�Pruebas para el diagnóstico microbiológico de las

Enfermedades Infecciosas empleadas en la práctica clínica (I)

Dr. Juan Carlos Rodríguez

S. Microbiología

Hospital General Universitario de Elche

E-mail: royo_glo@gva.es

http://blogmicrobiologiahgue.wordpress.com/

Diagnóstico microbiológico�Pretende detectar e identificar el o los microorganismos responsables del proceso infeccioso y eso es esencial para:• Correcto tratamiento del paciente• Control de la difusión del patógeno

Diagnóstico microbiológico�Métodos directos:

• Detectan al microorganismo de la muestra clínica obtenida del lugar de la infección:

• Examen microscópico• Cultivo• Detección de antígenos• Detección de ácidos nucléicos

�Métodos indirectos: • Permiten detectar la presencia de anticuerpos frente al microorganismo en el suero del paciente

� No se aplican simultanéamente sino en función del microorganismo

Toma de muestras

� La toma de muestras se detallará en un seminario monográfico

� Puedes acceder al manual de toma de muestras en el enlace:

http://blogmicrobiologiahgue.wordpress.com/docencia/practicas-diagnostico-microbiologico-enfermedades-infecciosas-dmi/manual-muestras-microbiologia/

Diagnóstico de bacterias: Examen microscópico� La muestra clínica se deposita en un portaobjetos

� Puede visualizarse:• Sin teñir (en fresco)• Tras un proceso de tinción

• Gram: Divide a las bacterias en:• Gram positivos: Color violeta (Staphylococcus)• Gram negativos: Color rojo (Escherichia coli)

• Ziehl Neelsen: Divide a las bacterias en• Acido-alcohol resistentes: Color rosa (Mycobacterium

tuberculosis)

Examen microscópico en fresco

Trichomonas vaginalis Candida albicans

Examen microscópico: tinciones

Ziehl Neelsen positivo

Gram positivo

Gram negativo

Diagnóstico de bacterias: cultivo� Siembra de la muestra en unos medios de cultivo

con los nutrientes necesarios para que se produzca la proliferación bacteriana.

� Sus principales utilidades son:• Más sensibilidad que la tinción• Permite identificar a los microorganismos• Permite estudiar su sensibilidad antibiótica• Permite estudiar la epidemiología de la infección y el control de posibles brotes

Características del cultivo� Se utilizan diferentes tipos de medios:

�Medios básicos: Agar Mueller Hinton�Medios enriquecidos:• AgarSangre: Streptococcus pneumoniae• AgarChocolate(Hemina y NAD) : Haemophilus• BCYEα (L-cisteina): Legionella

• Medios selectivos: • Medio Thayer Martin: Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae

• Mac Conkey: Bacterias Gram negativas

• TCBS: Vibrio cholerae

• Medios diferenciales o cromógenos: CHROMAgar• Medios de enriquecimiento: • Caldo selenito

Tipos de medios de cultivo

Agar sangre

Hemocultivos Agar chocolate

TCBS

Procesamiento de los cultivos� Temperatura de incubación:

• Habitualmente se incuba a 35-37ºC• Campylobacter en heces: 42ºC

� Tiempo de incubación� El tiempo habitual es 24-48 h� Hay bacterias de crecimiento lento: Brucella

� Atmósferas de incubación� Bacterias aerobias o anaerobias facultativas: Escherichia coli,

Staphylococcus aureus.� Bacterias anaerobias: Clostridium, Bacteroides� Bacterias microaerófilas: Campylobacter, Helicobacter� Necesitan 5-10% CO2: Neisseria gonorroheae

Incubación de los medios

Incubador de hemocultivos

Atmósfera de incubación

Identificación bacteriana

� Definición: • Se basa en el estudio de la actividad bioquímica, sensibilidad a determinadas sustancias y crecimiento en presencia o ausencia de oxígeno

�Métodos: • Pruebas bioquímicas clásicas• Pruebas en microplaca

Identificación bacteriana

Detección de antígenos

� Definición: • Permite demostrar la presencia de un microorganismo en una muestra clínica a través de la detección de sus antígenos específicos

� Patógenos en los que se utiliza: • Legionella• Streptococcus pneumoniae• Aspergillus• Cryptococcus

Secuenciación del gen 16S rRNA e ITS

� Definición: • Estos dos genes están presentes en todas las bacterias (16S rRNA) y hongos (ITS) pero su secuencia es diferente en función de la especie

� Procedimiento: • Secuenciación de estos genes y comparación con bases de datos internacionales (Gen Bank u otros)

• Útil para identificar microorganismos con identificación clásica compleja

Secuenciación del gen 16S rRNA e ITS

Espectrometría de masas (malditof)Definición:

• Estudia el perfil proteico del microorganismo (proteoma) mediante la comparación del perfil con una base de datos de los microrganismos más frecuentemente aislados

• Un rayo laser ioniza las proteinas cristalizadas y son aceleradas por un campo electromagnético.

• Las proteinas se separan en función del tamaño y la carga

� Utilidad: • Identificación rápida de los microorganismos más habituales

Espectrometría de masas (malditof)

Diagnóstico de la infección urinaria

�Muestras:

• Muestra: Frasco estéril con orina recién recogida o mantenida a 4ºC

• Adultos: Segunda parte de la micción tras limpieza de los genitales externos

• Pacientes sondados: Pinchar la sonda con jeringa en el lugar establecido para ello

• Niños pequeños: Bolsa colectora que debe retirarse cada 30 minutos

Diagnóstico de la infección urinaria

�Métodos diagnósticos:

• Sedimento urinario

• Sistemas de cribado rápido: • Tiras reactivas• Citometría de flujo

• Cultivo cuantitativo de las muestras

Diagnóstico de la infección urinaria

�Métodos diagnósticos:

• Cultivo: • La orina se siembra de forma cuantitativa en agar CLED (número de microorganismos/mililitro de orina)

• Agar sangre: Medio enriquecido para el aislamiento de los patógenos más frecuentes

• Agar CLED y Agar Mac Conkey: Medio diferencial que ayuda a la identificación preliminar

Diagnóstico de la infección urinaria

� Interpretación del recuento en el cultivo: • Debe hacerse en función de:

• Forma de recogida de la muestra• Clínica del paciente• Presencia de piuria• Microorganismo aislado

• En muestras tras punción suprapúbica o directamente del riñón: Cualquier recuento es significativo

• Sondaje vesical: 103 bacterias/mililitro• Bacteriuria con piuria: 103 bacterias/mililitro• Bacteriuria asintomática: 105 bacterias/mililitro

Diagnóstico de la infección urinaria

Medios de cultivo

Diagnóstico de la infección urinaria

Sedimento urinario

Tiras reactivas

Citometría de flujo

Diagnóstico de la neumonía bacteriana

• Definición: Infección del parénquima pulmonar• Tienen etiología muy variada en función de la edad, del estado inmunológicos y de otros factores

• En personas previamente sanas es frecuente:• Streptococcus pneumoniae• Micoplasma pneumoniae

• En personas con factores predisponentes• Pseudomonas aeruginosa• Staphylococcus aureus• Enterobacterias

Diagnóstico de la neumonía bacteriana

� Cultivo: • Muestra de esputo de buena calidad (Tinción de Gram con

presencia de leucocitos) o muestras invasivas (BAS, BAL, cepillado bronquial)

• Cultivo en:• Agar sangre. Aislamiento de Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis

• Agar Mac Conkey: Enterobacterias, Pseudomonas y Acinetobacter

• Agar chocolate:Haemophilus influenzae• Medio BCYEα: Legionella pneumophila.• BAL y Cepillado bronquial se hace cultivo cuantitativo en

Agar chocolate

Diagnóstico de la neumonía� Detección de antígenos:

�Muestra a procesar:

�Muestras respiratorias:

�Virus respiratorio sincitial

�Gripe A, gripe B

�Pneumocystis carinii

�Aspergillus

�Orina:

�Streptococcus pneumoniae

�Legionella pneumophila

Diagnóstico de la neumonía� Detección de anticuerpos:

� Muestra a procesar:�Suero del paciente

� Estudios a realizar:�Detección de IgM�Estudio de seroconversión: Incremento de la cantidad de anticuerpos (al menos 4 veces) al estudiar dos sueros del enfermo separados 3-4 semanas�De positivo bajo a positivo alto: Ej: De 1/16 a 1/512

�De negativo a positivo alto� Microorganismos: Micoplasma pneumoniae, Legionella

pneumophila, Coxiella burnetti, Chlamydophila pneumoniae

Diagnóstico de la neumonía� Reacción en cadena de la polimerasa (PCR):

� Muestra a procesar:�Muestras respiratorias

� Estudios a realizar:�Detección del genoma del microorganismo en la muestra

� Microorganismos: �Hay sistemas de PCR múltiple que detectan muchos patógenos

�Mycobacterium tuberculosis�Gripe�Citomegalovirus

Diagnóstico de la neumonía bacteriana

Streptococcus pneumoniae Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae

Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central

� Procesos más frecuentes:�Meningitis/encefalitis�Abscesos cerebrales

� La etiología de las meningitis/encefalitis puede ser muy variada:�Bacterias: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae

�Virus: Enterovirus, virus herpes 1 y 2, arbovirus�Hongos: Cryptococcus neoformans�Parásitos: Amebas de vida libre

Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central

� Diagnóstico de las infecciones bacterianas:• Tinción de Gram del LCR:

• Método rápido y orientativo de la etiología• Cultivo del LCR:

• Confirmación de la tinción y estudio de la sensibilidad antibiótica

• Agar sangre, chocolate y Thayer Martin (incubación en CO2)

• Detección de antígenos en el LCR: Streptococcus pneumoniae

• Reacción en cadena de la polimerasa: S. pneumoniae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis

• HEMOCULTIVO

Diagnóstico de la meningitis bacteriana

Listeria monocytogenes

Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis

Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital

� Diagnóstico de Treponema pallidum (sífilis)• Sífilis primaria: Observación del Treponema pallidum (chancro):IFD ,tinción con plata ,Campo oscuro

• Diagnóstico serológico:• Pruebas no treponémicas: RPR y VDRL• Pruebas treponómicas: TPHA (aglutinación) , FTA (inmunofluorescencia), ELISA IgG e IgM

• Criterios:• Todos los resultados positivos de pruebas no treponémicas deben ser confirmados por pruebas treponémicas

• En caso de sospecha de sífilis primaria o terciaria, hay que hacer siempre una prueba treponémica

Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital

� Diagnóstico de Neisseria gonorrhoeae (gonorrea)• Cultivo en agar Thayer Martin • Tinción de Gram: en el hombre la presencia de diplococos gramnegativos es diagnostica (95%)

• Exige transporte rápido al laboratorio e incubación en atmósfera con CO2

• Detección de genoma del microorganismo por PCR

• Diagnóstico de Chlamydia trachomatis (uretritis no gonocócica)

• Sólo puede cultivarse en cultivos celulares y no se hace habitualmente

• Detección de genoma del microorganismo por PCR

Diagnóstico de las enteritis bacterianas

� Salmonella� Cultivo en medio SS y enriquecimiento en caldo selenito� Identificación fenotípica y serotipificación: Múltiples

serotipos� Campylobacter

� Cultivo en medios especificos (Skirrow): Incuba a 42ºC en atmósfera microaerófila

� Shigella. Cultivo en medios específicos (Mc Conkey y SS)� Yersinia: Cultivo en medios específicos (CIN)� Escherichia coli enteropatógenos: Detección del genoma

de los serotipos patógenos por PCR� Vibrio cholerae (TCBS y enriquecimiento)

Diagnóstico de bacteriemia• Presencia de bacterias en sangre de forma persistente

• Antes del tratamiento antimicrobiano se inoculan, con sangre del paciente sin anticuagulante 2 o 3 parejas de botellas de hemocultivos (aerobias y anaerobias)

• Es muy importante descontaminar la piel ante de las extracciones de sangre para prevenir la contaminación de los frascos con flora bacteriana de la piel

• Los hemocultivos se incuban a 37ºC en sistemas automáticos que detectan crecimiento microbiano.

• En caso de positividad : Tinción Gram (cuyo resultado se informa de inmediato ) y subcultivo a medios sólidos.

Diagnóstico de bacteriemia