Proyecto CGPI 20060807 Estudio del aislado Bacillus …sappi.ipn.mx/cgpi/archivos_anexo/20060807_3296.pdf · Menos probable sería la participación de ... su identidad mediante la

Proyecto CGPI 20060807

��

Estudio del aislado Bacillus sp DAF1 y

de su acción antibiótica.

Dr. Ramón Cruz Camarillo

Director del proyecto

ENCB-IPN

��

�� 1

��

ESTUDIO DEL AISLADO Bacillus subtilis DAF-1; SU PERFIL EXOENZIMÁTICO Y

SU ACCIÓN ANTIBIÓTICA

1.0 INTRODUCCION

1.1 Procedencia y características relevantes de la cepa DAF-1

En la Isla de Trinidad en Sudamérica, algunas personas utilizan de manera empírica las

hojas de una planta (Spondia mombin) para tratar las micosis dérmicas. El tratamiento consiste

en la frotación de las hojas sobre las zonas enfermas.

Como es frecuente en estos casos, no existen estudios sobre la efectividad de este

tratamiento, y se desconoce también cual pudiera ser el mecanismo de acción. De haber un

efecto antibiótico real, éste podría deberse a alguna sustancia vegetal que es liberada de las

hojas durante los frotamientos sobre la piel dañada. Menos probable sería la participación de

una flora microbiana con capacidad antifúngica, que se encuentre en el filoplano de las hojas

utilizadas, porque habría que aceptar que aún cuando su concentración celular es baja, es capaz

de producir y acumular una suficiente cantidad de antibiótico sobre la superficie de las hojas.

Por lo tanto, puede ser sólo un hecho casual que se haya aislado de una muestra de las

hojas de Spondia mombin una bacteria que secreta un antibiótico muy activo contra una cepa de

Trichophyton rubrum. El aislamiento de esta bacteria fue realizado en el laboratorio de los

doctores David Ammons y Joanne Rampersad, de la University of West Indies de la Isla de

Trinidad, en Sudamérica. Preliminarmente la bacteria fue denominada: Bacillus sp. DAF-1 (de

Dermatophyte Anti-Fungal ).

Resulta oportuno indicar que el aislamiento de bacterias productoras de antibióticos con

acción antifúngica, a partir de la superficie de hojas vegetales es un hecho conocido y reportado.

Por ejemplo, en la patente 20030186852 (USA), referente a la producción de formulados para el

control biológico de cultivos de interés agrícola, se menciona el uso de una cepa de Bacillus

subtilis que produce sustancias insecticidas, antifúngicas y antibacterianas. Esta cepa particular

fue aislada de hojas de una planta silvestre (Heins et al. 2003). La presencia de una flora

antimicótica en la superficie foliar, ha permitido suponer que se trata de un mecanismo natural

que permite proteger a las plantas del ataque de hongos fitopatógenos.

�� 2

��

Por todo lo anterior sería importante estudiar un microorganismo que ha sido aislado de

la superficie de una planta y con posible actividad antifúngica y sobre otro tipo de

microorganismos y que también pudiera producir algún otro compuesto de interés

biotecnológico.

Es así que se estableció un convenio extra-oficial de colaboración científica entre el

laboratorio de los Doctores David Ammons y Joanne Rampersad y el de Enzimas Microbianas

de la ENCB, basado en un interés mutuo en el área de la Biotecnología Microbiana. En el caso

concreto del aislado DAF-1 interesa conocer por una parte su identidad taxonómica y sus

características morfológicas y bioquímicas; y por otro, investigar su potencial como productor

de sustancias de interés económico como antibióticos y enzimas extracelulares.

Uno de los primeros pasos de la presente investigación fue identificar la cepa DAF-1,

para definir si este microorganismo pudiera ser patógeno. En el Laboratorio de Bacteriología

Médica de la ENCB, la cepa DAF-1 fue identificada como Bacillus subtilis por pruebas

bioquímicas API 50 CHB y posteriormente con apoyo del Dr. Jorge E. Ibarra del CIVESTAV

Irapuato se verificó su identidad mediante la secuenciación de genes en su 16S rDNA;

por las pruebas anteriores se tiene un 99 % de seguridad que la cepa en estudio es Bacillus

subtilis.

1.3 Generalidades sobre Bacillus subtilis

Bacillus subtilis es una bacteria Gram-positiva, aerobia facultativa. Es un bacilo unicelular

que rara vez se agrega en cadenas, y que produce una endospora resistente al calor y otros

agentes físicos y químicos. Además presenta motilidad mediante flagelos perítricos. Su pared

celular está compuesta de 75 % de fosfolípidos. Es una bacteria que puede crecer en un medio

mínimo sin requerir factores de crecimiento, por lo que se puede aislar de agua, suelo, aire y

residuos de plantas en descomposición. También se le ha aislado de suelos contaminados

(http://textbookofbacteriology.net/resantimicrobial.html).

B. subtilis puede producir gran cantidad y variedad de enzimas extracelulares que le

permiten degradar pectina y otros polisacáridos de origen vegetal como el almidón. También

�� 3

��

produce proteasas, DNasas, lipasas, y otras. Esto le permite degradar una gran variedad de

sustratos, lo que propicia su crecimiento en una diversidad de habitats. ��

Una de las características más importantes de B. subtilis es su elevada velocidad de

crecimiento, y también que puede secretar una gran cantidad de enzimas. Algunas veces éstas

pueden producirse en gran cantidad, tal es el caso de la celulasa extracelular producida por la

cepa B. subtilis KMS-635, la cual se produce a niveles de 20-25 g/L (Schallmey et al. 2004).

Por estas razones y por ser una bacteria con pocas exigencias nutricionales, inocua y de fácil

manejo, B. subtilis se ha utilizado en multiples procesos industriales. Las principales enzimas

producidas en el ámbito industrial por esta bacteria son amilasas, proteasas alcalinas (8.5 y

10.3-10.8), pectinasas, β-glucanasas, celulasas, y xilanasas. Además, esta especie es utilizada

también para producir nucleótidos, vitaminas como riboflavina y suplementos alimenticios

como el ácido poli-γ- glutámico ( Rao et al. 1998, Dauner et al 2002, Schallmey et al. 2004).

Es interesante resaltar que aunque dentro del género Bacillus se encuentran B.

anthracis, un microorganismo en extremo patógeno hacia el hombre y algunos animales, así

como B. cereus que causa gastroenteritis en humanos, B. subtilis es una especie libre de

exotoxinas y endotoxinas, por lo que la Food and Drug Administration (USA) le ha otorgado el

status de organismo GRAS, o generalmente seguro (generally regarded as safe) (Stein 2005).

Por otra parte es conveniente aclarar, que B. subtilis es la bacteria Gram-positiva, más

estudiada; en particular la cepa Marburg 168, de la cual se conoce su genoma completo desde

1997, encontrándose que al menos 4 % de los 4.2 Mbp de tal genoma codifican para proteínas

involucradas en la biosíntesis de metabolitos antimicrobianos (Kunst et al. 1997). Esto explica

porqué B. subtilis es uno de los microorganismos más utilizados en procesos biotecnológicos.

En años recientes la mayoría de los estudios referentes a esta especie se han enfocado a la

producción de proteínas heterologas, por ser posible controlar sus niveles de expresión y hacer

posible la sobreproducción de sustancias de interés mediante la modificación de zonas

promotoras en genes de expresión ( Westers et al. 2003).

Por lo anterior, no es de extrañar que una de las áreas de estudio con esta especie, y en

general con el género Bacillus sea la producción de antibióticos, la cual comenzó en los años

70s y continua vigente en nuestros días. Refiriéndose sólo a B. subtilis se han descrito

�� 4

��

alrededor de 24 antibióticos, los cuáles presentan gran diversidad estructural como se refiere a

continuación.

1.4 Generalidades en relación con los antibióticos del género Bacillus

En 1977 Katz y Demain publicaron una revisión de los compuestos con actividad

antibiótica producidos por el género Bacillus. Sus características más relevantes son:

� La mayoría tienen naturaleza peptídica y están compuestos enteramente de

aminoácidos, pero pueden poseer también residuos de ácidos grasos.

� Sus pesos moleculares son menores al de las proteínas, y van desde 270

(bacilisina) hasta 4,500 (licheniformina).

� Un mismo microorganismo puede producir familias de antibióticos, los cuales

pueden diferir en unos cuantos aminoácidos.

� La mayoría de los antibióticos peptídicos son de estructura cíclica. Unos pocos

son de estructura lineal (edeina, gramicidinas).

� Frecuentemente los antibióticos peptídicos contienen aminoácidos que son

únicos, y por tanto no se encuentran en las proteínas, tales como

D-aminoácidos, aminoácidos básicos (ornitina, ácido diaminobutirico),

β-aminoácidos, dehidroaminoácidos (dehidroalanina) y aminoácidos con

átomos de azufre (lantionina).

� Los antibióticos peptídicos de Bacillus no contienen residuos de ácidos

N-metilamino, como ocurre con los péptidos sintetizados por hongos y

actinomicetos.

� Los péptidos-antibióticos de Bacillus son generalmente resistentes a la hidrólisis

por peptidasas y proteasas de origen animal y de plantas.��

�� 5

��

Entre los principales productores de antibióticos del género Bacillus se encuentran: B.

brevis (gramicidina, tirotricina); B. cereus (cerexina, zwittermicina); B. circulans (circulina); B.

laterosporus ( laterosporina); B. licheniformis (bacitracina); B. Polymyxa (polimixina, colistina);

B. pumilus (pumulina); B. subtilis (bacitracina A, plipastatina, surfactina, bacilisina,

bacilomicina, fengicina, subtilina, micobacillina, etc.).(Ozcengiz, et al. 1990; Vollenbroich et

al. 1997; Tsuge et al. 1999, Yu –Shu et al. 2002).

1.5 Antibióticos producidos por B. subtilis

Los antibióticos producidos por esta bacteria se pueden clasificar en dos clases. Los de

origen ribosomal como: Tas A, subtilisina y sublacina, los cuales son sintetizados durante la

fase de crecimiento exponencial, y los de origen no ribosomal, que se producen en la fase

estacionaria, los cuales generalmente son oligopéptidos cíclicos que contienen una cadena de

ácidos grasos como ocurre en la surfactina, iturinas, bacilomicinas , fengicina y micosubtilina

(Feigneir et al. 1996, Stöver y Driks 1999).

1.5.1 Antibióticos de origen ribosomal

Stöver y Driks (1999) estudiaron la secreción de un agente proteico antibacteriano al

que llamaron Tas A, con peso molecular de 31 kDa, la cual era secretada al comienzo de la

esporulación, y luego incorporada dentro de las esporas. Sus estudios mostraron que esta

proteína era activa contra algunas bacterias de interés clínico como Enterobacter cloacae,

Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae, pero no contra E. aerogenes y Pseudomonas

aeruginosa. Por su parte Schnell et al. (1988), reportaron otro antibiótico de origen ribosomal,

producido por la cepa de B. subtilis ATCC 6633, al que se denominó subtilina lantionina. Esta

sustancia posee puentes meso-lantionina y 3-metil-lantionina. Además contiene aminoácidos

inusuales como deshidroalanina y deshidrobutirina. Se encontró que su estructura es muy

similar al de la nisina, un antibiótico usado como conservador en los alimentos. La subtilina es

�� 6

��

activa contra bacterias Gram-positivas como Propionibacterium acnes, Micrococcus lentus, y

algunas especies de los géneros Staphylococcus, Streptococcus y Clostridium.

1.5.2 Antibióticos de origen no ribosomal

Rogers et al. (1965) reportaron que la cepa de B. subtilis A14 producía durante la fase

estacionaria un compuesto antibacteriano activo contra S. aureus, al cual se denominó

bacilisina. Se encontró que se trataba de un dipéptido L-alaninil-[2,3–epoxiciclohexano-4]-L-

alanina). El mismo compuesto fue aislado en B. subtilis 168 por Hilton et al. en 1988.

Por otro lado, la surfactina es un antibiótico cicloheptapeptídico con una unión B-hidroxi

a grupos carboxilo e hidroxilo de un ácido graso. Este antibiótico lo produce no solamente B.

subtilis, sino también B. pumilus, B. licheniformis y B. amyloliquefasciens (Peypoux et al. 1999

y Stein 2005). Mucho se ha especulado sobre la función de este antibiótico, y estudios

recientes parecen indicar que está involucrado en la formación de biopelículas (Hofemeister et

al. 2004).

Aún cuando el estudio de los antibióticos de B. subtilis es un área cada vez más

compleja, dista mucho de haberse agotado. La búsqueda de antibióticos de origen microbiano

va en incremento, pues la mayoría de los antibióticos sintéticos causan efectos secundarios no

deseados.��

Como es lógico, un paso importante en el estudio de los antibióticos es establecer su

espectro de acción, su naturaleza química, y de ser posible llevar a cabo su purificación. A

continuación se presentan algunos casos.

1.6 Antibióticos de origen bacteriano. Su purificación y espectro de acción

Wakayama et al. (1984), realizaron la purificación parcial por cromatografía en capa fina

de un antibiótico producido por un aislado identificado tentativamente como Bacillus cereus

�� 7

��

SW . Encontraron que el péptido estaba compuesto por ácido aspártico, serina, ácido glutámico,

leucina, tirosina, prolina y un ácido desconocido, en una proporción 2:1:1:1:1:1:1. Este

antibiótico inhibía el crecimiento de hongos y levaduras, como Conidiobolus lamprauges,

Fusarium oxysporum, Aspergillus nidulans, Eurotium chevalieri, Mucor rouxianus, Penicillium

chrysogenum, Cryptococcus luteolus, Hansenula wingei y Saccharomyces cerevisiae. Sin

embargo no inhibía el crecimiento de las bacterias S. aureus, B. subtilis, E. coli, Serratia

marcescens y Proteus vulgaris.

Zheng et al. (1999), reportaron la purificación de la bacteriocina subtilosina, producida

por la cepa B. subtilis JH64.2. Este compuesto fue purificado mediante cromatografía de

intercambio iónico y por filtración en gel.

Por su parte Hagelin et al. (2004), reportaron una familia de 20 nuevos péptidos cíclicos

con actividad antibiótica, al que denominaron complejo maltacina, el cual es activo contra C.

albicans, T. Mentagrophytes, A. Fumigatus y S. aureus. La cepa utilizada fue aislada del suelo

e identificada como B. subtilis. La caracterización de los péptidos fue llevada a cabo mediante

espectrometría de masas y espectrofotometria UV-IR.

Ström et al. en 2002, encontraron dipéptidos cíclicos con actividad antifúngica, pero con

un espectro de acción pequeño, pues solamente eran activos contra unos cuantos hongos y

levaduras. Estos compuestos fueron producidos por Lactobacillus plantarum cepa MILAB 393.

Dicha cepa fue aislada de pasto y el ensayo de su actividad inhibitoria se realizó en placa. Los

microorganismos sensibles fueron A. Fumigatus, Fusarium sporotrichoides y la levadura

Kluyveromices marxianus. La purificación de los antibióticos se llevó a cabo por HPLC, y la

identificación de las estructuras mediante el uso de resonancia magnética nuclear (RMN),

espectrofotometria de masas (MS) y por cromatografiía de gases (CG). Los dipéptidos

encontrados fueron ciclo (L-Phe-L-Pro) y ciclo( L-Phe-trans-4-OH-L-Pro) y ácido fenil-láctico.

Un año después en 2003, Sjögren, & Magnusson reportaron que ácidos grasos 3-hidroxi,

secretados por otra bacteria ácido-láctica (Lactobacillus plantarum MiLAB14) presentaban

también actividad antifúngica. Los compuestos encontrados fueron ácido

3-(R)-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxi-5-cis dodecanoico y ácido 3-( R)-hidroxitetradecanoico

y la máxima producción de estos compuestos ocurría alrededor de las 38 h de incubación del

cultivo. Lo antes mencionado muestra la importancia de estudiar cómo se producen los

�� 8

��

compuestos antibióticos microbianos, que tan amplio es su espectro de acción, así como las

condiciones y el momento en que se producen. También da pistas sobre la metodología que se

emplea para su aislamiento, purificación y caracterización.

En suma, considerando que la cepa B. subtilis DAF-1, aislada del filoplano de las hojas

de Spondia mombin, presenta actividad contra una cepa de T. rubrum causante del pie de

atleta, se puede especular que pudiera actuar también contra otros hongos, y probablemente

contra diversas bacterias. Además, debe tener la capacidad de producir enzimas de interés

biotecnológico. La comprobación de estos supuestos constituye la base del presente estudio.

2. OBJETIVO

Estudiar el aislado B. subtilis DAF-1 en su capacidad para producir sustancias de

interés biotecnológico, como enzimas y antibióticos.

3. METAS

3.1 Estudiar el perfil enzimático extracelular de la cepa B. subtilis DAF-1.

3.2 Reunir una colección, lo más amplia posible, de bacterias y hongos de interés

médico, agrícola y biotecnológico, que sirva como blanco para estudiar el espectro

antibiótico de DAF-1.

3.3 Averiguar cualitativamente la capacidad antibiótica de B. subtilis DAF-1 sobre el

aservo microbiano reunido previamente.

3.4 Establecer un ensayo para evaluar cuantitativamente el efecto antibiótico de los

filtrados de DAF-1 sobre microorganismos de interés médico.

3.5 Investigar la cinética de producción del antibiótico usando microorganismos de

�� 9

��

interés médico como blanco.

3.6 Fraccionar por métodos cromatográficos o mediante extracción con solventes, el o los

antibióticos más activos.

3.7 Identificar la naturaleza química de las sustancias activas usando las técnicas

analíticas pertinentes.

4 JUSTIFICACIÓN

El estudio de la producción de sustancias de interés biotecnológico por el aislado

B. subtilis DAF-1 se justifica por las siguientes razones:

4.1 Bacillus sp. DAF-1, ya ha sido identificado por pruebas bioquímicas como

B. subtilis; esta especie es considerada como generalmente segura (GRAS), y por

tanto su empleo biotecnológico no ofrece riesgos a la salud.

4.2 Se tiene como antecedente que B. subtilis DAF-1 produce un antibiótico activo

contra una cepa del hongo dermatofito T. rubrum; por lo tanto podría actuar

también sobre otros microorganismos de interés médico.

4.3 Dado el incremento en las infecciones por hongos, resulta de interés el estudio de

nuevas cepas que eventualmente pudieran producir antimicóticos más eficaces.

4.4 Considerando que B. subtilis es una bacteria productora de diversos compuestos

de interés económico, puede especularse que B. subtilis DAF-1 debe producir

también gran cantidad de enzimas extracelulares. Algunas de estas podrían

tener importancia biotecnológica.

5. MATERIALES Y METODOS

5.1 Integración de la colección microbiana

�� 10

��

Para estudiar el aislado B. subtilis DAF-1, se procedió a conformar una colección

bacteriana y de hongos que abarcaran microorganismos de interés médico, agrícola y

biotecnológico. A continuación se mencionan los laboratorios que nos proporcionaron los

microorganismos.

Microorganismos de interés médico.- Laboratorio de Bacteriología Médica de la ENCB;

Laboratorio de Micología Médica de la Escuela de Medicina, Universidad Autónoma de San

Luis Potosí y el Laboratorio de Micología de la UAM-Xochimilco.

Microorganismos de interés agrícola.- Laboratorio de Fitopatología de la ENCB.

Microorganismos de interés biotecnológico.- Laboratorio de Micología de la UAM-Xochimilco

y el Laboratorio de Enzimas Microbianas de la ENCB.

5. 2. Conservación de los microorganismos

5.2.1 A corto plazo

Para la conservación a corto plazo de la mayoría de los microorganismos, se hicieron

resiembras en tubos inclinado de agar nutritivo (AN), y agar soya triptocaseina (TSA) para las

bacterias; y de agar extracto de papa (PDA) y agar dextrosa Sabourad (SDA) para los hongos.

Las bacterias y hongos levaduriformes se sembraron por estría; los hongos filamentosos por

picadura. Una vez que se realizó la siembra, se incubó a 28°C durante 24 h para las bacterias y

de 48 h a 120 h para los hongos. Una vez que el microorganismo creció, se conservó en

refrigeración a 4°C. Las resiembras se repitieron de la misma forma cada mes para bacterias, y

cada tres meses para hongos.

5. 2. 2 A largo plazo

La cepa B. subtilis DAF-1 se conservó a largo plazo por liofilización de la siguiente

manera. Primero se cultivó en matraz Erlenmeyer de 125 mL, conteniendo 25 mL de caldo

nutritivo, a 28 °C durante 24 h a 180 rpm. Posteriormente se sembró masivamente en placas

de agar nutritivo, y se colocaron tiras de papel filtro estéril. Se incubó a 28 °C durante 24 h.

Luego cada tira de papel filtro con crecimiento microbiano fue colocada en tubos de plástico

estériles y que previamente se habían sellado por calor en un de sus extremos. Los tubos con

las tiras de papel fueron transferidos a un frasco estéril, y sometidos a congelación en una

�� 11

��

mezcla de hielo seco y alcohol. Se procedió enseguida a liofilizar por un periodo aproximado

de 8 h. Después los tubos fueron sellados por calor. Finalmente se verificó la pureza del

liofilizado reactivando la cepa en un medio líquido de caldo nutritivo y haciendo luego una

resiembra en placa de agar nutritivo. Después de una incubación de 24 h, se verificó la pureza

colonial y microscópica.

5.3. Evaluación del perfil exoenzimático de DAF-1

5.3. 1 Ensayos en medio sólido

El medio base utilizado estaba compuesto por NaCl 0.250 g; KH2PO4 0.375 g, Na2CO3

0.375 g, MgSO4 0.275 g; extracto de levadura 1 g y casaminoácidos 1 g, para 1 L de agua. El

pH se ajustó a 6.5. Como fuente de carbono se añadieron los diferentes inductores (Ver tabla 1)

y se adicionó finalmente el agar bacteriológico al 1.5 %.

La inoculación se realizó mediante picadura usando palillos estériles, a partir de

cultivos frescos (24 h) crecidos a 28 °C en placas de agar nutritivo. Una vez realizada la

inoculación, se incubó a 28°C durante periodos desde 24 hasta 120 h, dependiendo de la

enzima a evaluar. La actividad se determinó mediante la relación diámetro del halo de hidrólisis

entre el diámetro de la colonia. En algunos casos fue necesario añadir reveladores para

observar mejor los halos de hidrólisis. La tabla 1 resume información concerniente a estas

pruebas, y las cepas utilizadas como testigos positivos.

�� 12

��

Tabla 1.- Enzimas evaluadas en medio sólido

ACTIVIDAD

EXOENZIMATICA

INDUCTOR

INDICADORES

Y/O AGENTE

REVELADOR

TESTIGO

POSITIVO

OBSERVACION

FUENTE

BIBLIOGRAFICA

Amilasas Almidón al 1 %

Solución de lugol al 1% (solución reveladora)

B. thuringiensis Halos de hidrólisis, sobre un fondo azul producido por la reacción del yodo (lugol) con el almidón remanente.

Dhawale et al. 1982.

Esterasas Tween 80 No requiere S. marcescens Halos granulosos de oleato de calcio formados alrededor de las colonias.

Lovell & Bibel, 1977.

Elastasas Elastina al 0.3 %

No requiere B. thuringiensis

Halos transparentes de hidrólisis de elastina.

Kaur et al. 1998, Janda 1986.

Fosfolipasas Yema de huevo al 3 %

No requiere B. thuringiensis

Halos opacos alrededor de las colonias producidas por las lecitinasas.

Crisope et al. 1976.

Lipasas Mantequilla Resarzurina al 5% (solución indicadora)

S. marcescens Halos de hidrólisis de color rosa producidos por el vire del indicador resarzurina.

Nava 1995.

Nucleasas (DNasas)

DNA al 0.03%

Azul de ortotoluidina al 0.0025 % (solución indicadora)

S. marcescens Halo de hidrólisis de color rosa alrededor de la colonia por el vire del indicador azul de ortotoluidina.

Lachica et al. 1971.

Pectinasas Pectina al 1 %

Cetrimida al 5 %

Erwinia carotovora

Halo transparente de hidrólisis alrededor de la colonia que es revelado al adicionar la solución de Cetrimida.

Hubbel et al. 1978.

Proteasas Caseina al 2 %

HgCl2 al 1% S. marcescens Halos transparentes alrededor de la colonia por la digestión de caseína.

Rojas Avelizapa et al. 1999.

Quitinasas Quitina coloidal al 10 %

No requiere S. marcescens Halos transparentes alrededor de la colonia por la hidrólisis de la quitina.

Rojas Avelizapa et al. 1999.

Quitosanasas Quitosana coloidal al 2.5 %

No requiere B. thuringiensis Halos transparentes alrededor de la colonia por hidrólisis de la quitosana.

Sánchez Pérez, 2000.

�� 13

��

5.3.2 Ensayos en medio líquido

Las actividades de quitinasas, celulasas, queratinasas y colagenasas se evaluaron

mediante técnicas en cultivo sumergido, utilizando 5 mL del medio sintético basal ya descrito,

adicionando los diferentes inductores que se presentan en la tabla 2. Los cultivos fueron

incubados a 28°C, 180 rpm, durante periodos de 24 h hasta 120 h.

Algunas pruebas se basan en medir la absorbancia a 595 nm, del colorante azul

brillante de remazol liberado de los diferentes sustratos teñidos, los cuales son solubilizados por

las correspondientes actividades enzimáticas. Como testigos positivos se inocularon matraces

con cepas productoras patrón, y como testigos negativos se utilizaron matraces sin inocular.

Sólo en el caso de las quitosanasas se utilizó como inductor un sustrato sin teñir

(quitosana). La enzima secretada al medio degrada el polímero hasta pequeños oligosacáridos,

los cuales tienen capacidad reductora, y por lo mismo pueden ser evaluados mediante la técnica

de Miller con ácido 3,5 dinitrosalicílico. El compuesto anaranjado formado se evaluó a 535 nm

( ver tabla 2).

Tabla 2.- Enzimas evaluadas en medio líquido.

ACTIVIDAD EXOENZIMATICA

INDUCTOR � max TESTIGO POSITIVO FUENTE BIBLIOGRAFICA

Quitinasas

Quitina coloidal al 2% (teñida con azul brillante de remazol)

595 nm

S. marcescens

Gómez Ramírez, 1999.

Queratinasas

Lana al 0.4 % (teñida con azul brillante de remazol).

595 nm

B. thuringiensis

Cedillo Robles, 1998.

Celulasas

Celulosa coloidal al 5 % (teñida con azul brillante de remazol).

595 nm

Trichoderma viridae

Poincelot and Day, 1972.

Colagenasas Colágeno al 0.4 % (teñido con azul brillante de remazol)

595 nm

S. marcescens

O´Brien & Davis

et al. 1982

Quitosanasas

Quitosana coloidal al 2.5 %

535 nm

B. thuringiensis

Sánchez-Pérez, 2003.

�� 14

��

5.4 Determinación del espectro antibacteriano de la cepa DAF-1

5.4.1 Preparación de las “placas césped”

Las bacterias “blanco” a estudiar se inocularon por asada en matraces Erlenmeyer de

125mL, conteniendo 25 mL de caldo nutritivo, y se incubaron a 28°C, durante 18 h a 180 rpm.

Posteriormente se realizaron 3 pases sucesivos, inoculando cada vez 0.1 mL de suspensión

bacteriana fresca en 25 mL de caldo nutritivo. Del último cultivo se tomó una alícuota de 0.5

mL y se mezclo suavemente con 50 mL de agar nutritivo fundido y mantenido a 50 °C.

Finalmente se adicionaron 4 mL de esta mezcla sobre placas conteniendo 21 mL de agar

nutritivo ya solidificado.

5.4.2 Ensayo del efecto antibacteriano

Las placas césped se inocularon en la parte central por picadura con la cepa

DAF-1, usando palillos estériles. El inóculo de DAF-1 provenía de placas de agar nutritivo

sembradas por estría cruzada, e incubadas a 28°C, durante 24 h. Las placas “césped” inoculadas

se incubaron a 28 °C durante 24 a 48 h. La acción antibacteriana se apreció por los halos de

inhibición formados alrededor de la cepa DAF-1.

5.5. Determinación del efecto antifúngico de la cepa DAF-1

Para la determinación de la actividad antifúngica en hongos levaduriformes se

utilizó la metodología de las “placas césped”, en agar dextrosa Sabourad.

Para evaluar la actividad antifúngica contra hongos filamentosos, cada uno de

éstos se sembró en el centro de una placa de agar papa dextrosa y se incubó a 28°C, por

periodos de 24 h o 48 h. Posteriormente se hicieron cuatro inoculaciones simétricas por

picadura de la cepa DAF-1 en torno a la colonia fúngica y se continuó incubando bajo las

mismas condiciones por periodos de hasta 2 semanas. La acción antifúngica se manifestó como

halos de inhibición alrededor de la cepa DAF-1.

�� 15

��

5.6 Ensayo de la acción antibiótica usando un extracto libre de células de DAF-1

5.6.1 Cinética de crecimiento y producción de compuestos antibacterianos de DAF-1

B. subtilis DAF-1 se cultivó en matraces de 125 mL conteniendo 25 mL de caldo

nutritivo. La incubación se llevó a cabo a 28°C, 180 rpm. Cada 3 h se colectaron muestras en

las primeras 24 h de incubación. Posteriormente se tomaron muestras cada 6 h hasta

cumplirse las 222 h que duró el estudio. Utilizando una alícuota de 0.1 mL de las muestras

colectadas se determinó la concentración bacteriana por cuenta viable. El resto de la muestra se

centrifugó a 6000 rpm durante 20 minutos y el sobrenadante se filtró por membranas Millipore

(Millex, con tamaño de poro de 0.22 µm, en condiciones de esterilidad. Los filtrados obtenidos

se sometieron a un tratamiento térmico a ebullición durante 10 minutos para eliminar la acción

de enzimas extracelulares, y finalmente se conservaron en congelación.

5.6.2 Preparación del filtrado libre de células.

Inicialmente se evaluó la acción antibiótica utilizando los filtrados libres de células. Sin

embargo, para obtener efectos más claros, dichos filtrados se concentraron 10 veces mediante

liofilización. Posteriormente se impregnaron discos de papel filtro en condiciones de esterilidad,

con 200 µL del filtrado concentrado.

5.6. 3. Ensayo de la acción antibiótica contra cepas tipo.

Para ensayar el efecto antibiótico del filtrado libre de células ya concentrado, se

eligieron los siguientes microorganismos blanco. Como representativa de bacteria Gram (+) se

escogió a Staphylococcus aureus ATCC 25923. Como representativa de bacteria Gram (-) se

utilizó Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Como hongo levaduriforme se escogió

Candida albicans EH-155.

Se prepararon las “placas césped” como se mencionó anteriormente, y se colocaron

radialmente varios círculos de papel filtro impregnados con 200 µL del extracto concentrado.

Las placas se incubaron a 28°C, durante un lapso de 24 a 48 h y se midieron los halos de

inhibición.

�� 16

��

6. RESULTADOS Y DISCUSION 6.1 Perfil exoenzimático 6.1.1 Evaluación en medio sólido

La cepa de interés, Bacillus subtilis DAF-1, fue proporcionada por los Dres. David

Ammons y Joanne Rampersad, de la University of West Indies de la Isla de Trinidad en

Sudamérica. Los datos concernientes a su perfil enzimático utilizando ensayos en placa, se

muestran en la Tabla 3. En cada caso la actividad de la cepa problema se compara con la de un

testigo positivo, generalmente un buen productor de la enzima en cuestión.

Tabla 3. Evaluación mediante ensayos en placa de algunas enzimas extracelulares de Bacillus subtilis DAF-1

Enzima Cepas utilizadas � colonia (mm)

� halo de hidrólisis (mm)

Relación de diámetros

Enzimas proteolíticas Proteasa Testigo (+) Sm WF 5 24 4.8

DAF-1 10 32 3.2 Elastasa Testigo (+) Bt-NGRA 8 19 2.38

DAF-1 8 13 1.62 Enzimas que degradan lípidos o sustancias similares

Lipasa Testigo (+) SmWF 2 5 2.5

DAF-1 1 3 3 Fosfolipasa Testigo (+) Bt-NGRA 8 21 2.62

DAF-1 11 13 1.18 Esterasa Testigo (+) SmWF 2 7 3.5

DAF-1 6 14 2.33 Enzimas que degradan polímeros

Amilasa Testigo (+) Bt-HD1 12 16 1.33

DAF-1 7 12 1.71 Pectinasa Testigo (+)

Erwinia carotovora 3 9 3

DAF-1 3 12 4 Quitinasa Testigo (+) SmWF 11 22 2.2

DAF-1 3 NSD - Quitosanasa Testigo (+) Bt-132 10 14 1.4

DAF-1 2 NSD - Nucleasa (DNasa) Testigo (+) SmWF 4 22 55

DAF-1 0.5 5 4 NSD.- No se observó halo de actividad enzimática.

�� 17

��

6.1.2. Evaluaciones en cultivo sumergido.

Los resultados de las cinéticas de producción de colagenasa, queratinasa, quitinasa y

celulasa, que se realizaron en cultivo sumergido, pusieron de manifiesto que la cepa DAF-1

llegó a producir mayores niveles de queratinasa y colagenasa que las cepas patrón. Como es

habitual en este tipo de cinéticas, los trazos fueron completamente distintos e individuales para

cada cepa utilizada.

También se hizo un estudio de la producción de celulasas en cultivo sumergido,

utilizando celulasa coloidal teñida con azul de Coomassie. En este estudio se utilizó el hongo

celulolítico Trichoderma viridae como testigo positivo. Al cabo de 96 h, las lecturas a 595nm

fueron 1.3 para el testigo y 0.203 para DAF-1, lo que permite, suponer que esté último produce

celulasas en baja proporción. Cabe agregar que en los ensayos en placa, los resultados fueron

dudosos tanto para quitinasa como para celulasa, pero al realizar las pruebas en cultivo

sumergido en presencia de los sustratos teñidos correspondientes, se encontró que DAF-1

producía bajos niveles de quitinasa y celulasa.

Si se examinan globalmente los datos referentes a la producción de enzimas

extracelulares por B subtilis DAF-1, cabría hacer los siguientes comentarios. DAF-1 produjo

niveles elevados de la mayoría de las enzimas ensayadas, por ejemplo amilasa, pectinasa,

proteasa (caseinasa), elastasa, colagenasa, queratinasa, lipasa, fosfolipasa y esterasa. En cambio

produjo modestas cantidades de quitinasa, DNasa y celulasa.

La alta capacidad amilolítica de DAF-1 no es sorprendente, pues la producción

industrial de este tipo de enzimas se lleva a cabo con cepas debidamente seleccionadas de B.

subtilis. Lo mismo ocurre para la producción de proteasas de muy diversos tipos. Una prueba

de la capacidad proteolítica de DAF-1, es que produjo enzimas capaces de hidrolizar

substancias proteicas tan diversas como caseína, queratina, elastina y colágena. Algo semejante

ocurrió al estudiar las lipasas, pues DAF-1 produjo enzimas extracelulares capaces de hidrolizar

lípidos típicos, como los presentes en la mantequilla, o lípidos más complejos como las

lecitinas presentes en la yema de huevo, por las fosfolipasas. También produjo esterasas

capaces de hidrolizar sustratos semejantes a los lípidos, por tener ácido oleico o esteárico,

��

�� 18

��

unido por un enlace ester a una molécula más compleja como ocurre en el detergente Tween

80.

Adicionalmente, otra enzima producida abundantemente por DAF-1 fue la pectinasa.

Esta enzima se considera típica de B. subtilis, y es una enzima muy utilizada en diversos

procesos industriales. Cabría añadir por último, que la cepa en estudio B. subtilis DAF-1

produjo niveles bajos de quitinasa y celulasa, pero nada de quitosanasa, lo cuál es típico de

diversas especies del género Bacillus. Lo mismo ocurrió con la producción de DNasas.

En suma, B. subtilis DAF-1 es una bacteria interesante en cuanto a su perfil enzimático

extracelular. Sería conveniente hacer un estudio más amplio al respecto, con el objeto de

encontrar enzimas novedosas que pudieran ser de interés biotecnológico. Una que pudiera ser

interesante es la queratinasa, para aprovechar biotecnológicamente algunos desechos

industriales como las plumas de aves, que en enormes cantidades se producen en los rastros

respectivos.

La cepa DAF-1 presenta una mayor actividad enzimática que las cepas testigo, en las

pruebas de proteasas, elastasas, pectinasas, colagenasas y queratinasas. Esto indica que sería

importante realizar estudios posteriores para tener mayor información sobre estas actividades

enzimáticas, que podrían ser de interés biotecnológico.

Cabe resaltar que B. subtilis por su capacidad de producir enzimas, es utilizado también

para la producción de saborizantes. Además por sobrevivir en un amplio intervalo de pH

alcalino (6.5 - 8.5) es utilizada también para el tratamiento de aguas residuales que contienen

materiales de origen orgánico, junto con otras bacterias del mismo género como B.

licheniformis. De este modo se logra la disminución de carbohidratos, proteínas, grasas, aceites

e incluso papel. Por otro lado, B. subtilis también es empleado como ingrediente en alimentos

para animales, debido a su status de bacteria GRAS, y en humanos se ha utilizando en la

industria panadera, y como ingrediente de algunas comidas y bebidas (©2006 BIO-CAT INC).

�� 19

��

6.2 Ensayo de la acción antibiótica de DAF-1

6.2.1 Integración de la colección microbiana, para realizar los ensayos

6.2.1.1. Colección bacteriana

Se conoce que las bacterias de la especie B. subtilis son capaces de secretar una gran

variedad de sustancias antibióticas. Para conocer el espectro de acción de los antibióticos

producidos por DAF-1, se procedió a conformar una colección microbiana. La tabla 4 muestra

la colección bacteriana reunida. Dentro de esta colección se incluyeron principalmente

bacterias de interés médico.

Tabla 4. Colección bacteriana reunida para la presente investigación

Microorganismo / cepa Forma Gram Área de interés Característica especial Procedencia

Aeromonas hydrophila Sch3

Bacilo

-

Médico sanitario

Contaminantes en alimentos marinos y agua.

LBM

Aeromonas hydrophila 839T

Bacilo

-

Médico sanitario


LBM

Aeromonas hydrophila 54W

Bacilo

-

Médico sanitario


LBM

Aeromonas hydrophila 56 W

Bacilo

-

Médico sanitario


LBM

Aeromonas hydrophila 65 W

Bacilo

-

M édico sanitario


LBM

Bacillus thuringiensis HD1

Bacilo

+

Biotecnológico

Producción de cristales insecticidas

LEM

Bacillus thuringiensis NGRA

Bacilo

+

Biotecnológico

Producción de cristales insecticidas.

LEM

Erwinia carotovora

Bacilo

-

Fitopatógeno

Produce pectinasas, es responsable de la pudrición blanda de la papa.

LEM

Escherichia coli 0536 Bacilo

-

Médico

Causa diarrea en niños.

LBM

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Bacilo

-

Médico

Puede invadir y causar infecciones de diversa gravedad.

LBM

Salmonella typhi 6539

Bacilo

-

Médico

Puede producir fiebre tifoidea si presenta el serotipo específico

LBM

Salmonella typhimuriumm 14028

Bacilo

-

Médico sanitario

Aislado de toxiinfecciones alimentarias.

LBM

Serratia marcescens WF

Bacilo

-

Médico�

Patógeno oportunista, cepa no pigmentada.

LBM

�� 20

��

Serratia marcescens NIMA

Bacilo

-

Médico��

Patógeno oportunista, cepa no pigmentada.

LEM

Serratia marcescens WTR

Bacilo

-

Médico�

Origen hospitalario. Patógeno oportunista, cepa no pigmentada.

LEM

Staphylococcus aureus ATCC 25923

coco

+

Médico�� Presenta varios factores de virulencia como: proteína A, hemolisinas, exotóxinas. Resistencia a agentes antimicrobianos.

LBM

LBM.- Laboratorio de Bacteriología Médica de la ENCB. LEM .- Laboratorio de Enzimas Microbianas de la ENCB.

Tomado de (http://textbookofbacteriology.net/staph.html)

Las bacterias Gram (-), poseen una pared celular compuesta de lipopolisacáridos (LPS),

la cual les confiere ciertas características patógenicas. Dentro de este grupo se encuentran las

enterobacterias, que tienen importancia médica por producir infecciones nosocomiales y

septicemia, En la tabla 4 se resumen algunas características relevantes de las diferentes bacterias

incluidas como blanco para probar los antibióticos de DAF-1. Con respecto a las bacterias Gram

(+), solo se trabajó con S. aureus Este microorganismo es importante en el área médica ya que

puede producir infecciones con inflamación en las heridas, que pueden llegar a ser de tipo

sistémico y ocasionar la muerte; esto ocurre, cuando la infección no es correctamente tratada y

el microorganismo llega al torrente sanguíneo (http://textbookofbacteriology.net/staph.html).

6.2.1.2 Colección de hongos filamentosos y levaduriformes.

Con respecto a la colección fúngica reunida, está se presenta en la tabla 5. Se incluyen

principalmente tres áreas de interés:médica, fitopatológica y entomopatogenica.

�� 21

��

Tabla 5. Colección de hongos reunida para la presente investigación

Nombre Clase Pared celular Área de interés Procedencia Hongos filamentosos

Alternaria sp. Hifomiceto Quitina-β-glucano Entomopatógeno CIEP Aspergillus flavus Hifomiceto Quitina-β-glucano�� Patógeno oportunista,

productor de micotoxinas entomopatógeno, fitopatógeno y zoopatógeno.

LEM

Aspergillus flavus sp. Hifomiceto Quitina-β-glucano�� Patógeno oportunista, productor de micotoxinas, entomopatógeno, fitopatógeno y zoopatógeno.

LF

Aspergillus fumigatus Hifomiceto Quitina-β-glucano�� Patógeno oportunista. LEM Aspergillus niger H-179 Hifomiceto Quitina-β-glucano�� Patógeno oportunista.

Biotécnológico LEM

Aspergillus niger Hifomiceto Quitina-β-glucano�� Patógeno oportunista. Biotécnológico.

CIEP

Curvularia sp. Quitina-β-glucano�� Produce queratitis ocular. CIEP Fusarium sp. Hifomiceto Quitina-β-glucano�� Fitopatógeno LF Helmintosporium sp. Quitina-β-glucano�� Fitopatógeno LF Metharizium anisopliae var. Acridum EH-500

Quitina-β-glucano�� Entomopatógeno Fitopatógeno.

LM

Metharizium anisopliae 4681 Quitina-β-glucano�� Entomopatógeno LM Metharizium anisopliae var. Acridum EH-500

Quitina-β-glucano�� Entomopatógeno. LM

Mucor rouxii 080503 Zigomiceto Quitina- quitosana Produce mucomicosis gástrica. Biotecnológico.

LEM

Paecilomycyces fumosoroseus EH-452

Quitina-β-glucano Entomopatógeno, bioinsecticida. LM

Paecilomyces fumosoroseus EH-506

Quitina-β-glucano�� Entomopatógeno, bioinsecticida. LM

Paecilomyces fumosoroseus EH-511

Quitina-β-glucano�� Entomopatógeno, bioinsecticida. LM

Penicillium sp. Euascomiceto Quitina-β-glucano�� Patógeno oportunista. Biotécnológico.

LF

Trichophyton rubrum Hifomiceto Quitina-β-glucano�� Patógeno oportunista. Biotécnológico.

LM

Trichoderma viridae Euascomiceto Quitina-β-glucano�� Celulolítico, antagonico de fitopatógenos. LEM Verticillium lecanii EH-457 Quitina-β-glucano�� Fitopatógeno LM Hongos levaduriformes Verticillium lecanii EH-457 Quitina-β-glucano Entomopatógeno LM Candida albicans EH-155 Blastomiceto manano-β-glucano Patógeno oportunista LM Candida albicans Blastomiceto manano-β-glucano Médico CIEP Cryptococcus neoformans basidiomiceto Quitina-β-glucano Médico CIEP

CIEP.- Facultad de Ciencias Químicas. Laboratorio de Micología Médica de la Escuela de Medicina, Universidad Autónoma de San Luís Potosí LEM .- Laboratorio de Enzimas Microbianas de la ENCB. LF.- Laboratorio de Fitopatoligía de la ENCB. LM.- Laboratorio de micología de la UAM-Xochimilco.��

�� 22

��

6.2.2 Espectro antibacteriano de la cepa DAF-1

De la colección utilizada en este punto, se consideraron como representativas dos

bacteria, una Gram (+) y otra Gram (-). La primera fue Staphylococcus aureus ATCC2593 y la

otra Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; ambas proporcionadas por el laboratorio de

Bacteriología Médica de la ENCB. La figura 1 muestra los halos de inhibición alrededor de la

colonia DAF-1, sembrada por picadura al centro de una placa “césped” preparada con las

bacterias blanco. Puede observarse que en ambos casos hubo inhibición del crecimiento.

Figura 1 .- Acercamientos fotográficos que muestran los halos de inhibición del crecimiento de las bacterias representativas de interés médico. S. aureus (A) y P. aeuruginosa (B). Las fotografías fueron tomadas después de una incubación de 24 h a 28 °C.

�� A

Bacterias representativas Gram ( + ) Gram ( - ) Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923 ATCC 27853

�� B

�� 23

��

Cuando se realizó el espectro de acción antibiótica de DAF-1 sobre diferentes enterobacterias

de interés médico, se encontró que todas las bacterias utilizadas en este punto presentaron efecto

inhibitorio alrededor de la colonia DAF-1.

De los resultados referidos puede concluirse que el espectro de acción antibacteriana de DAF-1

es muy amplio, pues inhibió el crecimiento de todos los microorganismos utilizados. Los halos de

inhibición fueron evidentes y bien definidos alrededor de la colonia de DAF-1.

6.2.3 Espectro antifúngico de la cepa DAF-1

Aproximadamente la mitad de los hongos filamentosos en estudio fueron sensibles a los

antibióticos producidos por la cepa B. subtilis DAF-1. Estos fueron: Alternaria sp.; Aspergillus

niger (2 cepas); Curvularia sp.; Fusarium sp.; Helmintosporium sp.; Mucor rouxii;

Trichoderma viridae y Paecilomyces fumosoroseus (3 cepas).

Los hongos filamentosos que no tuvieron sensibilidad antifúngica fueron: Aspergillus

flavus sp. (2 cepas), Aspergillus fumigatus, Metharizium anisopliae (3 cepas), Trichophyton

rubrum y Verticillium lecanii. La cepa T. rubrum no presentó inhibición en su crecimiento

hifal, este dato es distinto al observado previamente en ensayos realizados en la isla de Trinidad,

lo que sugiere que la sensibilidad entre cepas puede ser distinta. No es de extrañar que algunas

cepas adquieran la capacidad de resistencia a bacterias productoras de antibióticos. Un ejemplo

son los estudios realizados por Lee et al. (2005), quienes encontraron que ciertos hongos

entomopatógenos como, Metarhizium anisopliae, Metarhizium flavoviride, Paecilomyces

fumosoroseus, Paecilomyces tenuipes y Verticillium lecanii eran capaces de producir

sustancias que les conferían resistencia a bacterias productoras de antibióticos como B. subtilis.

Con respecto a los hongos levaduriformes ensayados, todas las cepas presentaron

inhibición de su crecimiento (ver figura 2). Esto es importante, puesto que en los últimos años se

ha encontrado que C. albicans se encuentra cada vez más frecuentemente en casos clínicos de

candidiasis, principalmente, como un patógeno oportunista. Cryptococcus neoformans en

cambio es patógeno primario involucrado en micosis sistémicas de pulmones, piel, huesos,

visceras, y sistema nervioso central.

�� 24

��

Hasta este momento tenemos que B. subtilis DAF-1 es una bacteria que presenta un

amplio espectro de acción antifúngica, principalmente con los hongos levaduriformes. En la

figura 2 se pueden apreciar que los halos de inhibición alrededor de la colonia DAF-1, se

encuentran bien definidos, y hasta se podría considerar que el tamaño de éstos halos son

constantes en las tres cepas estudiadas. Los resultados obtenidos sugieren que C. Albicans y C.

neoformans serían buenos candidatos para probar los productos que se obtengan de las

cinéticas de producción del compuesto o los compuestos antibióticos. Si comparamos los

diámetros de halos de inhibición obtenidos en el espectro antibacteriano son de menor tamaño

que los obtenidos en los hongos levaduriformes. Siendo así, que sería recomendable elegir a

los hongos levaduriformes como microorganismos blanco para los próximos experimentos. Con

respecto a los hongos filamentosos, se puede afirmar que existe efecto inhibitorio, sin embargo

este efecto es parcial y de diferente proporción para los diferentes hongos. Aproximadamente

solo el 50 % de los hongos filamentosos fueron inhibidos en su crecimiento hifal.

Figura 2.- Fotografías que muestran los halos de inhibición del crecimiento de algunos hongos levaduriformes.

Las placas conteniendo la levadura se trabajaron de la misma forma que el césped bacteriano. El medio de cultivo

fue SDA. B. subtilis DAF-1 se inoculó al centro de una placa donde previamente se había sembrado en forma

masiva (“césped”) el microorganismo en estudio. Las fotografías fueron tomadas después de una incubación de 24 h

a 28 °C.

�� 25

��

6.3 Curva de crecimiento y producción del antibiótico por DAF-1

La cinética de crecimiento y producción del antibiótico, se llevó a cabo en matraces

Erlenmeyer de 250 mL conteniendo 25 mL de caldo nutritivo. Las muestras se tomaron cada

tres horas, las primeras 24 h y posteriormente en su mayoría se tomaron muestras cada 3 h. Se

realizó la cuenta viable, el resto de la muestra se centrífugó y se filtró por esterilización en

membrana de 0.22 µm, posteriormente se le dio un tratamiento térmico a ebullición durante 10

minutos y finalmente se conservó en congelación. Se realizaron 2 cinéticas de producción. En

la primera cinética tuvo una duración de 216 h y se observó que la fase logarítmica era de tan

solo 15 h; una vez en la fase estacionaria se observaron fluctuaciones en la población

microbiana (ver figura 3), por lo que fue necesario realizar una segunda cinética de mayor

duración (222 h) y con mayor cantidad de muestras. En los tiempos comprendidos durante la

�� Figura 3.- Cinética de crecimiento y producción de antibiótico por DAF.-1

�� 26

��

fase estacionaria y que presentaron un incremento en la población microbiana, fue necesario

tomar las muestras cada 3 h, antes y después de esos puntos. La segunda cinética fue similar

a la primera y se consideró que los resultados de ambas cinéticas son representativos. Las

fluctuaciones en la población microbiana durante la fase estacionaria pueden deberse a la

naturaleza de B. subtilis DAF-1, debido a que se trata de un microorganismo esporulado. Este

comportamiento es semejante al reportado por Gómez Ramírez (1999) para Bacillus

thuringiensis (Bt- LIRA), otra bacteria formadora de esporas.

6.4 Determinación de los tiempos de obtención de antibióticos sobre cepas tipo.

Para la determinación de los tiempos en que se produce el antibiótico, era necesario

diseñar un método cuantitativo o semicuantitativo para evaluar su efecto inhibitorio. En primera

instancia se realizó un método espectrofotométrico, el inóculo provino de una suspensión de

crecimiento microbiano en 25 mL de caldo nutritivo a 18 h, 28 °C y 180 rpm. Como

anteriormente se mencionó, las cepas elegidas como representativas fueron S. aureus, P.

aeruginosa y C. albicans. De las diferentes suspensiones microbianas se inocularon alícuotas

de 0.1 ml en 5 mL de caldo nutritivo contenidos en tubos de ensaye estériles, una vez

inoculados con los microorganismos blanco, se procedió a adicionar diferentes volúmenes de

los extractos tratados y obtenidos de la cinética de crecimiento y producción de antibióticos. Se

eligieron 2 volumenes, uno de 0.5 mL y otro de 1 mL; posteriormente se dejaron incubando a

28 °C, durante 24 h y en condiciones estáticas. En el experimento se incluyó un testigo

negativo, que consistió en 5 mL de caldo nutritivo sin inocular; un testigo positivo que consistió

en un tubo inoculado con el microorganismo, pero sin el extracto tratado; en vez de éste, se

adicionó agua estéril. Posteriormente se utilizó el método turbidimétrico a 600 nm. Los

resultados obtenidos (no mostrados) no fueron concluyentes. También se consideró que los

volúmenes de extracto adicionado eran muy grandes en proporción al volumen total. Por lo que

fue necesario encontrar otro método más conveniente.

El procedimiento alternativo consistió en concentrar previamente el extracto a ensayar.

Esto se realizó mediante liofilización, hasta concentración de 10 veces.

�� 27

��

Para este experimento se utilizaron 200 µl del concentrado, que se impregnaron en

discos estériles de papel filtro. Tales discos con extracto concentrado se colocaron sobre

placas “césped” de los microorganismos blanco y se incubaron 24 y 48 h a 28 °C.

. Los halos de inhibición obtenidos en las diferentes cepas tipo de C. albicans fueron

relacionados con la cinética de crecimiento de DAF-1 y en ellas se observó que existe diferente

sensibilidad en cada uno de los microorganismo. Esto sugiere que pudieran producirse

diferentes antibióticos en los diferentes tiempos.

Para S. aureus se observaron 3 intervalos pequeños con baja inhibición; una al inicio de

la fase logarítmica, y 2 comenzando la fase estacionaria. Posteriormente la inhibición

desapareció y se observó nuevamente inhibición alrededor 200 h y hasta el final de la cinética (

216 h). Este mismo comportamiento se observó con las otras cepas utilizadas. Para P.

aeruginosa se observaron 3 intervalos de inhibición, el primero comenzó a las 15 h (comienzo

de la fase estacionaria) y finalizó alrededor de las 56 h, cuando ocurría una ligera disminución

de la población de DAF- 1. El segundo intervalo inhibitorio comenzó a las 126 h y desapareció

a las 144 h. El tercer intervalo de inhibición comenzó a las 210 h, aunque desapareció

rápidamente.

Finalmente se observó que los extractos concentrados de DAF-1 tuvieron efecto

inhibitorio sobre C. albicans, hasta las 78 h. Su efecto se hace más evidente conforme pasa el

tiempo. En conclusión, los perfiles de inhibición fueron distintos según el microorganismo

utilizado para el ensayo, lo que sugiere que pudieran estarse formando distintos antibióticos.

�� 28

��

777... BBBIIIBBBLLLIIIOOOGGGRRRAAAFFFÍÍÍAAA

1. Cedillo Robles, M. S. 1998. Implementación de un método espectrofotometrico

para evaluaciones de queratinasas.. Tesis profesional- LEM-ENCB

2. © BIO-CAT INC, 2006. Empresa Líder en la Industria de las enzimas.

http://espanol.bio-cat.com/products.php?sortby=type&type_id=11

3. Crisope, G. L., Fox, C. W & Marshall, R.T. 1976. Lecihin agar for detection of

microbial phospolipases. Appl. Environ. Microbiol. 31: 784-786.

4. Dauner, M., Soneregger, M., Szyperski, T., Wuethrich, K., Omán, H., Sauer, U. &

Baily, J. E., 2002. Intracellular carbon fluxes in rivoflavin- producing Bacillus

subtilis during growth on two- carbon substrates mixtures. Appl. Environ.

Microbiol. 68:1760-1771.

�� Figura 4.- Relación de la inhibición antibiótica de los productos obtenidos de la cepa B. subtilis DAF- 1 sobre C. albicans

Cinética de crecimiento y producción de antibiótico de DAF 1

Halo de inhibición en C. albicans.

�� 29

��

5. Dhawale, M. R., Wilson, J. J., Khachatourians, G. G. & Ingledew W. M. 1982.

Improved method for detection of starch hydrolysis. Appl. Environ. Microbiol.

44:747-750.

6. Duitman, E. H., Hamoen, L. W., Rembold, M., Venema, G., Saenger, S. H.,

Wolfram., Bernhard, F., Reinhardt, R., Schmidt, M., Ullrich, C., Stwein, T.,

Leenders, F. & Vater, J. 1999 The mycosubtulin synthetase of Bacillus subtilis

ATCC6633: A multifunctional hybrid between a peptide synthetase, an amino

transferase, and a fatty acid synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 13294-13299.

7. Feignier, C., Besson, F. & Michel, G. 1996. Characterization of iturin synthetase in

the wild-type Bacillus subtilis strain producing iturin and in an iturin deficient

mutant. FEMS Microbiology 136:117-122

8. Gómez Ramírez, M. 1999. Las quitinasas de Bacillus thuringiensis cepa LIRA.

Tesis profesional. LEM-ENCB-IPN.

9. Hagelin, G., Oulie, I., Raknes, Ä., Undheim, K. & Clausen, O. 2004. Preparative

high-performance liquid chromatographic separation and analysis of the maltacine

complex- a family of cyclic peptide antibiotics from Bacillus subtilis. J. Chrom.

811:243-251.

10. Harwood, C. R. 1989. Introduction to biotechnology of Bacillus. En Bacillus. C. R.

Harwood (Ed). Plenum Press. New York, pp :1-4.

11. Heins, S.D., Manker, D. C., Jimenez, D. R., McCoy, R. J., Marrone, P. G. &

Orjala, J. E. 2003. Compositions and methods for controlling plant pests. Patents

United States 20030186852

http://www.freepatentsonline.com/20030186852.html@{patent:20030186852.

12. Hilton, M. D., Alaeddinoglu, N. G. & Demian, A. L. 1988 Synthesis of bacilysin

by Bacillus subtilis branches from prehenate of the aromatic amino acid pathway.

J. Bacteriol. 170 : 482-484

13. Hofemeister, J., Conrad, B., Adler B., Hofmeister, B., Feeshe, J. & Kucheryava,

N. 2004. Genetic analysis of polyketide-like antibiotics iron uptake and biofilm

formation by Bacillus subtillis a 1/3. Mol. Genet. Genomics 272:363-378.

�� 30

��

14. Hubbel, D. H., Morales, V. M. & Umali- Garcia, M. 1978. Pectolytic enzymes in

Rhizobium. Appl. Environ. Microbiol. 35: 210-213

15. Janda, J. M. 1986. Elastolytic activity among Sthaphylococci. J. Clin. Microbiol.

24: 945-946.

16. Katz, E. & Demain, A. L. 1977. The peptide antibiotics of Bacillus: chemistry,

biogenesis, and possible functions. Bacteriol Rev. 41: 449-474

17. Kaur, M., Tripathi, K. K., Gupta, M., Jain, P. K., Bansai, M. R & Gupta, K. G.

1988. Production and partial characterization of elastase of Bacillus subtillis

isolated from the cervices of human females. Can. J. Microbiol. 34: 855-859.

18. Kunst, F., N., Ogasawara, I., Moszer, A. M., Albertini, G., Alloni, V., Azevedo, M.

G., Bertero, P., Bessieres, A., Bolotin, S., Borchert, R., Borriss, L., Boursier, A.,

Brans, M., Braun, S. C., Brignell, S., Bron, S., Brouillet, C. V., Bruschi, B.,

Caldwell, V., Capuano, N. M., Carter, S. K., Choi, J. J., Codani, I. F., Connerton,

A., Cummings, R. A. & Danchin, & otros 136 autores. 1997. The complete

genome sequence of the grampositive bacterium Bacillus subtilis. Nature

390:249-266.

19. Lachica, R. V. F., Genigeorgis, C. & Hoeprich, P.D. 1971. Methacromatic agar-

difussion method for detecting sthaphylococcal nuclease activity. Appl. Microbiol.

21: 585-587.

20. Lee, S.Y., Nakajima, I., Ihara, F., Kinoshita, H. & Nihira, T. 2005. Cultivation of

entomopathogenic fungi for the search of antibacterial compounds.

Mycopathologia 160:321-325.

21. Lovell, J. D. & Bibel, D. 1977. Tween 80 medium for differentiating non

pigmented for Serratia from other enterobacteriaceae. J. Clin Microbiol.

5: 245-247.

22. Nava-Fonseca, M. R. 1995. El perfil de enzimas extracelulares como criterio

coadyuvante en la identificación de Serratia marcescens. Tesis professional, LEM-

ENCB.

�� 31

��

23. O´ Brien, M. & Davis H. G. 1982. Enzymatic profile of Pseudomonas maltophilia.

J. Clin. Microbiol. 16: 417-421.

24. Ozcengiz, G., Alaeddinoglu, G. & Demain, A. 1990. Regulation of biosynthesis of

bacilysin by Bacillus subtilis. Ind.l Microbiol 6:91-100.

25. Peypoux, F., Bonmatin, J. M. & Wallach, J. (1999) Recent trends in the

biochemistry of surfactin. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51:553–563.

26. Poincelot, R. P. & Day, P. R., 1972. Simple dye release assay for determining

cellulolytic activity of fungi. Appl. Microbiol. 23:875-879.

27. Rao, M. B., Tanksale, A. M., Ghatge, M.S., and Deshpande, V.V. 1998. Molecular

and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol. Mol. Biol. Rev.

62: 597-635.

28. Rogers, H. J., Newton, G. G. F. & Abraham, E. P. 1965. Production and

purification of bacilysin. Biochem. J. 97:573-578.

29. Rojas Avelizapa, L. I., Cruz Camarillo, R. Guerrero, M. I. Rodríguez Vazquez, R

& Ibarra, J. E. 1999 Isolation of proteo-chitinolytic strain of Bacillus thuringiensis,

able to grow in shrimp waste media. J. Microbiol. Biotechnol. 15: 261-268.

30. Sánchez Pérez, O. 2000. La quitosana extracelular de Bacillus thuringiensis.

Tesis de Maestría LEM-ENCB.

31. Schallmey, M., Singh A. & Ward, P. O. 2004. Development in the use of Bacillus

species for industrial production. Can. J. Microbiol. 50: 1-17.

32. Schnell, N., Entian, K. D., Schneider, U., Götz, F., Zahner, H., Kellner, R. & Jung

G. 1988. Prepeptide sequence of epidermin, a ribosomally synthesized antibiotic

with four sulphide-rings. Nature 333:276-278.

33. Sjögren, J. & Magnusson J. 2003. Antifungal 3-hidroxy fatty acids from

Lactobacillus plantarum MiLAB14. Appl. Environ. Microbiol. 69:7554-7557.

34. Stein, T. 2005. Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific

functions. Mol. Microbiol. 1:1-13.

�� 32

��

35. Stöver, A. & Driks, A. 1999. Secretion, localization, and antibacterial activity of

TasA, a Bacillus subtilis spore-associated protein. J. Bacteriol. 181:1664-1672.

36. Ström, K., Sjórgen, J., Broberg, A % Schnúrer, J. 2002. Lactobacillus plantarum

MiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo (l-Phe-L-Pro) and

cyclo (L-Phe-trans-4-OH-L-Pro) and 3-phenyllactic acid. Appl. Environ.

Microbiol. 68:4322-4327

37. Tamehiro, N., Okamoto-Hosoya , Y., Okamoto, S., Ubukata, M., Hamada M.,

Naganawa, H., & Ochi, K. 2002. Bacilysocin, a novel phospholipid antibiotic

produced by Bacillus subtilis 168. Antimicrob. Agents Chemother. 46: 315-320

38. Tsuge, K., Ano, T., Hirai, M., Nakamura, Y. & Soda, M. 1999. The genes degQ,

pps, and Ipa-8 (sfp) are responsible for conversion of Bacillus subtilis 168 to

plipastatin production. Antimicrob. Agents Chemother. 43 : 2183-2192.

39. Tsuge, K., Akiyama, T. & Shoda, M. 2001. Cloning sequencing and

characterization of the iturin A operon. J. Bacteriol 183: 6265-6273.

40. Vollenbroich, D., Pauli, G., Özel, M. & Vater, J. 1997. Antimycoplasma properties

and application in cell culture of surfactin, a lipopeptide antibiotic from Bacillus

subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 63:44-49.

41. Wakayama, S., Ishikawa, F. & Oishi, K. 1984. Mycocerein, a novel antifungal

peptide produced by Bacillus cereus. Antimicrobial agents and chemotherapy.

26: 939-940.

42. Westers, H., Dorenbos, R., Maarten van Dijl, J., Kabel, J., Flanagan, T., Devine,

K. M., Jude, F., Séror, S. J., Beekman, A., Darmon, E., Eschevins C., De Jorng,

A., Bron, S., Kuipers, O. P., Albertini, A. M., Antelmann, H., Hecker, M.,

Zamboni, N., Sauer, U., Bruand, C., Ehrlich, D. S., Alonso, J. C., Salas, M., &

Quax W. J. 2003. Genome engineering reveals large dispensable regions in

Bacillus subtilis. Mol. Biol. Evol. 20:2076-2090.

43. Wills, E. W., Redinho, M. R., Perfect, J. R. & Del Poeta, M. 2000. New potential

targets for antifungal. Development emerging therapeutic targets 4: 1-32.

�� 33

��

44. Yu-Shu, H., Huey-Lin, G., Chung-Wu, Y., Scheng, J., Tschen, S., & Tung-Liu, S.

Aminoacids actived by fengycin synthetase Fen E. Biochem. Biophys. Res.

Commun. 292: 789-793.

45. Zheng, G., Yan, L., Vederas, J., & Súber, P. 1999. Genes of the sbo-alb locus of

Bacillus subtilis are required for Production of the antilisterial bacteriocin

subtilosin. Journal of Bacteriol. 181: 7346-7355.

��

��

Documents

Proyecto CGPI 20060807 Estudio del aislado Bacillus …sappi.ipn.mx/cgpi/archivos_anexo/20060807_3296.pdf · Menos probable sería la participación de ... su identidad mediante la