (Stevia rebaudiana)
2
El presente trabajo de tesis titulado: “EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD
ANTIOXIDANTE DE UNA BEBIDA A BASE DE TÉ VERDE (Camellia sinensis) Y
CAMU CAMU (Myrciaria durbia) ENDULZADO PARCIALMENTE CON STEVIA (Stevia
rebaudiana)” será realizado por el Bach. Katherine Andrea Martínez Grados y el Bach.
César Gustavo Fuentes-Rivera Vernazza, bajo la supervisión del asesor Ing. Ana
Rosario Mercado del Pino y del Co-asesor Ing. Erick George Alvarez Yanamango.
____________________________ ______________________________
Katherine Andrea Martínez Grados César Gustavo Fu entes-Rivera Vernazza
TESISTA TESISTA
____________________________ _______________________________
Ing. Ana Rosario Mercado del Pino Ing. Erick Ge orge Alvarez Yanamango
ASESOR CO-ASESOR
3
CAPITULO I
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
1.1 DESCRIPCIÓN Y ANÁLISIS DEL TEMA
El Té verde es la segunda bebida más consumida en el mundo sólo después del
agua. Durante siglos, el té verde ha sido muy apreciado en países asiáticos como
China y Japón, siendo consumida tanto como bebida social como medicinal. El
consumo de esta bebida se debe principalmente a sus propiedades estimulantes y
por los beneficios que genera al organismo por su acción antioxidante. Los
estudios científicos modernos han confirmado dichos beneficios del consumo
regular del té verde sobre la salud (López, 2002).
Uno de los frutos amazónicos que ha alcanzado notoriedad es el Camu-camu.
Este fruto nativo de la amazonia peruana tiene componentes activos que lo
convierte en un poderoso antioxidante. Dicha propiedad antioxidante se debe al
elevado contenido de vitamina C (hasta 3133 mg/100 g). En la actualidad, el
camu-camu cuenta con un enorme potencial económico debido a sus campos de
aplicación de esta vitamina, que se han ampliado con la investigación médica,
cubriendo temas no solo preventivos de la salud, sino también relacionados con el
tratamiento de ciertas enfermedades, en la industria alimentaria y de cosméticos.
El consumo del camu-camu es limitado en algunas personas debido a su alta
acidez, sin embargo, tiene una excelente aceptación en jaleas, jugos, helados,
licores y vinos (Zavala, 2010). Por lo cual, se le puede considerar parte en la
formulación de bebidas nutracéuticas.
La sacarosa comúnmente llamado azúcar, es un edulcorante extraído de la caña
de azúcar, que ha sido utilizado por años en la elaboración de néctares y bebidas.
Sin embargo, estudios recientes confirman que el alto consumo de azúcar es el
4
principal culpable de la mayoría de las enfermedades crónicas que azotan nuestra
sociedad: Diabetes, hipertensión, arterioesclerosis, Obesidad, entre otros. Una de
las alternativas que se viene estudiando, es el uso de edulcorantes naturales o
artificiales como sustituto de la sacarosa. Uno de los edulcorantes naturales que
ha tomado importancia es la Stevia.
La Stevia rebaudiana, es una planta considerada medicinal, pues varios estudios
demuestran que puede tener efectos beneficiosos sobre la diabetes, ya que posee
glicósidos con propiedades edulcorantes sin calorías.
En la actualidad, en Japón el 41% de los endulzantes consumidos provienen de
Stevia rebaudiana Bertoni. El edulcorante obtenido de esta planta, presenta
efectos beneficiosos en la absorción de la grasa y regulación de la presión arterial,
y es utilizado como reemplazante del azúcar para personas que sufren de
diabetes, ya que no incrementa los niveles de azúcar en la sangre; por el
contrario, estudios han demostrado su propiedad hipoglucémica, mejorando la
tolerancia a la glucosa (Landázuri y Tigrero, 2009).
Por lo anterior expuesto, el presente trabajo de investigación pretende elaborar
una bebida hipocalórica a base de Té verde y Camu-camu, usando como sustituto
parcial de la sacarosa al edulcorante natural Stevia.
1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ¿Será posible determinar la proporción adecuada de Té verde, zumo de Camu-
camu y Stevia que permita obtener una bebida con alta capacidad antioxidante y
bajo contenido calórico?
5
CAPITULO II
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN
2.1 OBJETIVOS
2.1.1 General
Evaluar la capacidad antioxidante de una bebida a base de Té verde y Camu-
camu endulzado parcialmente con Stevia.
2.1.2 Específicos
� Establecer las operaciones unitarias involucradas en la elaboración de la
bebida.
� Determinar la proporción adecuada de Té verde y Camu camu en la
formulación.
� Determinar el porcentaje adecuado de sustitución de sacarosa por
edulcorante natural (Stevia en polvo).
� Inferir el mejor tratamiento mediante la evaluación sensorial de las bebidas
formuladas en consumidores potenciales.
� Determinar mediante espectrofotometría, el contenido fenólico y la capacidad
antioxidante presente en el mejor tratamiento de la bebida formulada.
� Caracterizar fisicoquímica y microbiológicamente el producto final.
6
CAPITULO III
JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN El presente estudio busca formular y elaborar una bebida a base de Té verde,
camu-camu y Stevia, que permita aprovechar los principios activos de las
materias primas para la obtención de una bebida con alta capacidad antioxidante
y un bajo nivel calórico.
El uso de materias primas de nuestra amazonia, como el camu-camu, permitiría
lograr nuevas aplicaciones del fruto, dándole un mayor valor agregado e
incrementando la demanda del fruto, favoreciendo con mayores ingresos a los
agricultores y comunidades productoras de nuestra amazonia.
Los resultados de la investigación nos servirán como base científica para
confirmar las propiedades antioxidantes declaradas por las diferentes marcas
comerciales, que tienen en la actualidad una elevada aceptación en los
consumidores locales.
7
CAPITULO IV
MARCO TEORICO
4.1 ANTECEDENTES
ACEVEDO B, et al. 2004. Estudiaron la cinética de degradación de la Actividad
Antioxidante por tratamiento térmico a 70, 80 y 90ºC en jugos de naranja (Citrus
sinensis), mandarina (Citrus reticulata), limón (Citrus limon), pomelo (Citrus
paradisi) y lima Rangpur (Citrus limonia Osbeck). La Actividad Antioxidante fue
medida usando el test del DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo). LA caracterización
inicial de la capacidad antioxidante determino que la naranja posse mayor
actividad antioxidante relación de los otros frutos cítricos obteniéndose 55.3 mg
ác. Ascórbico/100mL. La degradación de la actividad antioxidante hidrosoluble en
todos los jugos ensayados siguió una ley cinética de orden cero: C= C0 - k.t. Los
valores de la energía de activación (Ea), indicaron una mayor sensibilidad a la
temperatura en el jugo de mandarina con una Ea de 64.748 kJ.mol-1.
BAÑO M, Wilson. 2010. Evaluó el uso de la Stevia como edulcorante natural en
la formulación de una bebida no carbonatada cítrica. Para el estudio se utilizo dos
variedades comerciales de Stevia y los porcentajes de sustitución del azúcar
fueron 25, 50, 75 y 100%. Se realizaron análisis fisicoquímicos y sensoriales entre
los distintos tratamientos pudiéndose apreciar que no se encontraron diferencias
significativas en referencia al pH, acidez y grados Brix. En relación al análisis
sensorial, no se encontró diferencias significativas en cuanto al color, olor, sabor
y aceptabilidad de los tratamientos experimentales, debido al pH comprendido
entre 2.8 y 3.0 que permitió enmascarar de mejor manera el edulcorante utilizado
y haciéndole más agradable para los panelistas.
ELESBÃO R, et al. 2002. Caracterizaron fisicoquímicamente el camu-camu y
determinaron el contenido de acido ascórbico en el fruto cosechado en Para-
Brasil, para lo cual consideraron 3 estados de madurez, según el color: verde, ¾
8
verde y ¾ rojo. Fueron pulpeados y congelados para mejorar los análisis, siendo
estos: sólidos solubles totales, acidez total, prueba de palatabilidad, azucares
solubles totales, azucares reductores, vitamina C, pH, contenido de agua, acidez
titulable total, compuestos revolicos, pectina y enzimas como pectimetilesterasa
(PME) y poligalacturonasa (PG). Se usaron 25 frutos en las 3 repeticiones para
cada estado de madurez. El contenido de ácido ascórbico hallado fue superior en
muchos frutos maduros, variando de 1791,48 a 2061,04 mg/100g. El sabor ácido
del camu-camu es debido a su alta acidez titulable, así distribuida en frutos ¾
rojos – 2,63% de ácido cítrico, y bajo contenido de azúcares solubles – 1,48% de
glucosa en frutos ¾ rojos. Los contenidos de almidón y pectina variaron,
respectivamente, desde 0,43 hasta 0,34% y 0.17 hasta 0,11% en frutos maduros,
analizados desde verdes hasta ¾ rojos, sugiriendo que la extracción de zumo o
pulpa podría ser relativamente fácil y seria poco beneficiada por el uso de
enzimas procesadoras. Por otro lado, el contenido en fenólicos podría indicar un
factor de restricción para su palatabilidad, una vez que ese factor está
generalmente asociado con la astringencia y todas las fracciones solubles en
metanol y en agua, alcanzaron altos contenidos de fenólicos, aunque su contenido
disminuyó con la maduración, desde el fruto verde hasta ¾ rojo.
MAEDA R, et al. 2007. Evaluaron la estabilidad del acido ascórbico y
antocianinas presentes en el néctar de Camu-camu. El néctar fue envasado en
botellas PET y fueron almacenados en diferentes condiciones de luminosidad
(presencia y ausencia de Luz) y temperatura (temperatura ambiente y
refrigeración), siendo evaluados por 120 días. El contenido de ácido ascórbico en
el néctar almacenado con presencia de luz no difirió estadísticamente de los
néctares protegidos de la luz (343,25 y 340,48 mg.100 g -1), respectivamente
almacenados en refrigeración, y (330,48 y 333,56 mg.100 g -1) en los néctares
almacenados a temperatura ambiente. Se encontró que esta vitamina en el néctar
almacenado durante 120 días a la temperatura de refrigeración mostró una buena
estabilidad con una pérdida de sólo 12 a 14%. En cuanto a las antocianinas, la
temperatura contribuyo negativamente, provocando una degradación más rápida,
9
sin embargo, la exposición a la luz no tuvo ningún efecto. Bajo estas condiciones
experimentales, se concluyó que el factor de luz tiene poca influencia en ácido
ascórbico y de antocianinas en el camu-camu, y la temperatura de
almacenamiento es un factor negativo en la estabilidad de estos pigmentos.
SALAS DE LA T. N, et al. 2009. Elaboraron una bebida nutraceutica a partir de
camu camu enfocada en fortalecer el sistema inmunológico de niños por sus
niveles altos de contenido de vitaminas, aminoácidos esenciales y minerales. El
proceso de elaboración involucro una serie de operaciones preliminares para la
obtención de pulpa de camu camu, asi como pulpeado utilizando malla de 2-3 mm
de diámetro, refinado con malla de 0,5 mm de diámetro, pasteurización en placas
a 85° C por 8-15 segundos seguido de un choque térm ico a 18° C para luego ser
envasado en bolsas oscuras y almacenado a -20° C. S e realizaron 2
formulaciones: camu camu (14,28%) – papaya (42,86%) – piña (42,86%) con 350
g de pulpa total y camu camu (50%) - piña (50%) a partir de 120 g de pulpa;
siendo esta ultima la de mejor aceptabilidad y sabor, sin embargo la de mejor
aporte nutricional fue la primera formulación: 1334 mg de acido ascórbico/100
mL., 197,90 ppm de Ca, 47,27 ppm de Mg, 1,24 ppm de Zn y 66,38 cal/100mL de
energía.
4.2 BASES TEORICAS
4.2.1 CAMU CAMU (Myrciaria dubia)
a. Descripción y distribución
El camu camu es un frutal arbustivo nativo de la Amazonía, con niveles
excepcionalmente altos de vitamina C en la pulpa de los frutos, encontrándose
un amplio rango de 877 a 3133 mg/100 g. En el Perú, la especie es abundante
en el sector norte del departamento de Loreto, donde fue aprovechada
10
tradicionalmente por comunidades nativas y mestizas ribereñas (Pinedo et al,
2004).
La especie Myrciaria dubia HBK Mc Vaugh es originaria de la Amazonía, con
abundante diversidad en Loreto, Perú. En el Perú es conocido como Camu
camu, en Venezuela como guayabito y en Brasil como caçari, arazá de agua y
crista de galo.
TABLA N° 2 TAXONOMIA DEL CAMU CAMU
Fuente: Pinedo et al, 2004.
El Arbusto o árbol de Camu-camu es pequeño de 4 a 8 m de altura. El Fruto se
caracteriza por ser bayas globosas o esféricas de 1 a 3 cm de diámetro y peso
variable de 2 a 20 gramos, de cascara delgada, lisa, brillante con puntos
glandulares y color rosado a negro purpura; pulpa carnosa, acida, sabor y
aromas agradables; semillas en numero de 1 a 4 (Brack, 2003).
b. Usos
Se consume el fruto maduro, muy acido, con alto contenido de vitamina C. Los
campos de aplicación de esta vitamina se han ampliado con la investigación
médica, cubriendo temas no solo preventivos de la salud, sino también
Clasificación Taxonómica
Tipo Fanerógamas
Subtipo Angiospermas
Clase Dicotiledóneas
Orden Myrtales
Familia Myrtaceae
Género Myrciaria
Especie dubia (Kunth) Mc Vaugh
11
relacionados con el tratamiento de ciertas enfermedades y en la industria de
cosméticos. Se usa en refrescos, helados y dulces. Actualmente, se fabrica
pastillas de vitamina C en base a la pulpa liofilizada.
c. Valor nutritivo
La pulpa de camu camu tiene altísimo contenido de vitamina C, muy superior a
otras frutas.
TABLA N° 2 COMPOSICION QUIMICA DEL CAMU CAMU
Composición química de l Fruto Composición por 100 gramos de porción comestible
Energía 24 Kcal Calcio 28 mg
Agua 93,3 g Fosforo 15 mg
Proteína 0,5 g Hierro 0,5 mg
Grasa 0,1 g Tiamina 0,01 mg
Carbohidratos 5,9 g Riboflavina 0,04 mg
Fibra 0,4 g Niacina 0,61 mg
Ceniza 0,2 g Acido ascórbico reducido 2780 mg
Fuente: Collazos et al, 1996.
Otro componente de interés en el camu-camu son las antocianinas, con
concentraciones de 0,54 a 74,34 mg.100 g-1 en el fruto. Entretanto, como la
mayoría de los pigmentos naturales, estas presentan inestabilidad.
Normalmente son más estables en condiciones ácidas, pudiéndose degradar
por cualquier mecanismo que lleve a la formación de compuestos menos
coloridos, compuestos oscuros e insolubles. Esta degradación puede ocurrir
durante el procesamiento o almacenamiento del alimento. Los principales
factores que influencian en la estabilidad de estos pigmentos son: pH,
temperatura, presencia de oxigeno y enzimas, además de la interacción con
12
otros componentes del alimento como: ácido ascórbico, iones metálicos,
azúcares y copigmentos.
d. Potencial Económico
El camu camu se encuentra en la etapa inicial o de introducción del ciclo de
vida del producto. Por lo tanto, el conocimiento de la fisiología de maduración y
de post-cosecha, permitirá una correcta evaluación de los diferentes sistemas
de conservación, envase, embalaje, y transporte, haciendo posible su
optimización prolongando el tiempo de vida útil y mejorando la calidad. La
demanda de camu-camu en forma de pulpa para ser utilizada en tabletas o
bebidas se estima en unas 20000 Tm, para lo cual se requiere contar con un
área cultivada en producción de por lo menos 4500 has (Zapata, 2001).
4.2.2 TÉ VERDE (Camellia sinensis)
a. Descripción y distribución
El Té verde (Camellia sinensis), pertenece a la familia de las Theaceae o
Ternstroemiaceae. Es originaria del norte de la India y del sur de China,
extendiéndose posteriormente a toda la zona oriental de Asia (China, Japón,
Java, Ceilán, e Indonesia). Hoy día crece cultivada en muchas zonas tropicales
y subtropicales del mundo.
Del mismo arbusto de Camellia sinensis, se obtienen el famoso té verde, el té
oolong (rojo) el té negro y el té blanco; tanto el negro como el rojo han llevado
un proceso de fermentación de las hojas y partes tiernas del arbusto, por lo que
resulta más benéfico el consumo del té verde que no ha pasado por estos
procedimientos de producción y que por lo tanto contiene mayor cantidad de
principios activos. No obstante, el Té verde se logra mediante la inactivación
13
de las enzimas en las hojas frescas mediante calentamiento o escaldado, para
prevenir la oxidación enzimática de las catequinas (Von Staszewski, 2011).
Se trata de un arbusto perenne de 2 metros de altura, muy ramificado y que
puede alcanzar los 6 metros de altura cuando se encuentra en estado silvestre.
Se reproduce por semillas, cuya fertilidad está limitada a 6 meses, y para
desarrollarse requiere un clima cálido y húmedo de suelo ácido.
Las hojas son de color verde oscuro brillante, cortamente pecioladas, enteras,
oval-oblongas, de 5 a 10 cm de largo y 2-4 cm de ancho, acuminadas,
dentadas en los dos tercios apicales, terminando cada diente en una glándula.
Presentan el nervio medio muy marcado. Las flores son pequeñas de unos
2,5cm de diámetro y con 5 a 8 pétalos blancos. Las flores son axilares,
solitarias y algo caídas. Se agrupan en pares o de tres en tres. El fruto es una
cápsula trígona o esferoidal, algo aplanada, que contiene en su interior una a
cuatro semillas esferoidales del tamaño de una avellana.
TABLA N° 3 COMPOSICION DE LAS HOJAS DE TÉ
Composición química de las Hojas de Té
% Peso Seco
Polifenoles 36 Aminoácidos 4
Carbohidratos no digeribles 25 Metilxantinas (cafeínas) 3.5
Proteína 15 Lípidos 2
Lignina 6.5 Ácidos orgánicos 1.5
Carbohidratos 5,9 g Clorofila 0.5
Minerales 5 Carotenoides <0,1
Fuente: Von Staszewski, 2011.
14
b. Principios activos
Los principales principios activos a los que el té verde debe su actividad son:
bases xánticas y polifenoles (López, 2002). Los polifenoles son un amplio
grupo de metabolitos secundarios que abundan en las plantas. El té presenta
una las concentraciones más altas en polifenoles, hasta un 30% de su peso
seco (Von Staszewski, 2011).
Dentro de las bases xánticas, contiene mayoritariamente cafeína (o teína),
además de teofilina, teobromina, adenina y xantina.
Los polifenoles del té verde son principalmente flavonoides, los cuales son
compuestos de bajo peso molecular que comparten un esqueleto común de
difenil piranos (C6-C3-C6), compuesto de dos anillos bencénicos (A y B) unidos
mediante una cadena piranosa heterocíclica con oxígeno. En función de sus
características estructurales se pueden dividir en seis clases: flavonas,
flavanonas, isoflavonas, flavonoles, flavanoles y antocianinas. Las clases
principales de flavonoides encontradas en la planta de té son flavanoles y
flavonoles.
Dentro de los Flavanoles se agrupan las catequinas, compuestos hidrosolubles
sin color, que imparten amargor y astringencia a las infusiones de té verde. Las
catequinas son los compuestos que son oxidados y que se polimerizan en el té
negro (López, 2002). Las catequinas más abundantes en las hojas frescas de
té y en el té verde son (-)-epigalocatequina galato (EGCG), (-)-epigalocatequina
(EGC), (-)-epicatequina galato (ECG) y (-)-epicatequina (EC). Los flavonoles
encontrados en el té son quercitina, kaempferol y miricitina y constituyen hasta
un 2-3% del extracto hidrosoluble del té (Von Staszewski, 2011).
Los taninos catéquicos se encuentran libres y combinados a bases xánticas;
los ácidos fenólicos más representativos son el ácido clorogénico, el cafeico y
el gálico (López, 2002).
15
Además de estos principios, dentro de la composición química del té verde
también se encuentran aminoácidos libres (como el 5-Netil-glutamina o
theanina, que es un aminoácido específico del té), vitaminas del grupo B y
sales minerales (entre éstas destaca el fluoruro).
4.2.3 STEVIA (Stevia rebaudiana)
a. Descripción y distribución
Stevia rebaudiana, es una planta que procede de las zonas subtropicales y
tropicales de América del Sur y América Central, concretamente de Paraguay y
Brasil; principalmente de la parte selvática subtropical del Alto Paraná. Esta
planta fue usada ancestralmente por sus aborígenes, como edulcorante y
medicina (Landázuri y Tigrero, 2009).
La Stevia está aumentando su consumo al haberse probado la ausencia de
toxicidad, y en la mayor parte del mundo se considera totalmente segura para
el consumo humano (Huayamave et al, 2009).
Stevia rebaudiana pertenece a la familia Asteraceae es una planta herbácea
perenne, tallo erecto, subleñoso; durante su desarrollo inicial no posee
ramificaciones, tornándose multicaule después del primer ciclo vegetativo,
llegando a producir hasta 20 tallos en tres a cuatro años; puede alcanzar hasta
90 cm de altura en su hábitat natural y en los trópicos puede llegar a tener
alturas superiores a 100 cm. La raíz es, pivotante, filiforme, y no profundiza,
distribuyéndose cerca de la superficie. Las hojas son elípticas, ovales o
lanceoladas, algo pubescentes; presentan disposición opuesta en sus estados
juveniles, y alternas cuando las plantas llegan a su madurez fisiológica, previa
a la floración.
16
La flor es hermafrodita, pequeña y blanquecina; su corola es tubular,
pentalobulada, en capítulos pequeños terminales o axilares. El fruto es un
aquenio que puede ser claro (estéril) u oscuro (fértil) y es diseminado por el
viento (Landázuri y Tigrero, 2009).
b. Propiedades
La Stevia es una planta antiácida, antibacteriana bucal, antidiabética,
cardiotónica (regula la presión y los latidos del corazón), digestiva, diurética,
edulcorante, hipoglucemiante, hipotensora, mejoradora del metabolismo y
vasodilatadora.
Tiene efectos beneficiosos en la absorción de la grasa y la presión arterial.
Contrarresta la fatiga, facilita la digestión y las funciones gastrointestinales,
regula los niveles de glucosa en la sangre, nutre el hígado, el páncreas y el
bazo.
Algunos estudios indican su actividad antibiótica, especialmente contra las
bacterias Escherichia coli, Staphylococcus aureus, y Corynebacterium difteriae
que atacan las mucosas bucales y el hongo Cándida Albicans productor
frecuente de vaginitis en la mujer.
c. Principios activos
Los principales componentes de las hojas de stevia son: triterpenos,
monoterpenos, esteroides, taninos, flavonoides, diterpenos labdámicos,
sesquiterpenos y aceites volátiles. La propiedad más importante de la Stevia se
encuentra en sus hojas. Se trata del edulcorante natural llamado esteviósido,
que está constituido por una mezcla de ocho glucósidos diterpénicos
(principalmente el esteviósido y el rebaudiósido, entre otros).
17
Su poder edulcorante es 30 veces mayor que el azúcar y el extracto alcanza de
200 a 300 veces más (Ramírez, 2005). Las hojas tienen el mayor contenido de
esteviosido y rebaudiosido A, que son sus principales principios activos. Los
extractos de S. rebaudiana contienen un alto contenido de glucósidos esteviol
diterpenos. El esteviósido y el rebaudiosido A, son los principales compuestos
responsables del poder edulcorante y normalmente están acompañados por
pequeñas cantidades de otros esteviol glicosidos (Landázuri y Tigrero, 2009).
La concentración de steviósidos y rebaudiosido en la hoja seca es de 6% a
10%, habiéndose registrado ocasionalmente valores extremos de 14%
(Huayamave et al, 2009).
4.2.4 COMPUESTOS FENOLICOS
a. Definición
Los compuestos fenólicos o polifenoles son metabolitos secundarios que se
encuentran en todas las plantas y, por tanto en los alimentos de origen vegetal.
Contribuyen a la estructura de la pared celular de las plantas, a su
pigmentación, protegen de los rayos solares y, en especial, participan en la
defensa contra patógenos y depredadores. Así mismo los polifenoles son
compuestos que participan en el sabor, color y textura de los alimentos y, por
tanto, en un gran número de reacciones que inciden en estos parámetros de
calidad (Shahidi y Naczk, 1995).
Químicamente, los compuestos fenólicos son sustancias químicas que poseen
un anillo aromático, un anillo benceno, con uno o más grupos hidróxidos
incluyendo derivados funcionales (ésteres, metil, ésteres, glicósidos, etc.).
Se presentan en las plantas en forma conjugada con uno o más residuos de
azúcar unidos a los grupos hidroxilos, aunque en algunos casos se pueden
producir uniones directas entre una molécula de azúcar y un carbono
18
aromático. Por ello la forma más común de encontrarlos en la naturaleza es en
forma de glicósidos, siendo solubles en agua y solventes orgánicos (Espinal,
2009).
b. Capacidad Antioxidante
La capacidad antioxidante descrita para distintos polifenoles se puede
considerar como la actividad biológica responsable del efecto preventivo que se
les atribuye sobre determinadas enfermedades frecuentes en los países
desarrollados como son la enfermedad cardiovascular y el cáncer epitelial.
Los antioxidantes son compuestos que inhiben o retrasan la oxidación de otras
moléculas mediante la inhibición de la propagación de la reacción de oxidación.
Los antioxidantes pueden clasificarse en naturales o sintéticos, estando estos
últimos en desuso debido a estudios que les atribuyen efectos carcinógenos.
Este hecho ha despertado un creciente interés en el estudio de los
antioxidantes naturales entre los que se encuentran distintos compuestos
fenólicos.
El comportamiento antioxidante de los compuestos fenólicos parece estar
relacionado con su capacidad para quelar metales, inhibir la lipoxigenasa y
captar radicales libres, aunque en ocasiones también pueden promover
reacciones de oxidación "in vitro". Los compuestos fenólicos actúan como
prooxidantes quelando metales, bien de manera que mantienen o incrementan
su actividad catalítica o bien reduciendo metales, incrementando así su
capacidad para formar radicales libres de los peróxidos.
Para que un compuesto fenólico sea clasificado como antioxidante debe
cumplir dos condiciones básicas. La primera es que cuando se encuentre en
una concentración baja con relación al sustrato que va a ser oxidado pueda
retrasar, enlentecer o prevenir la autooxidación o la oxidación mediada por un
19
radical libre. La segunda es que el radical formado tras el secuestro sea estable
y no pueda actuar en oxidaciones posteriores. Entre los compuestos fenólicos
con una reconocida actividad antioxidante destacan los flavonoides, los ácidos
fenólicos (principalmente hidroxicinámico, hidroxibenzóico, caféico,
clorogénico), taninos (elagitaninos), calconas y cumarinas, los cuales
constituyen la fracción polifenólica de una gran diversidad de alimentos
(Espinal, 2009).
20
CAPITULO V
HIPOTESIS Y VARIABLES
5.1 HIPOTESIS
5.1.1 Hipótesis General
Si formulamos una bebida a base de Té verde, Camu camu y Stevia, entonces
obtendremos un producto con bajo contenido de azúcar y alta capacidad
antioxidante.
5.1.2 Hipótesis Especifica
• Si formulamos una bebida con una proporción de 97% de Té verde, 3%
de Camu-camu y un 50% de sacarosa sustituida por Stevia en polvo,
entonces obtendremos un producto con bajo contenido de azúcar y alta
capacidad antioxidante.
• Si formulamos una bebida con una proporción de 97% de Té verde, 3%
de Camu-camu y un 60% de sacarosa sustituida por Stevia en polvo,
entonces obtendremos un producto con bajo contenido de azúcar y alta
capacidad antioxidante.
• Si formulamos una bebida con una proporción de 95% de Té verde, 5%
de Camu-camu y un 50% de sacarosa sustituida por Stevia en polvo,
entonces obtendremos un producto con bajo contenido de azúcar y alta
capacidad antioxidante.
• Si formulamos una bebida con una proporción de 95% de Té verde, 5%
de Camu-camu y un 60% de sacarosa sustituida por Stevia en polvo,
entonces obtendremos un producto con bajo contenido de azúcar y alta
capacidad antioxidante.
21
5.2 VARIABLES
5.2.1 Variables Independientes
• Proporción de Camu camu y Té verde en la formulación.
• Porcentaje de sustitución de sacarosa por Stevia
5.2.2 Variables Dependientes
• Capacidad antioxidante de la bebida
• Aceptabilidad de la bebida formulada
5.3 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
- Causa: Proporciones de Té verde, Camu-camu y porcentajes de sustitución de
sacarosa por Stevia en la formulación.
- Efecto: Presencia de antioxidantes naturales en una bebida hipocalórica.
VARIABLE TIPO DIMENSION INDICADOR ESCALA VI
Proporción Camu-camu y Té
verde
Cuantitativo Potencial
antioxidante de las materias primas
Incremento de la capacidad
antioxidante de la bebida
Te verde: camu-camu 95 : 5 97 : 3
VI Porcentaje de sustitución de sacarosa por
Stevia
Cuantitativo
Intensidad de dulzor por sustitución parcial de la
sacarosa
Reducción de sacarosa en la
formulación
Sacarosa sustituida por Stevia 50 % 60 %
VD Capacidad
Antioxidante Cuantitativo
Potencial de reducción de
radicales libres
Incremento del contenido de Fenoles totales y una mayor
actividad antioxidante
Fenoles Totales / ABTS
[µmol/gmf ]
VD Aceptabilidad de
la bebida formulada
Cuantitativo Nivel de aceptación
del producto Mejora en la
valoración sensorial Escala hedónica de 7
puntos
22
CAPITULO VI
MATERIALES Y METODOS
A. LUGAR DE EJECUCIÓN
La presente investigación se llevará a cabo con la colaboración de las siguientes
instituciones u empresas:
• La elaboración de las bebidas experimentales se llevará a cabo en la empresa
SELVA INDUSTRIAL S.A ubicado en el Jr. Víctor Andrés Belaunde 801
Carmen de la Legua, Reynoso - Callao.
• Los análisis fisicoquímicos y microbiológicos necesarios para la realización de
esta investigación, se efectuarán en los laboratorios de análisis
microbiológicos y análisis químico del CENTRO EXPERIMENTAL
TECNOLÓGICO de la Universidad Nacional del Callao (CET).
• Las pruebas espectrofotométricas se llevaran a cabo en los laboratorios de la
COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES DEL PERÚ S.A ubicado en la Av.
Maquinarias 2360 Cercado de Lima – Lima, y en los Laboratorios de la
Facultad de Ingeniería Pesquera y de Alimentos de la Universidad Nacional
del Callao.
La ejecución de la presente investigación se realizará entre los meses de
Diciembre del 2012 y Marzo del 2013.
B. MATERIALES Y EQUIPOS
B.1 Materiales
• Pipetas de 1, 5 y 10 mL.
• Buretas de 50 mL.
• Probeta de 100 mL
23
• Pizetas.
• Vasos de precipitación.
• Tubos de ensayo.
• Matraz 250 mL
• Envases de vidrio 375 mL
B.2 Equipos e Instrumentos
• Espectrofotómetro UV/Vis.
• Cámara de refrigeración.
• Potenciómetro
• Refractómetro
• Termómetro
• Marmita volcable
• Pulpeadora
• Micropipeta 10-1000 µL
• Picnómetro
• Centrifuga
B.3 Reactivos
• Ácido Cítrico P.A (Grado Alimenticio)
• CMC
• Sorbato de potasio P.A
• Etanol.
• Fenolftaleína
• NaOH 0.1 N
• Soluciones Buffer 4.01 y 7.01
• Reactivo Folin –Ciocalteu
• Ácido gálico Q.P
• Carbonato de Sodio Q.P
24
• Agua peptonada tamponada
• Placas 3M™ Patrifilm™ para Recuento de Aerobios.
• Placas 3M™ Petrifilm™ E. coli/Coliformes.
• Placas 3M™ Petrifilm™ para Mohos y Levaduras.
• ABTS [2,2'-azinobis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6- ácido sulfónico)]
• Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-ácido de tetrametilcroman-2-carboxílico
• Persulfato potásico
• Ácido ascórbico Q.P
• Ácido oxálico acético
• 2,6 diclorofenolindofenol
B.4 Material experimental
• Té verde (Camellia sinensis).
• Camu camu (Myrciaria dubia).
• Stevia (Stevia rebaudiana).
6.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN
La presente investigación se caracteriza por ser longitudinal ya que estudiará la
variable a lo largo del tiempo establecido por ser éste el determinante en la
relación causa efecto. Según el análisis y alcance de sus resultados es de tipo
experimental porque permitirá introducir y manipular el factor causal
(Proporciones de Té verde, Camu-camu y porcentajes de sustitución de sacarosa
por Stevia en la formulación) para determinar su efecto (aceptabilidad y
propiedades antioxidantes de la bebida hipocalórica). Finalmente es Aplicada
porque el propósito de este proyecto es resolver un problema de naturaleza
práctica permitiendo aplicar los resultados, los cuales serán de posterior utilidad
para mejorar la formulación de bebidas a base te verde y camu camu.
25
6.2 DISEÑO DE INVESTIGACION
La presente investigación contara con un diseño experimental 22 donde se
evaluaran dos niveles de cada factor para finalmente tener respuesta en cuanto al
mejor nivel de aceptabilidad y la mayor capacidad antioxidante que pueda ofrecer
la bebida hipocalórica a base de Té verde y Camu camu. El uso del diseño
factorial 22 permitirá medir como influyen los dos factores seleccionados en el
proceso, además de poder descubrir si existe interacción entre ellos.
Los factores seleccionados y sus correspondientes niveles se presentan a
continuación:
Factores Dominio Experimental
Nivel 1 (-) Nivel 2 (+)
X1: Proporción Té verde: Camu-camu (%) 97 : 3 95 : 5
X2: Sacarosa sustituida por Stevia (%) 50 60
El diseño experimental evaluara dos factores: el nivel de aceptabilidad y la
capacidad antioxidante.
Experimento
Matriz de experimentación Plan de experimentación
X1 X2 Té verde:
Camu-camu (%) Sacarosa
sustituida (%)
1 - - 97 : 3 50
2 - + 97 : 3 60
3 + - 95 : 5 50
4 + + 95 : 5 60
26
El diseño experimental comprende desarrollar el plan de experimentación por
triplicado, iniciándose con el factor concerniente al nivel de aceptabilidad de
acuerdo a ello, la formulación resultante será luego evaluada mediante pruebas
espectrofotométricas a fin de determinar la capacidad antioxidante de la bebida
formulada aceptada por el panel sensorial.
Tabla N° 5 Diseño de la Investigación
VARIABLES
INDEPENDIENTES FACTOR B
Sacarosa sustituida por Stevia
NIVELES
B1 50 %
B2
60 % FACTOR A
Proporción Té verde: Camu-
camu en la formulación
(%)
A1 97 : 3 GE1 (A1 B1) GE2 (A1 B2)
A2 95 : 5 GE3 (A2 B1) GE4 (A2 B2)
VARIABLES DEPENDIENTES Aceptabilidad de las bebidas formuladas Capacidad antioxidante del producto final
Así mismo quedan limitados los grupos experimentales:
• GE1: Corresponde a las bebidas formuladas con una proporción de 97% de
Té verde, 3% de Camu-camu y un 50% de sacarosa sustituida por Stevia en
polvo.
• GE2: Corresponde a las bebidas formuladas con una proporción de 97% de
Té verde, 3% de Camu-camu y un 60% de sacarosa sustituida por Stevia en
polvo.
• GE3: Corresponde a las bebidas formuladas con una proporción de 95% de
Té verde, 5% de Camu-camu y un 50% de sacarosa sustituida por Stevia en
polvo.
• GE4: Corresponde a las bebidas formuladas con una proporción de 95% de
Té verde, 5% de Camu-camu y un 60% de sacarosa sustituida por Stevia en
polvo.
27
FIGURA N° 1. Diagrama experimental del estudio
Té verde
Proceso de extracción
Infusión Base
Camu-camu
Proceso de obtención
Zumo
95% 97% 5% 3%
Proceso de Elaboración
Bebidas Experimentales
Gx1 Gx2 Gx3 Gx4
Sacarosa sustituida por
Stevia en Polvo
M1 M2 50% 60%
F1 F2 F3 F4
Análisis Sensorial Caracterización Análisis Fisicoquímico Análisis Microbiológico
Fenoles Totales
Capacidad Antioxidante
Formulas experimentales
Mezclas o diluciones
Grupos Experimentales
Concentraciones
V. I
V. I
• Aerobios mesófilos • Mohos y Levaduras • Coliformes Totales
• pH • Grados Brix • Densidad
• Dulzor • Acidez • Sabor • Color • Aceptabilidad
Fuente: Elaboración propia.
Ác. Ascórbico (Vit. C)
28
6.3 POBLACIÓN Y MUESTRA
La población estará determinada por todas las botellas de 300 mL de bebidas
formuladas y elaboradas en el presente estudio. El muestreo será aleatorizado,
tomando 3 muestras para cada tratamiento, para cada análisis y para cada
iteración.
6.4 METODOS DE ANALISIS
6.4.1 Determinación de Sólidos Solubles por Método Refractométrico
(AOAC 932.14 Apéndice C, 1998)
La determinación de sólidos solubles totales (°Brix ) se realizará en un
refractómetro digital (MA 871) con escala de 0 a 85°Bx. La calibración del
refractómetro se realizará colocando unas gotas de agua destilada a 20°C ±
1°C sobre el sensor óptico del refractómetro, enseg uida se ajustará la escala a
cero, luego se procederá a limpiar y secar el sensor óptico con papel tisúe.
Después se colocará unas gotas de la muestra sobre el sensor óptico, y se
presionará la opción READ, con lo cual se realizará la lectura, y se leerá
directamente el porcentaje de sólidos solubles totales en la escala de grados
Brix.
6.4.2 Determinación de pH (AOAC 10.035, 1995)
La determinación de pH se realizará mediante un potenciómetro VWR
Scientific. El cual se calibrará con soluciones buffer de pH 7.01 y 4.01 a
temperatura ambiente. Para la medición, se colocará una muestra de 20 ml en
un vaso de precipitación de 50 ml. El electrodo del potenciómetro, previamente
calibrado, se introducirá en la muestra por varios segundos, hasta que se
estabilice la lectura de pH en la pantalla.
29
6.4.3 Determinación de la Acidez Titulable (AOAC 94 2.15, 1998)
La acidez total se determinara por valoración directa con Hidróxido de sodio a
0.1 N, usando como indicador una solución de Fenolftaleína al 1%. Los
resultados se expresaran como % de ácido cítrico.
6.4.4 Determinación de Densidad por Método Picnómet ro (AOAC
932.14 Apéndice B, 1998)
La determinación de densidad se realizará con un picnómetro de 100 mL. Se
pesará el picnómetro vacio (P0) y se anotará los resultados. Posteriormente se
llenará el picnómetro con agua destilada a 20 °C, s e pesará y anotará los
resultados (PW). Finalmente, se procederá a llenar el picnómetro con la muestra
y se determinará el peso del picnómetro con la muestra (PM). Anotar resultados
en la siguiente Tabla.
RE
PE
TIC
IÓN
Temperatura (°C) Picnómetro Vacio (P0)
Picnómetro + H2O (PW)
Picnómetro + Muestra
(PM)
Volumen (mL)
Densidad (g/mL)
Agua Muestra
1
2
3
Todas las medidas se realizaron por triplicado. La densidad se obtuvo a partir de la
siguiente ecuación:
ρ � P� � P�
P� � P�
Donde: PM: peso del picnómetro lleno de zumo (g) P0: peso del picnómetro vacío (g) Pw: peso del picnómetro lleno de agua (g)
ρ: densidad del zumo (g/cm3)
30
6.4.5 Determinación de ácido ascórbico por titulaci ón con 2,6 -
diclorofenolindofenol (AOAC 967.21: 1998)
a. Valoración del 2,6 diclorofenolindofenol.
Se prepara una solución estándar de ácido ascórbico con 50 mg de ácido
ascórbico que se transfieren a un matraz de 50 ml y se afora con una solución
de ácido oxálico acético. Se transfieren 2 ml de la solución estándar a un
matraz de 50 ml y se agregan 5 ml de una solución de ácido oxálico acético. Se
valora con una solución de 2,6 diclorofenolindofenol mediante una bureta,
hasta que se observe la aparición de un tono rosa pálido que persista por lo
menos 5 segundos. Esto se hace por triplicado. De la misma manera se lleva a
cabo la valoración de tres referencias que contienen 7 ml de la solución de
ácido oxálico-acético más un volumen igual al gastado en la titulación del
estándar; el valor obtenido se resta al volumen promedio requerido para valorar
el estándar. La concentración de indofenol se expresa como mg de ácido
ascórbico equivalentes a un ml de indofenol.
b. Determinación del contenido de ácido ascórbico e n la muestra.
Se homogenizan 5 g de muestra con 30 ml de una solución al 5% de ácido
oxaloacético. El homogenizado y los lavados se traspasan a un matraz aforado
de 50 ml, y se lleva a volumen con la misma solución. El extracto se filtra
primero a través de una membrana de 0.45 micras. Se toma una alícuota de 10
ml del filtrado y se titula con la solución de indofenol ya valorada. Se resta el
volumen requerido para valorar la muestra, y se hacen los cálculos necesarios
para expresar los resultados como mg de ácido ascórbico por 100 g de
muestra.
6.4.6 Determinación de Fenoles Totales (Kuskoski et al, 2005)
El método espectrofotométrico desarrollado por FOLIN y CIOCALTEAU, para la
determinación de fenoles totales, se fundamenta en su carácter reductor y es el
31
más empleado. Se utiliza como reactivo una mezcla de ácidos fosfowolfrámico
y fosfomolibdíco en medio alcalino (reactivo Folin –Ciocalteu), que se reducen
al oxidar los compuestos fenólicos, originando óxidos azules de wolframio
(W8O23) y molibdeno (Mo8O23).
Se mezclará 20µl de muestra, 1µL solución Folin & Ciocalteau (0,2 N) y 500 µl
de Na2CO3 (75 g/l). La mezcla será homogenizada y calentada a 45 ºC. La
absorbancia del color azul desarrollado se medirá a 765 nm. La absorbancia
final de cada muestra será comparada con una curva estándar de ácido gálico
(40-200 mg/l).Los resultados serán expresados como µmol equivalentes de
ácido gálico (GAE) por gramo de muestra ó mg de ácido gálico por 100 g de
muestra.
6.4.7 Determinación de la Capacidad Antioxidante To tal (Re et al, 1999)
Para determinar la actividad antioxidante total (TAC) se utilizó el método de
ABTS [2,2'-azinobis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6- ácido sulfónico)], el
compuesto estándar que se utilizará será el trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-ácido de
tetrametilcroman-2-carboxílico). Para las lecturas de la absorbancia se utilizará
un espectrofotómetro marca Perkin Elmer, modelo: Lamda 25 UV / VIS,
Spectrometer.
Según la metodología desarrollada por RE, et al (1999), el radical ABTS•+ se
obtiene tras la reacción de ABTS (7 mM) con persulfato potásico (2,45 mM,
concentración final) incubados a temperatura ambiente (±25ºC) y en la
oscuridad durante 16 h. Este reactivo se mantiene estable por 2 a 3 días si se
guarda en la oscuridad. Una vez formado el radical ABTS•+ se diluye con
etanol hasta obtener un valor de absorbancia comprendido entre 0,70 (±0,1) a
754 nm (longitud de onda de máxima absorción). Las muestras se diluyen con
etanol hasta que se produce una inhibición del 20 al 80%, en comparación con
la absorbancia del blanco, tras añadir 20 µL de la muestra. A 980 µL de dilución
32
del radical ABTS•+ así generado se le determina la A754 a 30ºC, se añade 20
µL de la muestra y se mide de nuevo la A754 pasado 1 minuto. La absorbancia
se mide de forma continua transcurridos 7 minutos.
La disminución de la coloración es expresada como el porcentaje de inhibición
de ABTS, la cual es comparada con una curva estándar del antioxidante
sintético de referencia, Trolox a una concentración de 0-15 µM (concentración
final) en etanol, en las mismas condiciones, lo que se hace también con ácido
ascórbico (0-20 mg/100 mL). Los resultados se expresan en TEAC (actividad
antioxidante equivalente a Trolox) ó µmol de Trolox equivalente por gramo de
muestra, y en VCEAC (actividad antioxidante equivalente a vitamina C) por
tratarse de un alimento.
6.4.8 Recuento de Aerobios Mesófilos (Método de pel ículas secas
rehidratables - Petrifilm™ . AOAC 990.12, 2005)
a. Preparación de las Muestras
Se pesaran 10 ml de la muestra y se agregaran a 90 ml de agua peptonada al
0.1% contenido en un matraz de 250 ml, agitándose manualmente.
Posteriormente se realizaran diluciones seriadas en base 10, obteniéndose
diluciones 10-2 y 10-3.
b. Siembras en placas Petrifilm 3M™ AC
• Se dispondrá de la placa Petrifilm en una superficie plana y nivelada.
• Se levantará la película superior y usando una pipeta se incorporara 1ml de
cada una de las diluciones en el centro de la película, realizándose el
análisis por triplicado.
• Se dejará caer la película superior sobre la muestra cuidando que no se
formen burbujas.
33
• Se colocara suavemente el dispersor plástico por el lado de la pestaña
hacia abajo sobre la lamina superior, cubriendo el inoculo.
• Se levantara el dispersor y se dejara reposar por dos minutos para que
solidifique el gel.
• Se incubaran las placas boca arriba en grupos de máximo 20 placas a 35 ±
2 °C durante 48 horas.
• Posteriormente se realizara el recuento de unidades formadoras de
colonias que presentaron color rojizo.
• Se reportara los resultados en unidades formadoras de colonias por
mililitros (ufc/ml) considerando el factor de dilución utilizado.
6.4.9 Recuento de Hongos y Levaduras (Método de pel ículas secas
rehidratables - Petrifilm™ . AOAC 997.02, 2005)
a. Preparación de las Muestras
Se pesaran 10 ml de la muestra y se agregaran a 90 ml de agua peptonada al
0.1% contenido en un matraz de 250 ml, agitándose manualmente.
Posteriormente se realizaran diluciones seriadas en base 10, obteniéndose
diluciones 10-2 y 10-3.
b. Siembras en placas Petrifilm 3M™ Mohos y Levadur as
• Se dispondrá de la placa Petrifilm en una superficie plana y nivelada.
• Se levantará la película superior y usando una pipeta se incorporara 1ml de
cada una de las diluciones en el centro de la película, realizándose el
análisis por triplicado.
• Se dejará caer la película superior sobre la muestra cuidando que no se
formen burbujas.
• Se colocará suavemente el dispersor plástico correspondiente sobre la
lámina superior, cubriendo el inóculo.
34
• Se levantara el dispersor y se dejara reposar por dos minutos para que
solidifique el gel.
• Se incubaran las placas boca arriba en grupos de máximo 20 placas a 22 ±
2 °C durante 3 – 5 días.
• Posteriormente se realizara el recuento de hongos quienes se observaran
como colonias grandes, difusas y de color variable, mientras que las
levaduras forman colonias pequeñas con borde definido y de color azul-
verdoso.
• Se reportara los resultados en unidades formadoras de colonias por
mililitros (ufc/ml) considerando el factor de dilución utilizado.
6.4.10 Recuento de Coliformes Totales (Método de pe lículas secas
rehidratables - Petrifilm™ . AOAC 991.14, 2005)
c. Preparación de las Muestras
Se pesaran 10 ml de la muestra y se agregaran a 90 ml de agua peptonada al
0.1% contenido en un matraz de 250 ml, agitándose manualmente.
Posteriormente se realizaran diluciones seriadas en base 10, obteniéndose
diluciones 10-2 y 10-3.
d. Siembras en placas Petrifilm 3M™ Coliformes
• Se dispondrá de la placa Petrifilm en una superficie plana y nivelada.
• Se levantará la película superior y usando una pipeta se incorporara 1ml de
cada una de las diluciones en el centro de la película, realizándose el
análisis por triplicado.
• Se dejará caer la película superior sobre la muestra cuidando que no se
formen burbujas.
• Se colocara suavemente el dispersor plástico por el lado liso sobre la
lamina superior, cubriendo el inoculo.
35
• Se levantara el dispersor y se dejara reposar por dos minutos para que
solidifique el gel.
• Se incubaran las placas boca arriba en grupos de máximo 20 placas a 35 ±
2 °C durante 24 horas.
• Posteriormente se realizara el recuento de unidades formadoras de
colonias que presentaron color rojo con presencia de gas.
• Se reportara los resultados en unidades formadoras de colonias por
mililitros (ufc/ml) considerando el factor de dilución utilizado.
6.5 TECNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCION DE DATOS
6.5.1 Elaboración de la bebida experimental
Las etapas y operaciones unitarias para la elaboración de la bebida
experimental se detallan en la Fig. N° 1.
a) Obtención de la Infusión de Té verde.
Para la obtención de la infusión de Té verde, se seleccionará e higienizará
la materia prima. Para la extracción se considerará una proporción de 1 a 25
en relación Té verde: agua; dicha extracción se realizara a 95 – 98 °C por 5
– 10 minutos. Posteriormente se filtrará y almacenará en refrigeración hasta
su uso.
b) Obtención de Zumo de Camu-camu
El Camu-camu recepcionado será seleccionado e higienizado, para
posteriormente se realice el pulpeado en una Pulpeadora semi-industrial con
malla 1.5 mm. Seguidamente se realizará el refinado con una malla de 0.5
mm.
36
El zumo de Camu-camu e infusión de Té verde obtenidos serán destinados
para realizar las diluciones respectivas, de acuerdo al diseño experimental de
la investigación.
c) Estandarización de la Bebida
La estandarización de la bebida se realizará en una Marmita con agitador.
En esta etapa se considerará la regulación de la acidez con acido cítrico (pH
3.5 – 3.8), Regulación de sólidos solubles (°Brix 1 2 – 13) para lo cual se
considerará una sustitución parcial de la sacarosa por edulcorante natural en
polvo (Stevia). Además de la adición de otros aditivos permitidos.
d) Pasteurización y operaciones finales
La pasteurización de la bebida estandarizada se realizará en una Marmita
con agitador, a una temperatura de 82 – 85 °C por 1 0 – 15 minutos o en un
intercambiador de calor por placas a 82 – 85 °C por 8 – 15 segundos.
Posteriormente, se envasará en caliente (85 – 90 °C ) para que permita la
formación del vacío en el envase. Finalmente se enfriará mediante choque
térmico y se almacenará a 8 ± 2 °C, con la intenció n de garantizar la
estabilidad de las propiedades antioxidantes de bebida elaborada.
6.5.2 Formulación de las bebidas experimentales
La formulación de la bebida será realizada considerando las variables
independientes del estudio, quedando diseñado las siguientes
formulaciones experimentales:
37
Insumo Formulació
n 1
Formulación 2
Formulación 3
Formulación 4
Infusión de Té verde 9700 9700 9500 9500
Zumo de Camu-camu 300 300 500 500
Sacarosa (Azúcar blanca) (*) 50 % 60 % 50 % 60 %
Edulcorante (Stevia en polvo) (**) Sustitución Sustitución Sustitución Sustitución
Acido Cítrico (***) BPF BPF BPF BPF
Estabilizante (CMC) (****) 0.05% 0.05% 0.05% 0.05%
Conservante (Sorbato de K) (****) 0.025% 0.025% 0.025% 0.025%
(*) % de sustitución de la sacarosa requerida para alcanzar 12-13 ° Brix de la bebida. (**) Cantidad necesaria para sustituir la sacarosa en la formulación (en relación al poder edulcorante, Stevia: Sacarosa de 1:100) (***) Cantidad necesaria para regular el pH de la bebida (pH: 3.5 – 3.8) (****) Porcentaje en relación al total de la bebida elaborada.
38
FIGURA N° 2
Diagrama de flujo para la elaboración de una bebida a base de Té verde y Camu-camu ( Myrciaria durbia) endulzado parcialmente con Stevia
Estandarizado
Pasteurizado
Envasado
Sellado
Enfriado
Etiquetado
Almacenado
Dilución Infusión Te verde: Camu-camu Acidez de 0.3 a 0.4% 12 - 13º Brix Sacarosa / Edulcorante Estabilizador
(85 º C/ 10 min)
(85 º C)
Lavado
Extracción
Filtrado
Camu-camu
Selección
(Metabisulfito de Na al 0.5% por 10 min.)
(Mal la de 0.5 mm)
(Mal la de 1.5 mm)
Selección
Té verde
Lavado
Remojado
Pulpeado
Refinado
(18 º C)
(8 ± 2 º C)
Té verde: Agua 1: 25 (90 - 95 ° C/ 5 - 10 min)
Fuente: Elaboración propia.
39
6.5.3 Análisis sensorial de las bebidas experimenta les
Se evaluaran sensorialmente las cuatro formulaciones (bebidas experimentales).
Para la prueba se contara con 30 panelistas no entrenados, los cuales
calificaran las cuatro muestras debidamente codificadas a una temperatura de
20 °C (temperatura ambiental), para esto se utiliza rá una prueba de valoración
con una escala hedónica de siete puntos.
Escala Hedónica de 7 Puntos
Puntaje Calificación
1 Me disgusta extremadamente
2 Me disgusta mucho
3 Me disgusta ligeramente
4 Ni me gusta ni me disgusta
5 Me gusta un poco
6 Me gusta mucho
7 Me gusta extremadamente
Ver ficha de evaluación sensorial (Anexo N° 1)
6.5.4 Evaluación de las propiedades antioxidantes d e la bebida
formulada
Para los análisis respectivos se procederá a acondicionar la muestra. Para ello
se centrifugará la bebida experimental a fin de obtener una fracción de suero, el
cual nos permitirá la evaluación de propiedades antioxidantes de las muestras
experimentales.
La evaluación de las propiedades antioxidantes de la bebida formulada y
aceptada sensorialmente, consistirá en la determinación del contenido de acido
40
ascórbico, compuestos fenolicos totales (Fenoles Totales) y la determinación
de la capacidad antioxidante, por los métodos detallados en los Apartados
6.4.4, 6.4.5 y 6.4.6 respectivamente.
Evaluación de las propiedades Antioxidantes del Pro ducto Final
PARAMETROS R1 R2 R3 PROM
Contenido de Ác. 40scórbico (mgr Ác. 40scórbico/ 100 g muestra)
Fenoles Totales (µmol Trolox / g muestra)
Capacidad Antioxidante Total (µmol ácido gálico /g muestra)
6.5.5 Evaluación fisicoquímica y microbiológica de la bebida
formulada
La evaluación fisicoquímica de la bebida formulada consistirá en la
determinación de pH, acidez, °Brix y Densidad del producto formulado. Los
métodos se encuentran detallados en el Apartado 6.4 .
Evaluación Fisicoquímica del Producto Final
PARAMETROS R1 R2 R3 PROM
pH
Acidez (% Ác. Cítrico)
° Brix
Densidad (g/mL)
La evaluación microbiológica de la bebida formulada consistirá en el recuento
de Aerobios mesófilos, Mohos, Levaduras y Coliformes totales del producto
final (NTS N° 071 – DIGESA, 2008), los cuales se en cuentran detallados en el
Apartado 6.4 .
41
Recuento Bacteriológico del Producto Final (ufc/g)
PARAMETROS R1 R2 R3 PROM
Aerobios Mesófilos
Mohos
Levadura
Coliformes Totales
6.6 TECNICAS DE ANALISIS DE DATOS
Los resultados de la evaluación sensorial serán analizados con los test de
análisis (prueba sensorial no paramétricas) de Friedman y Test de
comparación de media LSD (Diferencia Media Significativa). El análisis
aplicado de Friedman, determinará si existen diferencias significativas en el
grado de satisfacción de las bebidas formuladas a un nivel de confianza del
95%. El LSD ayudará a determinar los grupos homogéneos, encontrando si
existe o no diferencia entre las bebidas formuladas (α =0.05).
La presencia de efectos del uso de Té verde, Camu-camu y Stevia sobre las
propiedades antioxidantes de las bebidas formuladas, se medirá a través del
aumento de la concentración de Fenoles totales y un incremento de la
capacidad antioxidante. La semejanza o diferencia entre los tratamientos o
grupos experimentales, se establecerá mediante el análisis de varianza ANVA,
con un nivel de significancia p=0.05, utilizando las iteraciones realizadas.
La estimación del mejor tratamiento que evidencie una mayor concentración
de Fenoles Totales y Mayor Actividad Antioxidante, para los valores medios de
los tratamientos, se obtendrán por comparaciones múltiples que es posible con
3 unidades repetitivas para el diseño Factorial Simple de 2 x 2, aplicando en
primer lugar un diseño de Tuckey, y como segundo lugar el diseño de Duncan.
El procesamiento de los datos se realizará con el programa estadístico
XLSTAT 2012 complemento para Windows Office 2010.
42
CAPITULO VII
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
El presente cronograma muestra la duración de las diferentes actividades:
ACTIVIDADES SEMANAS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11
12
13
14
15
16
a. Revisión de bibliografía X X X X X X
b. Elección del tema de investigación
X
c. Formulación del anteproyecto X X
d. Elaboración del anteproyecto X X X
e. Organización de recursos X X
f. Implementación del proyecto X X
g. Ejecución del estudio X X X X X X X
h. Procesamiento de datos X X X
i. Análisis e interpretación de los resultados
X X
j. Elaboración del informe final X X
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CAPITULO VIII
PRESUPUESTO DEL PROYECTO
ESPECIFICACIONES Meses Unidades Valor Unitario
Total Parcial (S/.)
Honorarios
Investigadores 4 2 750 6000
Asistentes 2 1 375 750
Servicios y/o Alquileres
Planta piloto - Operaciones Unitarias 2 - 1200 2400
Laboratorios de Análisis 2 - 1200 2400
Equipos e Instrumentos
Espectrofotómetro UV/VIS - 1 18500 18500
Micropipeta 10 -1000 µL - 1 550 550
Materiales
Materias Primas e insumos - - 600 600
Envases de vidrios (Botellas, Viales, etc) - - 250 250
Reactivos para análisis - - 1500 3850
Otros suministros - - 200 200
Suministros informáticos y de Oficina
Papel de escritorio (Paquete de 500 und) - 2 15 30
Cartuchos de Tintas (B/N, Color) - 4 35 140
Otros (Ej. Mantenimiento y/o repuestos) - - 100 100
Fotocopias, impresiones y anillados
Fotocopias - 1000 0.10 100
Impresión y anillados (proyecto) - 4 15 60
Empastados (informe final) - 4 25 100
Viajes y Movilidades
Pasajes 4 20 5 400
Otros gastos (reuniones, varios) 4 1 20 80
Imprevistos
Máximo 5 % del aporte DGI 1500
TOTALES 38010
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CAPITULO IX
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
� AOAC INTERNATIONAL. Métodos Oficiales de Análisis. 16va Edición. 4ta
revisión. Maryland-USA.1998.
� BRACK EGG, Antonio. “Perú: Diez mil años de domesticación”. Editorial Bruño.
Lima. Perú, 2003.
� COLLAZOS y col. (1996) “Tablas peruanas de composición de los alimentos”.
Ministerio de Salud. Instituto Nacional de Salud – Centro Nacional de
Alimentación y Salud. Lima. Perú.
� DIGESA. Norma Sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad
sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humanos. NTS
Nº 071-MINSA/DIGESA-V.01. Lima – PERÚ, 2008.
� DOMÍNGUEZ C, Carmela. Formulación y pasterización de una bebida con
mezclas de jugos no clarificados de piña-guayaba-mango. Tesis Magistral.
Universidad de las Américas Puebla. Mexico, 2004.
� ELESBÃO R. y col. Camu camu (myrciaria dubia Mc Vaugh): A rich natural
source of vitamin C. Proc. Interamer. Soc. Trop. Hort. 46:11-13. Octubre, 2002.
� ESPINAL, Natalia. Extracción y caracterización fisicoquímica del contenido
tánico en la corteza de cinco especies forestales procedentes del departamento
de petén, aprovechando el subproducto de la industria de aserradero. Tesis de
Pre-Grado. Universidad se San Carlos de Guatemala. 2009.
� FENNEMA, Owen. Química de los alimentos. Editorial Acribia S.A. Zaragoza,
España 2000.
45
� GUIJA H, TRONCOSO L, GUIJA E. Propiedades prooxidantes del camu camu
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Facultad de Medicina. Lima-Perú, 2005; 66(4): 261-268
� IBARZ, A., BARBOSA, G., GARZA, S Y CIMENO, V. Métodos Experimentales
en la Ingeniería Alimentaria. Editorial Acribia. Zaragoza, España 2000.
� Instituto Nacional de Defensa de la Competencia y de la Protección de la
Propiedad Intelectual. INDECOPI. Norma Técnica Nacional. NTP 203.110.
JUGOS, NÉCTARES Y BEBIDAS DE FRUTA. Requisitos. Año 2009.
� KUSKOSKI, Marta, y col. APLICACIÓN DE DIVERSOS MÉTODOS QUÍMICOS
PARA DETERMINAR ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN PULPA DE FRUTOS.
Rev. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, Vol. 25, N° 4. Octubre – diciembre,
2005. Pág. 726 - 732.
� LANDÁZURI A, Pablo y TIGRERO S, Juan. Stevia rebaudiana bertoni, una
planta medicinal. Escuela Politécnica del Ejército. Boletín Técnico. Guayaquil,
Ecuador. Septiembre, 2009.
� LÓPEZ L, Tránsito. El Té verde. Revista de Fitoterapia OFFARM Vol. 21, N° 5,
Mayo 2002. Pág. 129 -133.
� MAEDA R, PANTOJA L, YUYAMA L Y CHAAR J. Estabilidade de ácido
ascórbico e antocianinas em néctar de camu-camu (myrciaria dubia (H.B.K.) Mc
Vaugh). Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 27(2): 313-316. Abr.-Jun. 2007.
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genético de camu camu. Instituto de investigaciones de la amazonia peruana.
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46
� SALAS DE LA T. N y col. Proceso para obtener bebida nutracéutica a partir de
myrciaria dubia (camu camu), orientado a reducir efecto genotóxico en niños de
edad escolar. Rev. Per. Quim. Ing. Quim. Vol. 12, N° 2, 2009. Pág. 34-41.
� SHAHIDI, F.; F., NACZK. Food Phenolics: Sources, chemistry, effects and
applications. Technomic Publishing Company, Inc., Pensilvania, 1995.
� VON STASZEWSKI, Mariana. Impacto de la interacción entre polifenoles de té
verde y proteínas del lactosuero sobre las propiedades biológicas y funcionales
de las mezclas. Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Argentina, 2011.
� ZAPATA, Sergio. Posibilidades y potencialidad de la agroindustria en el Perú en
base a la biodiversidad y los bionegocios. Comité Biocomercio Perú. Lima-Perú
2002.
� ZAVALA, Lili. El Camu-camu. Boletín Nutricional. Fundación Universitaria
Iberoamericana. Área de Salud y Nutrición. Junio, 2010.
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ANEXO N°1
FICHA DE EVALUACIÓN SENSORIAL
Prueba Sensorial de Escala Hedónica de 7 puntos
Producto: Bebida a base de Té verde y Camu-camu endulzado parcialmente
con Stevia.
Código : ……………………….
Nombre: ……………………………………………….………. Fecha: ……………………..
Pruebe por favor las muestras en el orden que se le dan, e indique su nivel de agrado
con cada muestra, marcando el punto en la escala que mejor describe su sentir con el
código de la muestra. Por favor denos su razón para esta actitud.
Calificación Sabor Dulzor Acidez Color AG
Me disgusta extremadamente
Me disgusta mucho
Me disgusta ligeramente
Ni me gusta ni me disgusta
Me gusta un poco
Me gusta mucho
Me gusta extremadamente
Observaciones:
………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………
Muchas gracias!
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ANEXO N°2
NTS N° 071- MINSA / DIGESA- V.01
NORMA SANITARIA QUE ESTABLECE LOS CRITERIOS MICROBI OLOGICOS DE CALIDAD SANITARIA E INOCUIDAD PARA LOS ALIMENTOS Y BEBIDAS DE CONSUMO
HUMANO