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INSTITUTO TECNOLOGICO DE MAZATLAN
ING. BIOQUIMICA
SEXTO SEMESTRE
MICROBIOLOGIA
M.C. IRMA LORENA SANCHEZ HUMARAN
ATLAS DE PRUEBAS BIOQUIMICAS
EQUIPO 5
Carnero Lerma Tania Ernestina
Carvajal Portillo Jocelyn Pamela
Figueroa Daz Carmen Liliana
Franco Torres Amayrani
Lizarraga Duarte Izamary
Zepeda Mediana Ana Karen
Mazatln Sin., 20 de Marzo del 2015
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CONTENIDO
INTRODUCCIN
...............................................................................................
3
DESARROLLO
...................................................................................................
5
KLIGLER (AGAR DE HIERRO KLIGLER).
..................................................... 5
CITRATO DE SIMMONS
................................................................................
7
AGAR SIM (SULFURO, INDOL, MOTILIDAD)
............................................... 9
T.S.I. AGAR (AGAR HIERRO TRIPLE AZUCAR)
........................................ 12
AGAR MIO (MOTILIDAD INDOL ORNITINA)
............................................... 14
AGAR DE HIERRO LISINA (LIA)
..................................................................
17
CALDO LACTOSADO
..................................................................................
20
CALDO UREA.
.............................................................................................
22
CALDO DEXTROSA
.....................................................................................
25
CALDO MANITOL
........................................................................................
26
ROJO DE METILO/ VOGES PROSKAUER (MR/VP)
................................... 29
MEDIO DE TIOGLICOLATO
.........................................................................
31
CALDO SF (STREPTOCOCCUS FAECALIS)
.............................................. 34
MEDIO DE TRASPORTE DE CARY Y BLAIR
.............................................. 36
AGAR FENILALANINA DESAMINASA
......................................................... 38
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
.................................................................
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ATLAS DE PRUEBAS BIOQUIMICAS
INTRODUCCIN
Existen en el mercado una extensa variedad de medios de
cultivos, ms o
menos complejos, tiles para su empleo en el laboratorio de
microbiologa
clnica (Garca, 1994).
En la naturaleza los microorganismos se encuentran formando
poblaciones
mixtas de una gran variedad de tipos diferentes. Sin embargo, el
desarrollo de
la microbiologa se ha conseguido mediante el estudio de especies
aisladas,
crecidas en medios desprovistos de cualquier otra forma de vida
contaminante
(Bailn et al , 2003).
Los microorganismos necesitan nutrientes apropiados as como
condiciones
ambientales favorables. En primer lugar el medio de cultivo debe
contener
aquellos nutrientes esenciales para el crecimiento de una
determinada especie
(Bailn et al, 2003).
Como la mayor parte de los estudios en el laboratorio se
realizan los cultivos
puros (una sola especie bacteriana), se debe esterilizar el
medio de cultivo y
mantenerlo en condiciones estriles hasta que sea utilizado
(Bailn et al, 2003).
Las bacterias no muestran una gran variedad de aspectos
morfolgicos y por
tanto su identificacin requiere adems de la informacin obtenida
en el estudio
morfolgico, realizar otras determinaciones (fisiologa, comport.
bioqumico,
etc.) (Granada , 2014).
Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos
aplicados a
medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten
identificar
distintos microorganismos presentes (Molina. 2008).
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Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar
la
actividad de una via metablica a partir de un sustrato que se
incorpora en un
medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no
(Molina 2008).
Las pruebas bioqumicas han sido ampliamente utilizadas para
diferenciar
bacterias. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el
microorganismo es
capaz de fermentar azcares, la presencia de enzimas, la
degradacin de
compuestos, la produccin de compuestos coloreados, etc. Aun
bacterias
fuertemente relacionadas pueden separarse en dos especies
diferentes con
base a pruebas bioqumicas.
Por ejemplo, las bacterias entricas gram negativas, forman un
grupo muy
grande y heterogneo cuyo hbitat natural es el tracto
gastrointestinal de
humanos y otros animales. Esta familia, Enterobacteriaceae,
incluye a varios
patgenos que causan sndromes diarreicos. Un gran nmero de
ensayos han
sido desarrollados de manera de identificar rpidamente al
patgeno, para que
posteriormente el mdico, con base al reporte, indique el
tratamiento adecuado,
o para que los epidemilogos puedan localizar la fuente de la
infeccin (Brock y
Madigan 1993).
El caldo es un medio bsico indicado para primocultivos. A partir
de l se
preparan medios slidos (gelatina, agar comn, agar nutritivo);
adicionados de
nutrientes ms ricos se obtiene el caldo nutritivo (Garca,
1994).
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DESARROLLO
KLIGLER (AGAR DE HIERRO KLIGLER).
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona de carne y la triptena,
aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la glucosa
son los
hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el
sustrato
necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el citrato de
hierro y amonio,
es la fuente de iones Fe3+, los cuales se combinan con el cido
sulfhdrico y
producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es
el indicador de
pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. El agar
es el agente
solidificante.
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan
por medio
del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en
medio cido. El
tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que
reacciona luego con
una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de
color negro.
Formula
Peptona de
carne...........................................................................................13.0.
Cloruro de
sodio............................................................................................
5.0.
Lactosa..........................................................................................................10.0.
Triptena........................................................................................................10.0.
Glucosa
........................................................................................................
1.0.
Citrato de hierro y
amonio..............................................................................
0.5.
Tiosulfato de
sodio.........................................................................................
0.3.
Rojo de
fenol...............................................................................................0.025.
Agar...............................................................................................................15.0.
pH final: 7.3 0.2
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Preparacin
Suspender 54.8 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Dejar
reposar 5
minutos. Calentar con agitacin frecuente, hervir 1 o 2 minutos
hasta disolucin
total. Distribuir en tubos, en volumen que ocupe hasta la
tercera parte de los
mismos. Esterilizar en autoclave a 121C por 15 minutos. Enfriar
y dejar
solidificar en posicin inclinada (pico de flauta profundo).
Color del Medio
Medio de cultivo deshidratado: color beige amarillento,
homogneo, libre
deslizamiento.
Medio de cultivo preparado: color rojo.
Almacenamiento
Medio de cultivo deshidratado a 10-35 C.
Medio de cultivo preparado a 2-8 C.
Procedimiento
Siembra
A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, con
aguja de
inoculacin inocular el medio de cultivo, picando el fondo y
extendiendo sobre
la superficie del mismo.
Incubacin
En aerobiosis, a 35-37C durante 18 a 24 horas.
Interpretacin de los resultados
Observar el color del medio de cultivo y la produccin de
gas.
1- Superficie alcalina/profundidad cida (pico rojo/fondo
amarillo): el
microorganismo solamente fermenta la glucosa.
2- Superficie cida/Profundidad cida (pico amarillo/fondo
amarillo): el
microorganismo fermenta glucosa, y lactosa.
3- Superficie alcalina/Profundidad alcalina (pico rojo/fondo
rojo): el
microorganismo es no fermentador de azcares.
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4- La presencia de burbujas o la ruptura del medio de cultivo
indican que el
microorganismo produce gas.
5- El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo
produce cido
sulfhdrico.
CITRATO DE SIMMONS
Fundamento
Esta prueba nos permite diferenciar un grupo de bacterias que
son capaces de
crecer con citrato como nica fuente de carbono y sales amnicas
inorgnicas
como nica fuente de nitrgeno, provocando la alcalinizacin del
medio.
El medio a utilizar es agar Citrato de Simmons, que contiene
citrato de sodio,
fosfato de amonio y azul de bromotimol como indicador de pH.
Slo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrn
multiplicarse en
este medio y liberarn iones amonio lo que, junto con el
metabolismo del
citrato, generar una fuerte basificacin del medio que ser
aparente por un
cambio de color del mismo de verde a azul.
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Frmula (en gramos por litro)
Citrato de
sodio................................................................................................2.0
Cloruro de
sodio...............................................................................................5.0
Fosfato
dipotsico...........................................................................................
1.0
Fosfato
monoamnico....................................................................................
1.0
Sulfato de
magnesio......................................................................................
0.2
Azul de
bromotimol........................................................................................0.08
Agar...............................................................................................................15.0
pH final: 6.9 0.2
Preparacin
Suspender 24,2 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Dejar
reposar 5
minutos. Calentar con agitacin frecuente y llevar a ebullicin
durante 1 o 2
minutos para disolucin total. Distribuir en tubos y esterilizar
en autoclave a
121C durante 15 minutos. Enfriar y solidificar en posicin
inclinada (pico de
flauta).
Color del Medio
Medio de cultivo deshidratado: color amarillo-verdoso, homogneo,
libre
deslizamiento.
Medio de cultivo preparado: color verde.
Almacenamiento
Medio de cultivo deshidratado a 10-35 C.
Medio de cultivo preparado a 2-8 C.
Procedimiento
Siembra
Estriar la superficie del medio de cultivo.
Incubacin
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En aerobiosis, a 35-37 C durante 24-72 horas.
Algunos microorganismos pueden requerir hasta 7 das de
incubacin.
Interpretacin de los resultados
- Positivo: crecimiento bacteriano con un intenso color azul en
el pico de flauta.
- Negativo: ausencia de crecimiento y permanencia del color
verde del medio
de cultivo.
AGAR SIM (SULFURO, INDOL, MOTILIDAD)
Fundamento
Medio de cultivo en el cual la triptena y la peptona aportan
nutrientes para el
desarrollo microbiano. El triptfano es un aminocido
constituyente de muchas
peptonas y particularmente de la triptena y puede ser
metabolizado por
algunas bacterias para formar indol.
En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas
triptofanasa. El indol
producido se combina con el aldehido del reactivo de Ehrlich
(Indol Reactivo
REF B1550361) o de Kovacs, para originar un compuesto de color
rojo.
A partir del tiosulfato de sodio los microorganismos pueden
generar cido
sulfhdrico que reacciona con el hierro presente formndose un
compuesto de
color negro.
