PRUEBAS DIAGNÓSTICAS EN VIH/SIDA- parte 3

CARLOS ALVAREZ. MD.DTMH

Otras pruebas…

• Saliva: • OraSure:

– S: 99.24%– E: 99.89%

• Orina– Calypte– S: 99% – E: 94%

GUIA PARA EL MANEJO DE VIH / SIDABasada en la Evidencia

COLOMBIA

2006

•Diagnóstico en embarazo:– Ofrecimiento y realización de la prueba

recomendada con consentimiento para aceptación o rechazo.

– Indicaciones de repetición en tercer trimestre.– Uso de pruebas rápidas– Recomendaciones de interpretación

GUIA PARA EL MANEJO DE VIH / SIDABasada en la Evidencia

COLOMBIA

2006

•Detección en el Hijo de Mujer Infectada :– Indicaciones de carga viral.– Flujograma de diagnóstico con pruebas de

detección de ácidos nucleicos e interpretación.

GUIA PARA EL MANEJO DE VIH / SIDARecomendaciones Prueba de genotipificación

• No ordene pruebas de genotipificación en pacientes con problemas activos de incumplimiento, intolerancia, o inconsistencia en la toma de medicamentos (III A).

• Siempre confirme fracaso virológico y carga viral mayor a 1000 copias antes de ordenar una prueba de genotipificación (II A).

• La prueba de genotipificación debe realizarse en pacientes que se presentan con un segundo o tercer fracaso terapéutico previa autorización de experto en enfermedades infecciosas o VIH-SIDA (I B).

GUIA PARA EL MANEJO DE VIH / SIDARecomendaciones Prueba de genotipificación

• La prueba de genotipificación debe interpretarse con la participación de un experto en enfermedades infecciosas o en VIH-SIDA (I B).

• La conducta que se derive de la información de las pruebas de genotipificacion debe ser siempre supervisada por un experto en enfermedades infecciosas o en VIH-SIDA (IIIA).

• El paciente debe estar consumiendo el régimen que fracasa en el momento en que se le toma la muestra para la prueba de genotipificación o dentro de las dos a cuatro semanas posteriores a su suspensión (II B).

Mutaciones relacionadas con la resistencia a las drogas antiretrovirales

L10I K20M D30N M36I M46I G48V I54V V82A I84V N88D L90M

Saquinavir

Indinavir

Nelfinavir

Ritonavir

Amprenavir

Mutaciones primarias Mutaciones secundarias Polimorfismos

Inhibidores de la Proteasa

www.hiv-web.lanl.gov

Genotipo: predicción de resistencia

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76

SI

NOTodos los virus con L90Mdeberían tener resistenciauniforme a saquinavir M

agn

itu

d d

e re

sist

enci

a a

dro

gas

HIV obtenidos de 78 pacientes

Fenotipo: medida directa de resistencia

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76

HIV obtenidos de 78 pacientes

Mag

nit

ud

de

resi

sten

cia

a d

rog

as

1,000

100

10

1

0

Fenotipo: medida directa de resistencia

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76

HIV obtenidos de 78 pacientes

Mag

nit

ud

de

resi

sten

cia

a d

rog

as

1,000

100

10

1

0

Punto de cortede sensibilidad

40% de virus con L90M permanecen

sensibles a saquinavir

Ensayo Fenotípico: ANTIVIROGRAM

PACIENTE

PLASMA(> 200 µl)

RNA cDNAPR/RT GENES

(amplicones)

Aislamiento del gen PR/RT

extración RT PCR

Plásmido con genoma VIH (excep PR/RT)

Virus WT

PRORT

Delección PRO& RTgenes

Clon proviral deleccionado

Susceptibilidad del ensayo

Transfección del gen (Electropor)

(MT4)

VR

SUSCEPTIBILIDAD

Sensible: IC50 4< Cepa Ref

Parc.Res:IC50 4-10 > Cep.Ref

Resistente: IC50 +10> Cep.Ref

MÉTODOS GENOTÍPICOS: Secuenciación

Plasma Extracción RNA viral

RT-PCR

cDNA

Amplicones

Cebador marcado para replicación

Cadena a secuenciar

4 mezclas de reacción que incluye cada uno de los diferentes ddNTP

que paran la replicación

Productos de la reacción de replicación

Separación de productos por electroforesis

Electroferograma

Algoritmos

• Trugene HIV-1 Report Generator (Visible Genetics).• Retrogram Software v 1.2 (Viroloy Networks) • ANRS AC11 v 2.000 • Detroit Medical Center, Grupo de Aconselhamento Virológico, CHL

V3.2, Rega v 5.0 (estos 5 accesibles a través de la empresa Advanced Biological Laboratories, SA)

• Resistance Collaborative Group, Stanford University HIV Database (estos 2 accesibles a través de Beta Test HIV Algorithm Comparison, Stanford University)

• ADRA (Los Alamos Resistance Database)• Geno2phenosense(Arevir, Analyse Von Resistenzmutatione bei HIV).

VirtualPhenotype® - Cómo funciona

Informacióngenotípica

Informaciónfenotípica

Información de VirtualPhenotype (media del fenotipo)

> 85.000 > 45.000

>35.000 muestras comprobadas

Secuencia(pregunta a la base de

datos)

RESISTANCE ANALYSIS

vircoTYPE REPORT

vircoTYPE page 1

Page 2: Details

Informe deInforme de Virtual VirtualPhenotypePhenotype®®

Fármaco

Nombre comercial Nombre genérico

Pares en base de datos

Proporción de muestras iguales:

En rango normal de susceptibilidad 2

Por encima de rango normal de susceptibilidad 2

Por encima de rango normal de susceptibilidad, pero por debajo de valor clínico de corte 2, 3, 4

Zidovudina

Lamivudina

Didanosina

Zalcitabina

Estavudina

Abacavir

Tenofovir DF

Nevirapina

Delavirdina

Efavirenz

Un componente de Kaletra®

Veces de cambio en la IC50

(corte para el rango normal de susceptibilidad)

¿Qué es mejor?¿Qué es mejor?

FFenotipo realenotipo real:: - Prueba real- Prueba real- Alta variabilidad intraprueba- Alta variabilidad intrapruebaCosto !!Costo !!

GenotipoGenotipo:: - Interpretación compleja- Interpretación compleja

Fenotipo virtualFenotipo virtual:: - Medida de probabilidad estadística- Medida de probabilidad estadística- Mayor precisión- Mayor precisión- Problema en la definición de veces - Problema en la definición de veces significativas: biológicos y clínicos significativas: biológicos y clínicos

Mutaciones relacionadas con la resistencia a las drogas antiretrovirales

www.iasusa.org

www.iasusa.org

www.iasusa.org

www.iasusa.org