Pruebas de Susceptibilidad a Antimicrobianos

Lic. Gertrudis HornaDocente Auxiliar – ETM UPCH

INDICE

• Introducción• Prueba de sensibilidad por Disco Difusión• Concentración Mínima Inhibitoria• Concentración Mínima Bactericida

INTRODUCCION

• El método más común para evaluar susceptibilidad antimicrobiana es el de difusión en agar.

• MO de crecimiento rápido• Algunos de crecimiento fastidioso.• Metodología estandarizada• Correlación con CIM• Estandarizado según CLSI (NCCLS)

Método de Disco Difusión

• Medio a utilizar• Preparación del agar Mueller Hinton• Preparación de la suspensión• Inoculación de la placa• Colocación de los discos• Incubación• Lectura• Interpretación de los halos obtenidos

¿POR QUÉ EL MEDIO BASE ES RECOMENDADO ?

• Medio de Mueller Hinton• Reproducibilidad aceptable.

– Baja concentración de inhibidores• sulfonamidas, trimetoprim y tetraciclina.

– Crecimiento satisfactorio de patógenos no fastidiosos.

– Existe gran experiencia en estudios de susceptibilidad.

• Sólo para bacterias (aerobias o facultativas) no fastidiosas.

Preparación del medio Mueller Hinton

• Agar base deshidratado• Post autoclavado enfríe a 45-50° C.• Vierta a placa en superficie horizontal 4 mm de

profundidad.• Volumen:

– 60-70 ml para placas de 150 mm– 25-30 ml para placas de 100 mm.

• Enfríe a T° ambiente• Almacene en refrigeración (4-8 ºC).• Control de esterilidad y calidad.

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA

POR DISCO DIFUSION

1. Composición del agar 2. Profundidad del agar 3. Densidad del inóculo4. Concentración del antimicrobiano en el disco5. Características del crecimiento6. Tiempo de aplicación de los discos

7. Temperatura de incubación8. Tiempo de incubación9. pH10. Concentración de timina / timidina11. Concentración de cationes bivalentes12. Medida de la zona de inhibición

Efecto del pH

• Rango de pH: 7,2 a 7,4• pH ácido:

– Pierden potencia los aminoglucósidos y macrólidos.

– Aumenta la actividad de penicilinas.• pH alcalino

– Efectos son opuestos.

Efecto de Timinas o Timidinas• Exceso de timidina

– Falsa resistencia a sulfonamidas y trimetoprim.

– Evaluar cada lote nuevo de agar MH• Enterococcus faecalis ATCC 29212 /

33186 y (SXT).• Halo de inhibición para SXT

–> 20 mm: satisfactorio.–< 20 mm : falsa resistencia

Variación de cationes divalentes

• Variación de Ca++ y Mg++– Aminoglucósidos y tetraciclinas en

Pseudomonas aeruginosa.– Contenido excesivo falsa resistencia.– Contenido bajo falsa sensibilidad

Profundidad del Agar

• 4 mm• Variabilidad de 3 a 5 mm.• Profundidad < 3 mm da

lecturas falsamente susceptibles.

• Profundidad > 5 mm genera lecturas falsamente resistentes.

Estándar de turbidez 0,5 de Mc Farland

• TURBIDEZ 0.5 DE LA ESCALA DE MAC FARLAND

• - 0.5 ml Cl2Ba 0.048M (BaCl2.2H2O AL 1.176% P/V)

• - 99.5 ML H2SO4 0.18 M (0.36N) 1% V/V

• A= 0.08 - 0.1 (625 nm)

• CONSERVACION: OSCURIDAD, TEMP AMBIENTE

• VERIFICAR LA TURBIDEZ MENSUALMENTE.

Preparación del inóculo

• Tome 3 a 5 colonias de igual morfología y emulsione en 4 a 5 ml de caldo tripticasa soya.

• Ajuste la turbidez con solución salina (NaCl 0,85 %) estéril a McF 0,5

• Luz adecuada• Tarjeta blanca con líneas negras de contraste.

Inoculación en las placas

• Dentro de 15 minutos de hecho el ajuste de la turbidez.

• Con hisopo de algodón en tres direcciones

• Inocule toda la placa (giros de 60°).

• Deje impregnar durante no más de 15 min.

• No utilice inóculos no estandarizados.

Aplicación de los discos de sensibilidad

• Cantidad: – 12 unidades en placas de

150 mm– 6 unidades en placas de

100 mm. • Separación:

– 24 mm (del centro de un sensidisco al otro más cercano).

• Difusión del fármaco es instantánea: no reubicar los discos después de haberlos depositado en la superficie del agar.

Interpretación de Resultados

Métodos de Dilución Macrodilución en caldoSistemas Autamatizados: Microdilución en caldoDilución en agarE test

• Metodología– Realizar serie de diluciones del antimicrobiano– Caldo o agar– Inoculación con una suspensión estandarizada– Incubación – Lectura

Preparación de la Solución Stock

• Peso (mg)= volumen (mL) X Concentración (ug/mL)Potencia antimic. (ug/mg)

• Volumen (mL) = peso (mg) X Potencia antimic.(ug/mg)Concentración (ug/mL)

8ug/ml 4ug/ml 2ug/ml 1ug/ml 0.5ug/ml0.25ug/ml 0.125ug/ml 0.065ug/ml 0.03125ug/ml0.0156ug/ml 0.0078ug/ml 0.0039ug/ml

M. I. C. = 0.03125 ug/ml

C. M. B. = 0.5 ug/ml

1.5X108ufc/ml

Incubar a 37° por 24 horas

Sembrar en placas

CONCENTRACIÓN MINIMA INHIBITORIA Y

CONCENTRACION MINIMA BACTERICIDA

MIC / CMB

0.5 1 2 4 8 16 32 64 C

Bacteria: Escherichia coliAntibiótico: Ampicilina

CIM 2 µg/mLCBM 16 µg/mL

MICRODILUCION EN CALDO / E- TEST

0.01 0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32